低溫貯藏條件下木薯種莖可溶性糖與干旱脅迫耐受性的相關(guān)性研究

李智博，董世滿，曾長(zhǎng)英，趙平娟，李淑霞，彭 明

(1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所, 海南 ?？?571101； 2 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院, 海南 ?？?570228)

木薯Manihot esculentaCrantz是大戟科木薯屬植物，世界三大薯類作物之一，原產(chǎn)自南美洲巴西等地，現(xiàn)在是我國(guó)熱帶以及亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物。木薯是無(wú)性繁殖作物，在生產(chǎn)中以種莖繁殖為主，種莖的好壞不僅影響全苗質(zhì)量，而且影響植株的生長(zhǎng)、塊根分化，因此，種莖的貯藏質(zhì)量直接影響木薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。近些年來(lái)，我國(guó)木薯的產(chǎn)地向北遷移，導(dǎo)致木薯種莖的貯藏期變長(zhǎng)。木薯種莖在一般情況下需要貯藏2～3個(gè)月，有些地方甚至需要4～5個(gè)月才能種植[3]，在貯藏的過(guò)程中，如果環(huán)境溫度過(guò)高或者貯藏時(shí)間過(guò)久，木薯種莖離體后極容易干旱失水，從而影響木薯種莖的成活率，最終影響到木薯的生長(zhǎng)發(fā)育以及最終產(chǎn)量。所以，開(kāi)展低溫貯藏對(duì)木薯種莖生理特性影響的研究以及了解采后貯藏木薯種莖內(nèi)相關(guān)可溶性糖的轉(zhuǎn)化，有助于改良木薯種莖貯藏方式和提高木薯產(chǎn)量。

在植物的生命周期中，種子萌發(fā)和早期幼苗生長(zhǎng)依賴于貯藏物質(zhì)，主要是碳水化合物，它們以可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)的形式從種子貯藏組織轉(zhuǎn)移到莖和胚根等各種器官，是細(xì)胞生長(zhǎng)和維持滲透穩(wěn)態(tài)所必需物質(zhì)[4-5]。蔗糖是可溶性糖的主要成分之一，在光合作用中產(chǎn)生再通過(guò)韌皮部運(yùn)輸?shù)綆?kù)組織進(jìn)行利用和儲(chǔ)存[6]；葡萄糖是植物體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和信號(hào)分子，不僅參與糖酵解過(guò)程，而且可被己糖激酶感知[7-8]；果糖是由蔗糖通過(guò)與細(xì)胞壁結(jié)合的轉(zhuǎn)化酶結(jié)合分解而成，具有一種特定的感知與信號(hào)通路，該通路共享下游信號(hào)成分，如脫落酸和葡萄糖信號(hào)中的成分[9]?？扇苄蕴菍?duì)環(huán)境脅迫高度敏感，環(huán)境脅迫作用于從源器官到庫(kù)器官的碳水化合物供應(yīng)[10]?？扇苄蕴堑年P(guān)鍵作用是通過(guò)糖代謝產(chǎn)生更多的保護(hù)性物質(zhì)，為正常的代謝過(guò)程提供能源，同時(shí)也可提高細(xì)胞的滲透勢(shì)，增強(qiáng)保水性能，維持膨壓并且能夠有效地清除ROS，維持正常的生理代謝功能，避免原生質(zhì)體在逆境條件下脫水受到傷害，從而對(duì)原生質(zhì)膜起到保護(hù)作用[11-12]。植物在逆境時(shí)可以通過(guò)增加可溶性糖含量來(lái)提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。單忠英等[13]發(fā)現(xiàn)，木薯苗在受到干旱脅迫后，葉片內(nèi)的可溶性糖含量隨著供水量的增加而逐漸下降，在干旱脅迫下木薯苗能積累更多的可溶性糖，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力，提高抗旱能力。Shi等[14]發(fā)現(xiàn)，失水脅迫處理組狗牙根的可溶性糖含量顯著高于對(duì)照組。

海藻糖是一種非還原性雙糖，廣泛存在于真菌、細(xì)菌及植物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，但在大多數(shù)高等植物中，海藻糖僅以痕量存在，而且檢測(cè)到的痕量是不可重復(fù)的，并且一度被懷疑是微生物污染[15]。海藻糖具有多種生物學(xué)功能，既可作為能量來(lái)源又作為非生物脅迫的保護(hù)性糖或信號(hào)糖[16-18]。海藻糖是木薯在干旱環(huán)境中產(chǎn)生的重要物質(zhì)。趙超等[19]發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下，木薯種莖皮層和中柱均產(chǎn)生較高濃度的海藻糖，而對(duì)照并未產(chǎn)生海藻糖。張丹[20]通過(guò)定量PCR檢測(cè)出干旱脅迫下木薯根部海藻糖合成酶基因TPS1-3表達(dá)量最高，推測(cè)其在木薯抗干旱調(diào)控中起重要作用。Han等[21]在耐旱作物木薯、麻瘋樹(shù)和蓖麻中發(fā)現(xiàn)了大量海藻糖。

海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase，TPS)基因是海藻糖合成酶的關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥TPS基因家族有11個(gè)基因，其中AtTPS基因家族可進(jìn)一步劃分為AtTPS1～4和AtTPS5～11這2個(gè)亞族。目前僅AtTPS1基因被證實(shí)可以明顯影響TPS酶活性，且對(duì)植物生長(zhǎng)代謝過(guò)程有影響，而TPS2～4基因被推測(cè)僅對(duì)十字花科植物的TPS蛋白酶有作用，此外，TPS5～TPS11基因的生物學(xué)功能仍不明確[22-23]。木薯TPS基因家族通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定有12個(gè)基因，與擬南芥TPS基因家族數(shù)據(jù)類似，同樣分為MeTPS1～4和MeTPS5～12這2個(gè)亞族。推測(cè)MeTPS1～4為有活性的海藻糖合成酶基因，而MeTPS5～12都具有完整的TPS結(jié)構(gòu)域以及TPS活性所需的基序，但是這8個(gè)基因可能是沒(méi)有活性的[21]。

前期研究普遍比較重視木薯的根系和葉片，而對(duì)木薯種莖的關(guān)注較少，且大部分對(duì)種莖的研究是與生長(zhǎng)期種莖有關(guān)，對(duì)于采后貯藏種莖的生理及信號(hào)途徑的研究較少見(jiàn)。為此，我們通過(guò)將‘木薯60444’種莖置于不同溫度貯藏0～30 d，了解木薯種莖在不同溫度長(zhǎng)時(shí)間貯藏后可溶性糖含量變化趨勢(shì)，解析低溫貯藏木薯種莖生理變化及其分子機(jī)制，同時(shí)也為木薯栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料獲取與處理

試驗(yàn)地點(diǎn)為海南省?？谑校乩碜鴺?biāo)為N20.03°、E110.33°，地處熱帶地區(qū)，夏季處于 3—10月，夏季室外最高溫度為38 ℃左右，室溫為22℃左右。試驗(yàn)材料為‘木薯60444’，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所功能基因組研究實(shí)驗(yàn)室提供。選取長(zhǎng)度、長(zhǎng)勢(shì)大致相同的莖段，平均分成 2份，分別進(jìn)行低溫 (20±2) ℃ 與常溫(36±2) ℃貯藏處理，每個(gè)處理組分別在貯藏0、10、20、30 d后稱質(zhì)量，并取材分別用于RNA抽提和可溶性糖含量測(cè)定。

1.2 可溶性糖含量測(cè)定

莖段于105 ℃烘箱中殺青20 min，并于80 ℃烘干至恒質(zhì)量后送至江蘇三黍生物科技有限公司做靶向代謝物檢測(cè)。

1.3 RNA提取及cDNA合成

稱取木薯種莖樣品2.0 g，用液氮研磨成粉末，按照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說(shuō)明書，提取木薯總RNA，使用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000檢測(cè)總RNA的濃度和純度。參照FastKing Gdna Dispelling RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)的說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，存放于-80 ℃冰箱。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

利用NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)定量引物(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司?？诤铣刹亢铣?。以木薯內(nèi)參基因MeActin為參照使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析基因的相對(duì)表達(dá)量。試劑盒為SYBR?Premix Ex Taq? II(Tli RNaseH Plus)，購(gòu)于 TaKaRa公司。使用的儀器為Applied Biosystems StepOneTMand StepOnePlusTMReal-Time PCR Systems，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 數(shù)據(jù)處理

各數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件(Microsoft 2016)進(jìn)行處理分析，采用OriginPro 2021、Photoshop軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫貯藏組與常溫貯藏組木薯種莖的失水率

木薯種莖在不同溫度貯藏10 d，低溫貯藏組失水率低于常溫貯藏組而且兩者差異顯著(P＜0.01)；種莖貯藏20 d后，兩者失水率差距進(jìn)一步加大，二者差異極顯著(P＜0.001)；種莖在不同溫度貯藏30 d，兩者失水率差異達(dá)到最大值，達(dá)極顯著水平(P＜0.001)。因此，木薯種莖在低溫貯藏下有助于保持水分(圖1)。

圖1 低溫貯藏組與常溫貯藏組木薯種莖的失水率Fig. 1 Water loss rate of cassava stem reposited under low temperature and normal temperature

2.2 低溫貯藏組與常溫貯藏組木薯種莖的可溶性糖含量

2.2.1 可溶性糖各組分含量差異 在不同溫度貯藏0～30 d，低溫貯藏組與常溫貯藏組離體種莖的海藻糖含量均得到了提升，貯藏第20天，2種溫度貯藏組種莖的海藻糖含量均達(dá)到最大值，低溫貯藏組比常溫貯藏組低86.14%。隨著貯藏時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，2組海藻糖的含量均下降。在貯藏期間，低溫貯藏組海藻糖含量均低于常溫貯藏組(圖2A)。

圖2 木薯種莖低溫貯藏和常溫貯藏0～30 d可溶性糖含量變化Fig. 2 Changes of soluble sugar contents in cassava stems stored under low and normal temperature for 0-30 d

在不同溫度貯藏0～30 d，木薯種莖蔗糖含量整體下降，其中常溫貯藏組在0～10 d下降幅度最大，在20 d時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，基本為0。不同的是，在低溫貯藏組中，木薯種莖在10～20 d下降幅度最大，20～30 d蔗糖含量略有上升?？偠灾臼矸N莖蔗糖含量在常溫貯藏30 d后基本為0，低溫貯藏30 d后的蔗糖含量高于常溫貯藏組(圖2B)。

在不同溫度貯藏0～30 d，木薯種莖葡萄糖含量整體減少，低溫貯藏組種莖中葡萄糖含量在前期下降較快，中期最明顯，后期放緩。常溫貯藏組葡萄糖含量在前期下降較快，有趣的是在中期緩慢增長(zhǎng)，后期與低溫處理含量變化趨勢(shì)相似，呈緩慢下降趨勢(shì)。在貯藏30 d時(shí)，不同溫度貯藏的葡萄糖含量都達(dá)到最低點(diǎn)，低溫貯藏組下降幅度較大(圖2C)。

從圖2D可以看出，果糖含量整體減少。在低溫貯藏組，木薯種莖果糖含量在0～10 d緩慢下降，在10～20 d快速下降，在30 d略有上升。常溫儲(chǔ)藏組果糖含量在0～10 d降幅最快，隨后不斷減慢，在30 d達(dá)到最低點(diǎn)。低溫貯藏組與常溫貯藏組在貯藏10 d時(shí)果糖含量相差最大。

低溫貯藏組與常溫貯藏組木薯種莖麥芽糖含量都極低，并且整體都呈下降趨勢(shì)，均在貯藏20 d時(shí)降至最低點(diǎn)，在20～30 d略上升(圖2E)。

2.2.2 可溶性糖各組分比例變化 由圖3可以看出，在低溫與常溫貯藏0 d時(shí)，木薯種莖各可溶性糖組分所占比例大致相同，其中蔗糖、葡萄糖和果糖為主要成分，海藻糖、麥芽糖比例極低。而在貯藏30 d后，常溫貯藏組海藻糖與葡萄糖為主要成分，蔗糖、果糖和麥芽糖比例較低；低溫貯藏組葡萄糖為主要成分，海藻糖、蔗糖、果糖和麥芽糖比例較低。

圖3 木薯種莖低溫與常溫儲(chǔ)藏0～30 d可溶性糖各組分比例Fig. 3 Proportion of each soluble sugar component in cassava stem stored under low and normal temperature for 0-30 d

貯藏10 d，常溫貯藏組海藻糖、蔗糖、葡萄糖比例變化明顯，低溫貯藏組蔗糖和葡萄糖比例變化明顯。常溫貯藏組海藻糖比例相比常溫貯藏0 d高37.24%，而低溫貯藏組海藻糖比例僅比低溫貯藏0 d高0.16%。低溫與常溫貯藏組葡萄糖含量都呈下降趨勢(shì)，低溫貯藏10 d比初始低5.36%，常溫貯藏10 d比初始低7.34%。蔗糖常溫貯藏10 d后比初始降低28.79%，而低溫貯藏10 d比初始增長(zhǎng)4.16%。果糖含量變化不明顯，常溫貯藏10 d比初始下降1.22%，低溫貯藏10 d比初始增長(zhǎng)1.44%。麥芽糖整體處于極低水平，未有明顯變化，常溫貯藏10 d后比初始增長(zhǎng)0.10%，而低溫貯藏10 d后比初始降低0.09%。

當(dāng)木薯種莖貯藏10～20 d時(shí)，海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖組分都發(fā)生了改變，其中在低溫貯藏組海藻糖、蔗糖、葡萄糖和果糖比例變化較大，常溫貯藏組中海藻糖、蔗糖、葡萄糖、果糖比例變化較大。常溫貯藏20 d海藻糖占比77.35%，比常溫貯藏10 d提高了38.78%；低溫貯藏20 d海藻糖占比33.22%，比低溫貯藏10 d提高32.72%。無(wú)論是常溫貯藏還是低溫貯藏20 d葡萄糖占比都比10 d下降，其中低溫貯藏20 d葡萄糖含量占比33.97%，比貯藏10 d提高8.94%；常溫貯藏20 d葡萄糖占比19.05%，相較常溫貯藏10 d降低0.56%。木薯種莖離體貯藏20 d后，蔗糖占比也明顯下降，低溫貯藏20 d相較10 d下降10.45%。果糖占比明顯下降，種莖常溫貯藏20 d果糖占比貯藏較貯藏10 d下降20.90%，低溫貯藏20 d相較貯藏10 d下降19.82%。木薯種莖貯藏20 d時(shí)麥芽糖含量極低，低溫貯藏與常溫貯藏麥芽糖比例均降至0。

當(dāng)木薯種莖在不同溫度貯藏30 d時(shí)，常溫貯藏組海藻糖、葡萄糖含量未出現(xiàn)較大的變化，而低溫貯藏組海藻糖、葡萄糖、蔗糖以及果糖等都出現(xiàn)了較大的變化。低溫貯藏30 d后海藻糖含量相比貯藏20 d降低了13.98%，常溫貯藏30 d后海藻糖含量相較貯藏20 d沒(méi)有較大的變化，僅僅下降了0.44%。低溫貯藏30 d后葡萄糖含量變化較大，比貯藏20 d提高了18.08%，而常溫貯藏30 d的葡萄糖含量?jī)H僅增加0.65%。低溫貯藏組蔗糖含量變化較大，低溫貯藏30 d后比貯藏20 d降低了9.38%，常溫貯藏30 d蔗糖占比0.87%。低溫貯藏30 d后果糖占比13.18%，比貯藏20 d占比高3.53%，常溫貯藏30 d果糖占比2.51%，比貯藏20 d降低1.09%。低溫貯藏30 d麥芽糖含量占比1.74%。

2.2.3 海藻糖含量與失水率的相關(guān)性分析 本研究分別對(duì)低溫貯藏組與常溫貯藏組海藻糖含量與木薯種莖的失水率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫貯藏組與常溫貯藏組海藻糖含量與木薯種莖的失水率均顯著相關(guān)，低溫貯藏組R1=0.636、常溫貯藏組R2=0.835，R1＜R2，這表明受到失水脅迫的程度越高，海藻糖濃度越高；并且，對(duì)低溫貯藏組中海藻糖含量與木薯種莖失水率的線性回歸方程與常溫貯藏組中海藻糖含量與木薯種莖失水率的線性回歸方程進(jìn)行t檢驗(yàn)，得t=0.014，兩者差異顯著(P＜0.05)。分析表明，低溫貯藏更容易保水，并且種莖中海藻糖含量更不易受失水影響(圖4)。

圖4 低溫貯藏與常溫貯藏木薯種莖海藻糖含量與失水率的相關(guān)性分析Fig. 4 Correlation analyses between trehalose content and water loss rate of cassava stem stored under low and normal temperature

2.3 低溫貯藏組與常溫貯藏組糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)

2.3.1 葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖等糖代謝相關(guān)基因的表達(dá) 6-磷酸果糖激酶(基因號(hào)：Manes.05G021200)，為糖酵解的限速酶。由圖5A所示，木薯種莖在低溫貯藏10 d時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量迅速升高，在20 d時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，在30 d時(shí)下降到1左右；而常溫貯藏0 d后迅速增長(zhǎng)，在20 d左右達(dá)到最高點(diǎn)，在20 d后相對(duì)表達(dá)量下降，但仍然較貯藏10 d高。低溫貯藏組6-磷酸果糖激酶基因相對(duì)表達(dá)量整體低于常溫貯藏組，表明低溫貯藏有效降低木薯種莖的糖酵解速率。

圖5 木薯種莖低溫貯藏和常溫貯藏0～30 d可溶性糖代謝相關(guān)基因表達(dá)Fig. 5 Expression of genes related to soluble sugar metabolism in cassava stems stored under low and normal temperature for 0-30 d

葡糖磷酸變位酶(基因號(hào)：Manes.06G141300)，參與糖酵解糖異生，可以催化葡萄糖-1-磷酸鹽和葡萄糖-6-磷酸鹽相互轉(zhuǎn)化，在糖代謝中起重要作用。如圖5B所示，木薯種莖在低溫貯藏組0～30 d其相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低，20 d時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)；而常溫貯藏組基因相對(duì)表達(dá)量在0～20 d增長(zhǎng)趨勢(shì)與低溫貯藏組近似，20 d后繼續(xù)增長(zhǎng)，30 d達(dá)到最高點(diǎn)，30 d時(shí)低溫與常溫貯藏組差異顯著(P＜0.01)。

堿性/中性轉(zhuǎn)化酶(基因號(hào)：Manes.03G208400)，可以將蔗糖不可逆地水解為果糖和葡萄糖，是植物體內(nèi)分解代謝的關(guān)鍵酶。堿性/中性轉(zhuǎn)化酶基因由低溫貯藏0 d開(kāi)始增長(zhǎng)在10 d達(dá)到最高點(diǎn)，隨后呈下降趨勢(shì)；常溫貯藏組基因相對(duì)表達(dá)量在10 d時(shí)并未有明顯變化，20 d時(shí)迅速提高，是同期低溫貯藏的6倍，20～30 d開(kāi)始下降至10附近，但仍然高于同期低溫貯藏的相對(duì)表達(dá)量(圖5C)。

麥芽糖化酶(基因號(hào)：Manes.08G060600)可將麥芽糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖。由圖5D可知，低溫貯藏組相對(duì)表達(dá)量整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，10 d時(shí)達(dá)到最大值，20 d時(shí)降至最低點(diǎn)，30 d時(shí)比20 d略有上升，相對(duì)表達(dá)量為1左右；常溫貯藏組與低溫貯藏組趨勢(shì)大致相似，10 d時(shí)麥芽糖化酶相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，大致是低溫貯藏組的2倍；低溫貯藏組麥芽糖化酶在30 d時(shí)上調(diào)表達(dá)。

2.3.2 海藻糖-6-磷酸合成酶基因家族部分基因的相對(duì)表達(dá) 海藻糖-6-磷酸合成酶是木薯海藻糖合成途徑中的關(guān)鍵酶。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究發(fā)現(xiàn)木薯種莖在失水逆境中響應(yīng)信號(hào)為MeTPS-1(基因號(hào)：Manes.05G087900)、MeTPS-2(基因號(hào)：Manes.01G198900)、MeTPS-3(基因號(hào)：Manes.16G042700)，種莖中其他海藻糖-6-磷酸合成酶基因 (基因號(hào)：Manes.17G085400、Manes.14G067800、Manes.15G098800、Manes.06G103000)僅在 0 d 響應(yīng)或者不響應(yīng)(圖6)。

圖6 木薯種莖低溫貯藏和常溫貯藏0～30 d海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因家族部分基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Relative expression levels of some genes in TPS gene family in cassava stems stored under low and normal temperature for 0-30 d

圖6A為木薯種莖中MeTPS-1在低溫以及常溫貯藏后的表達(dá)模式，低溫以及常溫貯藏10 d后均明顯提高，并在20 d時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，整體變化趨勢(shì)與圖2A海藻糖含量變化趨勢(shì)相似。其中低溫貯藏組MeTPS-1相對(duì)表達(dá)量在10 d后上升較快，20 d時(shí)僅為同期常溫貯藏組的50%(P＜0.05)，20 d后迅速下降。常溫貯藏組同期相對(duì)表達(dá)量均高于低溫貯藏。

低溫貯藏組MeTPS-2相對(duì)表達(dá)量在前20 d呈上升趨勢(shì)，20 d時(shí)達(dá)到最大值，常溫貯藏組在10 d時(shí)達(dá)最大值，在20 d時(shí)歸于0(圖6B)。

MeTPS-3僅在低溫貯藏組中有表達(dá)，10 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量高于0 d，隨后則迅速下降，于20 d時(shí)歸于 0附近 (圖6C)。

由此可以看出，在木薯種莖離體貯藏試驗(yàn)中，海藻糖-6-磷酸合成酶主要由MeTPS-1響應(yīng)，MeTPS-2、MeTPS-3均表現(xiàn)為在失水脅迫后上調(diào)表達(dá)，但是部分信號(hào)并未響應(yīng)該試驗(yàn)。

3 討論與結(jié)論

海藻糖存在于多種生物體內(nèi)，可以作為能源物質(zhì)，也可以作為逆境脅迫下的信號(hào)和保護(hù)性物質(zhì)[19,24-25]。Han等[21]在木薯中發(fā)現(xiàn)海藻糖、果糖、葡萄糖和蔗糖等滲透物質(zhì)的濃度與保水能力呈正相關(guān)，且海藻糖對(duì)木薯的滲透脅迫耐受性比果糖、葡萄糖和蔗糖更重要。Miranda等[26]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)酵母TPS1和TPS2可以增加轉(zhuǎn)基因品系對(duì)非生物脅迫的抗性，包括冷凍、干旱、鹽和熱脅迫。在木薯種莖中海藻糖含量與失水脅迫高度相關(guān)，表明海藻糖確實(shí)是響應(yīng)木薯種莖失水脅迫的關(guān)鍵物質(zhì)，低溫貯藏組海藻糖含量與木薯種莖失水率相關(guān)系數(shù)弱于常溫貯藏組，表明低溫貯藏有效降低失水脅迫對(duì)木薯種莖的影響。趙超等[19]發(fā)現(xiàn)‘South China 124’和‘Argentina 7’干旱處理海藻糖含量分別在6 和12 d降低，但并未給出具體分析。Rosa等[10]研究表明糖感應(yīng)途徑調(diào)節(jié)代謝狀態(tài)，高濃度糖表明良好的調(diào)節(jié)代謝狀態(tài)，而低糖水平表明可能糖代謝失調(diào)。本試驗(yàn)中低溫貯藏組與常溫貯藏組種莖貯藏后期海藻糖含量呈下降趨勢(shì)，推測(cè)在失水脅迫后期，由于木薯種莖中其他可溶性糖含量均處于較低水平，海藻糖轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)維持木薯種莖的正常代謝過(guò)程。

植物在逆境脅迫中，海藻糖-6-磷酸合成酶相關(guān)響應(yīng)基因可能較為單一，在擬南芥和水稻中，AtTPS1和OsTPS1分別被證明是唯一有活性的TPS基因，而剩余的TPS蛋白缺乏TPS活性[27-28]。Han等[21]在煙草中證實(shí)MeTPS1(基因號(hào)：Manes.15G098800)有活性。本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)糖-6-磷酸合成酶相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在木薯種莖中僅有3個(gè)基因響應(yīng)不同貯藏溫度下的失水脅迫，且只有MeTPS-1(基因號(hào)：Manes.05G087900)具有完整的信號(hào)表達(dá)，推測(cè)在TPS基因家族中，MeTPS-1為響應(yīng)木薯種莖失水脅迫的主要基因。

木薯種莖在前期受到失水脅迫，種莖中的蔗糖在堿性/中性水解酶的作用下水解成分子量更小的葡萄糖與果糖，參與木薯種莖的糖酵解過(guò)程，提高木薯種莖的滲透調(diào)節(jié)能力；在蔗糖合酶的作用下水解成UDP-葡萄糖和1-磷酸葡萄糖參與海藻糖合成途徑，提升木薯種莖在短時(shí)間內(nèi)的抗旱能力，保護(hù)生物細(xì)胞以及生物活性物質(zhì)在不良環(huán)境下免遭破壞。果糖與麥芽糖在相應(yīng)酶的作用下轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，而6-磷酸葡萄糖既可以參與糖酵解生成能量維持木薯種莖的代謝過(guò)程，又可以在海藻糖-6-磷酸合成酶的作用下參與海藻糖的形成。在常溫貯藏組中葡萄糖含量中期出現(xiàn)上漲的趨勢(shì)，可能是中期種莖脫水脅迫促使蔗糖大量水解成葡萄糖和果糖，而果糖和麥芽糖也轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在低溫貯藏組后期蔗糖、果糖、麥芽糖含量呈上升趨勢(shì)，推測(cè)由于低溫貯藏組后期糖酵解速度較低，部分葡萄糖與海藻糖在后期轉(zhuǎn)化為蔗糖、果糖、麥芽糖。

對(duì)木薯種莖海藻糖的研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖含量上調(diào)表明本研究的低溫貯藏溫度可能并不是最佳溫度，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中可以通過(guò)設(shè)置溫度梯度尋找木薯種莖最適合的貯藏溫度，提高木薯種莖在長(zhǎng)時(shí)間貯藏后的成活率。海藻糖-6-磷酸合成酶是優(yōu)秀的抗逆基因，它合成的6-磷酸海藻糖作為木薯海藻糖合成途徑的中間代謝物質(zhì)，具有不可替代的作用。目前海藻糖-6-磷酸合成酶基因在木薯中的研究還相對(duì)較少，但在其他模式作物中研究較為成熟，Shim等[29]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌海藻糖生物合成基因的異源表達(dá)響應(yīng)高鹽脅迫，增強(qiáng)馬鈴薯植物中海藻糖的積累而且沒(méi)有影響馬鈴薯的生長(zhǎng)，因此可以考慮將木薯6-磷酸海藻糖合成酶基因?qū)肫渌魑镏?，增?qiáng)作物的抗逆性。

總而言之，本試驗(yàn)探究低溫貯藏與常溫貯藏對(duì)離體木薯種莖影響的研究表明，低溫貯藏有助于減少種莖失水，降低糖酵解相關(guān)酶基因的表達(dá)，提高海藻糖含量，維持木薯種莖活力，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間，同時(shí)種莖海藻糖含量與種莖的失水脅迫呈強(qiáng)相關(guān)性，且低溫貯藏組相關(guān)系數(shù)小于常溫貯藏組，表明低溫貯藏組種莖中海藻糖含量更不易受失水影響。因此低溫貯藏方式有效，可以通過(guò)控制貯藏溫度的方式大批量貯藏木薯種莖，提高木薯種莖的成活率，最終有效提高木薯產(chǎn)量。