基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討靈芝的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

覃君良， 蘇志恒

免疫是機(jī)體自身的防御機(jī)制，當(dāng)免疫功能下降時，機(jī)體容易受到致病因子的侵襲。中醫(yī)認(rèn)為，人體的免疫功能類似于中醫(yī)學(xué)的“正氣”[1]?！罢龤鈨?nèi)存，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，即虛熱、虛寒證表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)功能低下，所以“扶正”可通過提高機(jī)體免疫能力[2]。中醫(yī)藥治療因免疫功能低下引起的疾病有著悠久的歷史，能多層次、多途徑、多靶點地發(fā)揮作用，提高機(jī)體免疫力以防治疾病[3]。靈芝是真菌門擔(dān)子菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬真菌的干燥子實體。《神農(nóng)本草經(jīng)》將靈芝列為有效無毒的“上藥”?！吨腥A人民共和國藥典》2000年收載靈芝，并在2020年版中規(guī)定赤芝或紫芝的干燥子實體為靈芝的正品，且明確靈芝質(zhì)量控制的指標(biāo)主要為靈芝多糖。靈芝具有補(bǔ)中益氣、扶正固本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的功效[4]，體現(xiàn)了中醫(yī)藥“整體觀”的治療思路。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)研究的不斷深入，中藥調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用機(jī)制得到了更加廣泛的重視和更深入的認(rèn)識?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，靈芝中含有化學(xué)成分200多種，目前研究比較廣泛是多糖、三萜類、肽聚糖等[5]。靈芝不僅能增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫，對特異性免疫也有一定的作用效果[6]，但其潛在的作用機(jī)制還未得到詳細(xì)的闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念由Hopkins[7]于2007年第一次提出，旨在應(yīng)用組學(xué)分析、高通量篩選、可視化網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)分析等多種技術(shù)，整體、系統(tǒng)、全面地研究藥物小分子和疾病之間的關(guān)系，揭示“藥物-靶點-疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。鑒此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對靈芝的有效成分、治療靶點、信號通路進(jìn)行分析，為后續(xù)臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1靈芝活性成分及靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為有效成分的篩選條件，以“靈芝”為關(guān)鍵詞，查詢并篩選該數(shù)據(jù)庫中所包含的靈芝有效活性成分。數(shù)據(jù)庫資料搜索時間截至2021年10月。應(yīng)用Pub-Chem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找篩選得到的活性成分的SMILES格式并保存。活性成分的作用靶點通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)以SMILES文件為模板進(jìn)行靶點預(yù)測，導(dǎo)出結(jié)果并保存。把Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測的結(jié)果中可能性>0.1的靶點與TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到的靶點整合，并去除重復(fù)靶點，應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)把預(yù)測得到的靶點名稱統(tǒng)一校正為官方名稱，獲取最終預(yù)測的活性成分潛在靶點信息。

1.2免疫調(diào)控相關(guān)靶點篩選 以“immunity”“immune”“immuno”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、OMIM(https://omim.org)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、TDD(http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫篩選免疫調(diào)控相關(guān)靶點，并限定物種為人類。將上述5個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果合并，去除重復(fù)靶點，并將靶點基因?qū)險niprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化整理，最終獲得免疫相關(guān)的靶點。

1.3藥物-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖繪制 通過在線畫圖工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)構(gòu)建成分潛在靶點與免疫相關(guān)疾病靶點的韋恩圖，分析活性成分與免疫調(diào)控的共有靶點，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0軟件中繪制藥物-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4核心蛋白的收集 將靈芝和免疫共有靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)，限定物種為人類，獲取蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，篩選結(jié)合率評分≥0.9的作用靶點蛋白，并導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，計算拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，包括度、介度和緊密度。

1.5基因的富集分析 以度、介度和緊密度≥中位數(shù)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將篩選得到的核心蛋白應(yīng)用R軟件對獲得的基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。

1.6活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接驗證 在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載靈芝活性成分結(jié)構(gòu)mol2格式，作為小分子化合物庫。在PDB數(shù)據(jù)庫中下載重要潛在靶點蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)pdb格式，作為受體庫。用SYBYL-X2.0軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1靈芝的靶點 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到靈芝242個活性成分，經(jīng)過OB和DL參數(shù)初步篩選后共獲得61個活性成分，剔除18個未查詢到靶點的活性成分，最終獲得43個活性成分，見表1。將TCMSP和Swiss Target Prediction兩個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行整合，刪掉重復(fù)，得到43種活性成分的499個潛在靶點。

表1 靈芝中的活性成分

續(xù)表1

2.2免疫相關(guān)靶點 將GeneCards、DrugBank、OMIM、PharmGKB、TDD 5個數(shù)據(jù)庫對免疫靶點的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行整合去重，得到靶點12 454個，將免疫相關(guān)基因與藥物靶點基因映射篩選出共同靶點483個，確定為靈芝調(diào)節(jié)免疫的靶點基因。見圖1。

圖1 免疫靶點與藥物靶點韋恩圖

2.3藥物-活性成分-作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖 應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件對靈芝調(diào)控免疫的483個潛在靶點構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2。其中，度值排名靠前的活性成分有赤芝醛B(度值=100)、環(huán)氧靈芝醇B(度值=100)、甲基靈芝酸DM(度值=100)和(+)-丹芝酸甲酯A(度值=100)。

共有525個節(jié)點，構(gòu)成2 604條相互作用關(guān)系

2.4核心蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的483個共同靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共有353個節(jié)點，2 693條邊。見圖3。度值排名前10的核心靶點見表2。

表2 度值排名前10的核心靶點

每個節(jié)點(node)代表1個靶點，邊(edge)代表靶點之間存在相互作用關(guān)系。根據(jù)度值(degree)的大小設(shè)置節(jié)點大小；綜合分?jǐn)?shù)(combined score)越大，邊線顏色越粗且越深

2.5GO富集與KEGG富集分析 GO分析包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)，共富集到1 512個BP，包括脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)、肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾等；147個MF，包括磷酸二酯水解酶活性、二十醛受體活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等；74個CC，包括突觸前膜、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體/轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)、小凹等。排名前10位GO分析結(jié)果見圖4。KEGG通路富集到166條通路，前10位KEGG通路主要包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP信號通路、蛋白多糖與癌癥、乙型肝炎病毒、鞘脂代謝通路等。見圖5。

圖4 GO富集分析結(jié)果圖

注：AGE-RAGE：晚期糖基化終產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products)；TRP：瞬時受體電位(transient receptor potential)

2.6分子對接結(jié)果 選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前2的核心靶點類固醇受體輔助活化因子(steroid receptor coactivator,SRC)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)與相應(yīng)核心活性成分進(jìn)行分子對接，對接所需的受體文件從PDB數(shù)據(jù)庫獲得[靶點SRC(PDB ID：1O43)、MAPK1(PDB ID：6SLG)]，所有受體文件均做刪除原配體、水分子及加氫加電荷處理，配體分子為靈芝活性成分。使用SYBYL-X2.0中Surflex-Dock模塊對接，結(jié)果顯示免疫靶點蛋白SRC、MAPK1與所對應(yīng)的活性分子具有一定的結(jié)合活性。見表3。(+)-丹芝酸甲酯A與SRC，赤芝酸甲酯F與MAPK1的分子對接可視化結(jié)果見圖6。

表3 活性成分與受體蛋白的分子對接得分

圖6 活性成分與受體蛋白的分子對接可視化結(jié)果圖

3 討論

3.1靈芝具有廣泛的藥理活性，目前已有許多產(chǎn)品被批準(zhǔn)作為藥物和保健食品上市，用于防病治病和養(yǎng)生保健[8]。與西藥相比，靈芝作為中藥材其化學(xué)成分更復(fù)雜，作用機(jī)制也尚未得以闡明。本研究應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫資料進(jìn)行分析，結(jié)果顯示靈芝的潛在活性成分有43個，包括三萜類(34個)、甾醇類(8個)、萜醇類(1個)。有研究發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜類化合物具有增強(qiáng)免疫的功效[9]，其機(jī)制可能與促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化[10]、直接刺激樹突狀細(xì)胞增殖[11]和抑制單核/巨噬細(xì)胞的吞噬功能[12]有關(guān)。此外，靈芝三萜還可以通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群分化改善鼻咽癌小鼠的免疫功能[13]，通過抑制一氧化氮生成對小鼠的免疫性肝損傷起到保護(hù)作用[14]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，靈芝三帖類化合物中的靈芝酸也顯示出良好的免疫調(diào)節(jié)作用[15]；通過下調(diào)細(xì)胞因子分泌，降低肝組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，進(jìn)而減少免疫性肝損傷[16]。Wu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子油在小鼠體內(nèi)具有免疫增強(qiáng)特性，而田丹妮[18]認(rèn)為，含量豐富的靈芝三萜類化合物是靈芝孢子油發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要原因之一。此外，靈芝中的其他成分也具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，如靈芝多糖[19]、靈芝蛋白[20]等。

3.2本研究PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，靈芝調(diào)控免疫的關(guān)鍵靶點主要涉及SRC基因、MAPK1、腫瘤蛋白53(tumor protein 53,TP53)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)等。其中，SRC激酶為SRC家族激酶的一員，是免疫受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)因子，在髓系免疫細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞中啟動促炎和抑制信號通路[21]。研究發(fā)現(xiàn)，SRC激酶抑制劑達(dá)沙替尼可通過抑制NK細(xì)胞[22]、CD4+T細(xì)胞和幼稚T細(xì)胞[23]而發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的功能；同時，也可作為免疫抑制劑用于CAR-T治療[24]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與機(jī)體的免疫調(diào)控密切相關(guān)[25]。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤逃逸的新機(jī)制可能是腫瘤誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞經(jīng)MAPK激活和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase,ERK)抑制實現(xiàn)。Wilmott等[27]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用MAPK和免疫檢查點抑制劑，可降低MAPK誘導(dǎo)的免疫抑制，增強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答，且臨床研究初步表明，MAPK抑制劑可以大幅度提高免疫原性敏感度，提高患者對程序性死亡受體1(programmed cell death receptor 1,PD1)免疫治療的應(yīng)答率和持續(xù)時間。最近有研究還發(fā)現(xiàn)，MAPK抑制劑聯(lián)合放射治療可協(xié)同增強(qiáng)免疫檢查點的封鎖，從而提高抗腫瘤療效[28]。鑒此，筆者認(rèn)為靈芝可能也是通過影響SRC、MAPK1等蛋白的表達(dá)而發(fā)揮免疫調(diào)控的作用。

3.3本研究GO富集結(jié)果顯示，靈芝調(diào)控免疫功能主要涉及磷脂代謝調(diào)節(jié)、肽基-絲氨酸磷酸化和肽基-絲氨酸修飾等生物學(xué)功能，而且每種生物學(xué)功能與靶點的作用都是一個復(fù)雜生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，同時也能說明靈芝調(diào)控免疫的機(jī)制并非局限于單一靶點或生物功能。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP信號通路、蛋白多糖與癌癥、乙型肝炎病毒、鞘脂代謝通路等通路直接或間接參與免疫的調(diào)控。分子對接結(jié)果提示，SRC、MAPK1能與(+)-丹芝酸甲酯A、赤芝酸甲酯F形成穩(wěn)定結(jié)合[29]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法確認(rèn)了靈芝調(diào)控免疫的活性成分、關(guān)鍵靶點和信號通路，并基于分子對接初步模擬其可能的分子作用機(jī)制，為靈芝對免疫的調(diào)控作用機(jī)制研究提供了理論依據(jù)和線索。但研究結(jié)論尚需通過生物實驗和臨床試驗進(jìn)一步驗證。