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    負(fù)載血管基質(zhì)片段的GelMA水凝膠用于促進(jìn)皮下血管化乳頭狀軟骨再生的實(shí)驗(yàn)研究

    2022-07-08 01:21:28丁靖豪
    關(guān)鍵詞:乳頭狀乳頭軟骨

    張 宇, 丁靖豪, 陳 茹

    完美的乳房需要合適的乳頭作點(diǎn)睛之筆[1]。近年來,隨著國(guó)內(nèi)乳房整形手術(shù)數(shù)量的逐漸增多,乳頭壞死的情況時(shí)有發(fā)生。其他原因如先天性無乳頭、外傷、乳腺病變切除術(shù)后等,也都會(huì)導(dǎo)致乳頭缺失,這不僅影響女性的形體美,而且會(huì)對(duì)患者造成極大的心理壓力[2]。長(zhǎng)期以來,乳頭再造一直是乳腺外科醫(yī)師面臨的難題之一。最常用的重建方法有自體肋軟骨雕刻乳頭支撐體、組織游離移植、局部皮瓣、局部皮瓣復(fù)合皮瓣內(nèi)支撐物[3]。然而,利用自體肋軟骨行乳頭再造存在很多缺點(diǎn),包括有限的軟骨供區(qū),以及供區(qū)術(shù)中術(shù)后存在血?dú)庑亍⑿乇诮Y(jié)構(gòu)不完整等風(fēng)險(xiǎn)。另外,這種方法固有的一個(gè)缺點(diǎn)是,雕刻一個(gè)與患者正常乳頭在解剖學(xué)上精準(zhǔn)匹配的乳頭軟骨支撐體具有很大的難度,這需要外科醫(yī)師具備良好的雕刻能力和充分的立體感。而組織游離移植及皮瓣法也面臨供區(qū)損傷、乳頭凸度難以長(zhǎng)期維持等問題[4]。因此,當(dāng)前臨床迫切需要尋求一種更加有效的策略以精準(zhǔn)再造乳頭軟骨支撐體。3D生物打印作為一項(xiàng)新興技術(shù),可以利用水凝膠作為“墨水”,通過計(jì)算機(jī)構(gòu)建的圖案進(jìn)行個(gè)性化精準(zhǔn)打印[5-6]。其性能優(yōu)勢(shì)在于:(1)良好的生物相容性、無毒性;(2)可打印性和較好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;(3)可生物降解和吸收性;(4)可模擬與細(xì)胞外基質(zhì)相似的天然微環(huán)境等。因此,通過3D打印水凝膠有望再造精準(zhǔn)的乳頭狀結(jié)構(gòu),然而其血管化仍是維持乳頭狀軟骨再生的難點(diǎn)和重點(diǎn)[7-8]。血管基質(zhì)片段(stromal vascular fraction,SVF)來源于成熟脂肪組織,是一組異質(zhì)性的細(xì)胞群體,含有脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)、內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等[9]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明SVF能分泌大量促血管生長(zhǎng)因子,同時(shí)能分化成內(nèi)皮細(xì)胞參與血管出芽[10]。因此,本文擬聯(lián)合SVF和經(jīng)典的甲基丙烯酸酐化明膠(methacrylate gelatin,GelMA)水凝膠,制備具有促血管化功能的GelMA/SVF復(fù)合水凝膠用于軟骨再生,為后續(xù)精準(zhǔn)乳頭狀軟骨再生奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物 Gel(CAS 9000-70-8)、甲基丙烯酸酐(methacrylic anhydride,MA;CAS 760-93-0)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲?;鶃喠姿徜圎}(lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoyl phosphinate,LAP),購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為1 000或3 500)購自上海源葉生物科技有限公司。倒置熒光顯微鏡(T12-U)購自日本Nikon公司。胎牛血清(FBS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、0.25%胰酶、高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM)等購自Gibico公司。綠色Celltracker購自Life Technologies公司。HE染色試劑盒、Safranin-O染色試劑盒、Ⅱ型膠原染色試劑盒、阿利新藍(lán)(pH 2.5)顯色試劑盒和酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購自Yeasen公司(上海,中國(guó))。6周齡雌性新西蘭大白兔1只(上海甲干生物科技有限公司)和6周齡雌性裸鼠6只(上海斯萊克生物科技有限公司)。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則。

    1.2脂肪來源SVF的獲取和三項(xiàng)分化 無菌條件下獲取兔雙側(cè)腹股溝脂肪組織,PBS清洗3次,徹底去除紅細(xì)胞與組織碎片。加入預(yù)熱的0.1% Ⅰ型膠原酶溶液,置37 ℃水浴震蕩消化1 h。300×g離心5 min,去除上層脂肪細(xì)胞與膠原酶溶液。加入適量含10% FBS的DMEM重懸細(xì)胞,經(jīng)400 μm細(xì)胞篩過濾,獲得血管基質(zhì)成分細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將血管基質(zhì)成分置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中,以含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)48 h后換液,去除未貼壁細(xì)胞及殘留的紅細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞集落達(dá)到80%匯合后用胰蛋白酶消化細(xì)胞,這些細(xì)胞被稱為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的P1。使用脂肪來源SVF經(jīng)培養(yǎng)后的原代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,分別添加成脂(10-6mol/L地塞米松、10 mg/L胰島素和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、成骨(0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 μmol/L抗壞血酸磷酸鹽)和成軟骨(6.25 mg/L胰島素、10 μg/L轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和50 μg/L抗壞血酸)誘導(dǎo)培養(yǎng)基,觀察其形態(tài)變化,并對(duì)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞分別進(jìn)行油紅O染色、茜素紅染色與阿利新藍(lán)染色。

    1.3GelMA/SVF復(fù)合水凝膠的制備 通過Gel與MA的加成反應(yīng)合成GelMA。簡(jiǎn)言之,將10 g Gel以10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶于PBS中,緩慢加入5 ml MA,于60 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h,期間保持溫度不變。待反應(yīng)結(jié)束后,過濾溶液并放入透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500)中透析3 d。透析完成后冷凍干燥即可得到白色泡沫狀的GelMA固體,將產(chǎn)物置于-20 ℃恒溫冰箱中保存。使用生物相容性較好的LAP作為光引發(fā)劑。將GelMA、LAP及SVF以5%、0.3%及1.5%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶解于去離子水中得到GelMA/SVF預(yù)凝膠溶液,將此溶液暴露于365 nm紫外光下15 s即可得到GelMA/SVF復(fù)合水凝膠。

    1.4GelMA和GelMA/SVF復(fù)合水凝膠3D打印

    分別將GelMA和GelMA/SVF復(fù)合預(yù)凝膠溶液移入注射器內(nèi),并固定于打印機(jī)(Bio-Architect? Pro,杭州捷諾飛生物科技股份有限公司)推進(jìn)泵上,連接軟管和打印噴頭并固定。調(diào)整打印噴頭速度及推進(jìn)速度,以打印出網(wǎng)格結(jié)構(gòu)組織。

    1.5軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 獲取兔膝關(guān)節(jié)軟骨,洗凈,并剪碎,加入5倍體積的0.25%膠原酶,搖床消化過夜。100 μm孔徑濾網(wǎng)過濾,1 500 r/min離心5 min,PBS漂洗2遍,以含10% FBS的高糖DMEM配成細(xì)胞懸液,按2×106cells/皿(直徑10 cm培養(yǎng)皿)接種細(xì)胞,置入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第2代軟骨細(xì)胞。

    1.6裸鼠皮下軟骨再生構(gòu)建 將收集的第2代軟骨細(xì)胞分別與GelMA和GelMA/SVF預(yù)凝膠溶液均勻混合,配制成100×106cells/ml的細(xì)胞-水凝膠懸液,并暴露于365 nm紫外光下15 s進(jìn)行固化。隨后將6只裸鼠隨機(jī)分為兩組(每組3只),麻醉后在無菌條件下于背部劃開1個(gè)0.5 cm長(zhǎng)的切口形成腔隙,將上述構(gòu)建的兩組細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物埋入腔隙,并用5-0可吸收縫線進(jìn)行縫合。完成手術(shù)的裸鼠飼養(yǎng)在清潔環(huán)境下,保證其自由活動(dòng)及充足的飲食。4周后處死裸鼠,收集標(biāo)本進(jìn)行體內(nèi)軟骨再生及血管化相關(guān)情況評(píng)價(jià)。

    1.7組織學(xué)評(píng)價(jià) 將體內(nèi)的標(biāo)本置于4%的多聚甲醛中固定24 h,行梯度酒精脫水、石蠟包埋,并切成5 μm厚度的組織切片,通過HE和Safranin-O染色,以評(píng)價(jià)再生軟骨組織和軟骨特異性基質(zhì)的生成情況。通過CD31免疫熒光染色,以評(píng)價(jià)再生軟骨組織的血管化情況。

    1.8生化成分分析 將體內(nèi)獲取的標(biāo)本置于木瓜蛋白酶溶液中消化12 h后,采用阿利新藍(lán)法定量檢測(cè)樣本中的GAG含量,采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定樣本中的膠原蛋白Ⅱ(collagen Ⅱ)含量。

    2 結(jié)果

    2.1脂肪來源SVF成分的細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 脂肪來源SVF成分細(xì)胞體外接種于培養(yǎng)皿中,并經(jīng)過12 h培養(yǎng)后,細(xì)胞大多數(shù)呈現(xiàn)分裂期的梭形狀態(tài);再經(jīng)過24~48 h的培養(yǎng)后,細(xì)胞數(shù)量明顯增多,提示細(xì)胞具有良好的增殖活性(見圖1?~?)。脂肪來源SVF成分經(jīng)成脂誘導(dǎo)21 d后,油紅O染色顯示大量紅染的脂質(zhì)沉淀;經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d后,茜素紅染色結(jié)果顯示有大量紅染的鈣結(jié)節(jié)形成;經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)21 d后,阿利新藍(lán)染色可見呈陽性,表明有軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)成分產(chǎn)生(見圖1?~?)。上述結(jié)果充分證明脂肪來源SVF成分的成功提取,并且其具有三項(xiàng)定向誘導(dǎo)分化潛能,為軟骨再生提供了依據(jù)。

    ?SVF成分細(xì)胞接種12 h后熒光圖;?SVF成分細(xì)胞接種24 h后熒光圖;?SVF成分細(xì)胞接種48 h后熒光圖;?SVF成分經(jīng)成脂誘導(dǎo)21 d的油紅O染色;?SVF成分經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d的茜素紅染色;?SVF成分經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)21 d的阿利新藍(lán)染色

    2.2GelMA/SVF復(fù)合水凝膠的制備及其3D打印的初探結(jié)果 將脂肪來源SVF成分均勻混入GelMA水凝膠成功制備GelMA/SVF復(fù)合水凝膠,該水凝膠具有與純GelMA一樣的光交聯(lián)特性。隨后對(duì)GelMA和GelMA/SVF復(fù)合水凝膠分別進(jìn)行3D打印,發(fā)現(xiàn)這兩種水凝膠均可以成功打印出相對(duì)均質(zhì)的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)(見圖2),說明SVF的引入并不改變GelMA的可打印性,且為后續(xù)精準(zhǔn)打印乳頭狀結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。

    ?GelMA水凝膠3D打印的大體圖;?GelMA/SVF復(fù)合水凝膠3D打印的大體圖

    2.3GelMA/SVF復(fù)合水凝膠裸鼠皮下再生軟骨結(jié)果 本研究分別將單純GelMA和GelMA/SVF復(fù)合水凝膠包裹軟骨細(xì)胞后,植入裸鼠皮下培養(yǎng)。4周后取材進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)單純GelMA組再生的軟骨組織只有少量軟骨特異性基質(zhì)的沉積以及少許陽性Safranin-O染色(見圖3??),而GelMA/SVF復(fù)合水凝膠組存在大量軟骨特異性基質(zhì)的沉積以及大面積陽性Safranin-O染色(見圖3??)。軟骨特異性生化成分定量分析結(jié)果顯示,相比于單純GelMA組,GelMA/SVF復(fù)合水凝膠具有更高的GAG和Collagen Ⅱ表達(dá)量(見圖4)。以上結(jié)果表明,相比于單純GelMA組再生的軟骨組織,GelMA/SVF復(fù)合水凝膠組明顯能再生出更加均質(zhì)且豐厚的軟骨基質(zhì),明顯促進(jìn)軟骨再生,為后續(xù)精準(zhǔn)再生乳頭狀軟骨奠定基礎(chǔ)。

    ?GelMA組的HE染色;?GelMA組的Safranin-O染色;?GelMA/SVF組的HE染色;(d)GelMA/SVF組的Safranin-O染色

    ?GAG含量定量分析;?Collagen Ⅱ含量定量分析,*P<0.05

    2.4再生軟骨血管化分析結(jié)果 為了探究脂肪來源SVF促進(jìn)水凝膠再生軟骨的作用,本研究進(jìn)一步對(duì)再生軟骨進(jìn)行血管化分析。CD31免疫熒光染色結(jié)果顯示,GelMA組只有少量陽性的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),而GelMA/SVF組出現(xiàn)大量陽性的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)(見圖5)。上述結(jié)果充分說明,脂肪來源SVF的引入可以顯著促進(jìn)血管化,通過加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)滲透從而促進(jìn)軟骨組織再生。

    ?GelMA組的CD31免疫熒光染色;?GelMA/SVF組CD31免疫熒光染色

    3 討論

    3.1近年來,軟骨組織工程技術(shù)的出現(xiàn),為乳頭再生提供了一條新的途徑。廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的3D打印技術(shù),成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的一種先進(jìn)輔助技術(shù)手段[11]。其基本原理是以生物材料作為“打印墨水”,首先利用計(jì)算機(jī)斷層掃描或計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)進(jìn)行三維模型構(gòu)建,再以STL格式文件輸入到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中,并分層成二維切片數(shù)據(jù),通過計(jì)算機(jī)控制的3D打印系統(tǒng)進(jìn)行逐層打印,疊加后最終獲得三維產(chǎn)品。利用3D打印技術(shù)所打印出來的組織工程支架不僅具備精細(xì)的內(nèi)部三維多孔結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞的黏附與增殖,更重要的是,支架外形可以與缺損組織的解剖結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)匹配[11]。因此,聯(lián)合軟骨組織工程和3D打印技術(shù)有望創(chuàng)造出精準(zhǔn)解剖外形的乳頭狀軟骨組織。組織工程技術(shù)避免了自體肋軟骨乳頭再造手術(shù)所承擔(dān)的軟骨供區(qū)并發(fā)癥,以及較長(zhǎng)的雕刻支架的手術(shù)時(shí)間和支架移植前需反復(fù)多次試驗(yàn)的手術(shù)過程[12]。

    3.2水凝膠具有超高的含水率和較好的吸水溶脹性能,吸水溶脹后,水凝膠內(nèi)部會(huì)形成相互貫通的多孔網(wǎng)絡(luò),為細(xì)胞黏附、增殖和分化提供了結(jié)構(gòu)支撐和微環(huán)境,是組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的細(xì)胞支架來源[13]。目前基于水凝膠進(jìn)行3D打印再生特定形狀組織是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[14]。本研究采用經(jīng)典的GelMA水凝膠進(jìn)行3D打印,完全有望構(gòu)筑精確形態(tài)的乳頭狀軟骨。然而,軟骨血管化是軟骨組織工程的主要障礙[15]。水凝膠再生軟骨同樣存在一個(gè)重要問題是營(yíng)養(yǎng)滲透不足,導(dǎo)致再生軟骨質(zhì)量差,遠(yuǎn)期效果出現(xiàn)軟骨塌陷,最終不能長(zhǎng)期維持精確乳頭狀軟骨形態(tài)[16]。良好的血管化有望顯著改善水凝膠再生軟骨質(zhì)量。因此,軟骨再生與血管化仍是軟骨組織工程技術(shù)研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。

    3.3組織血管化主要包括血管新生和血管形成。血管新生是在原來存在的血管結(jié)構(gòu)上長(zhǎng)出新血管的生物學(xué)過程[17]。血管形成是指內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移至某部位,分化發(fā)育為新血管。組織血管化在組織工程的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都是制約組織工程技術(shù)使用的難點(diǎn)。提高組織在體外血管化的能力是目前組織工程技術(shù)的主要研究方向之一。由于灌注和氧氣運(yùn)輸直接影響細(xì)胞的活性和分化,所以目前研究的組織僅限于幾毫米厚度。此厚度受支架的體積、細(xì)胞成分的代謝特點(diǎn)以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)葪l件制約,且氧氣運(yùn)輸只能通過滲透或者建立功能性血管網(wǎng)絡(luò)完成。目前通過提供生長(zhǎng)因子、引導(dǎo)支架、灌注生物反應(yīng)器、微流控芯片、細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)、細(xì)胞的功能化、模塊化組裝等方法改善組織的血管化情況[18]。但是,即使這些方法在一定程度上增加了細(xì)胞的活性,或建立了類似血管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu),但仍然沒有與機(jī)體自身的組織代謝活動(dòng)建立固定的聯(lián)系,對(duì)于氧氣及養(yǎng)料的擴(kuò)散滲透的定量測(cè)量要在將來的研究中進(jìn)一步觀察。

    3.4有研究報(bào)道,SVF體外貼壁培養(yǎng)獲得的ADSCs,在不同誘導(dǎo)環(huán)境下能夠分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等;目前關(guān)于細(xì)胞移植的治療性血管化作用的機(jī)理集中于植入細(xì)胞的直接分化和持續(xù)分泌多種生長(zhǎng)因子[19]。但是,細(xì)胞移植入體內(nèi)后成活率極低,其分化的細(xì)胞不足以促進(jìn)血管化的發(fā)生。因此,其持續(xù)的旁分泌能力被認(rèn)為是發(fā)揮促血管化作用的主要機(jī)理。目前,脂肪來源SVF多應(yīng)用于自體脂肪移植后促進(jìn)脂肪組織血管化的研究,而國(guó)內(nèi)外學(xué)者將脂肪來源SVF應(yīng)用于軟骨組織再生以及血管化的研究甚少[20]。本研究通過將SVF載入GelMA水凝膠,結(jié)果表明SVF的引入可以顯著促進(jìn)GelMA水凝膠再生軟骨的血管化情況,從而提供充分的營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)皮下軟骨再生。

    綜上所述,本研究將SVF載入GelMA水凝膠,制備出具有合格3D打印性能的GelMA/SVF復(fù)合水凝膠。更加重要的是,SVF的引入可以明顯促進(jìn)再生軟骨的血管化,從而提供充分的營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)皮下軟骨再生,為后續(xù)精準(zhǔn)乳頭狀軟骨再生提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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