基于高通量測序的黑柄乳菇菌塘細菌多樣性分析

秦婉琳 馬永遠 李雙燕 伍燕

摘 要 乳菇系貴州食用菌“黔菌”品牌重點打造的項目之一。黑柄乳菇（Lactarius gerardii）屬于外生菌根菌，是一種美味的野生菌，市場價格不菲。為了解野生黑柄乳菇的菌根生境，給下一步研發(fā)黑柄乳菇的人工栽培技術(shù)奠定一些基礎，以黑柄乳菇菌塘土壤為研究對象，采用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學對來自于黔西南州不同地區(qū)的5個菌塘土壤的細菌組成及豐度進行研究。結(jié)果表明：黑柄乳菇菌塘菌群分屬于9個門27個屬，菌塘中主要門有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門;主要屬有伯克氏菌屬、緩生根瘤菌屬、Gp1、Gp2、Gp3、假單胞菌屬和WPS-1 genera incertae sedis。五個采集點菌塘中的菌群豐富，多樣性指數(shù)水準高，但因各個菌塘生境不同使得每個菌塘的優(yōu)勢菌屬豐度有差異。

關(guān)鍵詞 黑柄乳菇;菌塘;高通量測序;細菌;菌落多樣性

中圖分類號：S646.1;S182 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.11.001

黑柄乳菇（Lactarius gerardii）又名茅草菌，隸屬傘菌目（Agaricales）紅菇科（Russulaceae）乳菇屬（Lactarius），菌蓋和菌柄呈黑褐色，菌褶白色延伸至菌柄，菌肉白色、質(zhì)脆，受傷后會溢出白色乳漿，因此又叫黑蓋奶漿菌;夏季多生長在針闊混交林地上，是一種美味的野生菌[1]。圖1（參見封三）為野生黑柄乳菇子實體，采集地點為興義市萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園松林下。乳菇屬在貴州比較常見，例如松乳菇（紫花菌）、多汁乳菇、紅汁乳菇、靚麗乳菇等[2-3]。近年研究表明，通過人工合成松乳菇菌體并接種到天然馬尾松林下，能得到松乳菇子實體[4-9]。松乳菇營養(yǎng)豐富，含多種氨基酸和微量元素，具有增強機體免疫力、抗氧化和抗腫瘤等生物活性[10-15]，松乳菇的栽培成功對開發(fā)利用黔西南地區(qū)的黑柄乳菇具有參考價值。

菌塘（Shiro）是由子實體的根部菌絲、宿主根系及周圍的腐殖質(zhì)土壤扭結(jié)形成的顆粒狀結(jié)構(gòu)，是真菌菌絲體萌發(fā)和形成子實體的重要條件[16-17]。深入研究菌塘，對于開發(fā)人工馴化技術(shù)，了解菇類栽培土壤細菌群的組成及豐度非常重要。本文以黔西南州的野生黑柄乳菇菌塘土壤為研究對象，高通量測序菌塘菌群后采用統(tǒng)計聚類的方法確定不同樣本優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)的分型，旨在探究黑柄乳菇生境土壤微生物群落特征，找出優(yōu)勢菌群、分析共性并得出規(guī)律性認識，為下一步研發(fā)黑柄乳菇的人工栽培技術(shù)奠定一些基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品采集

選取黑柄乳菇出產(chǎn)豐富的五個采集點：興義市萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園（WT）、安龍縣新橋鎮(zhèn)（XQ）、安龍縣海子鎮(zhèn)（HZ）、安龍縣平樂鎮(zhèn)（PL）、安龍縣龍廣鎮(zhèn)（LG）。每個地點選取黑柄乳菇成簇生長的菌塘，在距菌根2 cm半徑周圍處取土樣，混合后放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2? 藥品及試劑

Qubit3.0 DNA檢測試劑盒，美國Life公司;E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒，美國OMEGA公司;2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物技術(shù)公司;MagicPure Size Selection DNA Beads，北京全式金生物技術(shù)公司。

1.2? 儀器和設備

Pico-21臺式離心機，美國賽默飛公司;Bio-Rad PCR擴增儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司;Q32866 Qubit? 3.0熒光計，美國英杰生物技術(shù)公司;DYCZ-21電泳槽、DYY-6C型電泳儀電源，北京市六一儀器廠。

1.3? 方法

1.3.1? 樣品預處理

稱取200 mg土樣，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL PBS緩沖液混勻，10 000 rpm室溫離心3 min，棄上清，樣品干燥待用。

1.3.2? 總DNA提取和檢測

按照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit使用說明操作提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

1.3.3? PCR擴增及測序

宏基因組測序類群為細菌;擴增區(qū)域為細菌V3～V4變區(qū)，引物1為341F：CCTACGGGNGGCWGCAG，引物2為805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC，測序平臺為Miseq，由生工生物工程（上海）公司完成。

1.3.4? 數(shù)據(jù)分析

高通量測序序列（reads）通過拼接、過濾、去除嵌合體及非特異性擴增序列，進行OTU（Operational Taxonomic Unit）聚類分析和物種分類學分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，對OTU進行多樣性指數(shù)分析、多樣性的群落組成分析，對系統(tǒng)發(fā)育信息進行Beta多樣性分析、分組檢驗分析、差異顯著性檢驗、環(huán)境因子分析等深入的統(tǒng)計學和可視化擬合。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 菌塘Alpha多樣性指數(shù)分析

表1為各個菌塘土壤高通量測序數(shù)據(jù)Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果，可以反映所測微生物群落的豐度和多樣性。由表可知，五個菌塘土樣測序共得到140 903條有效序列，過濾后得到4 385個有效OTU，樣品的Coverage指數(shù)≥0.99，覆蓋率高，能真實反映樣品的測序情況。

樣品的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)反映群落分布豐度（Communit richness），數(shù)值越大說明樣本的菌群分布豐度越好;Shannoneven指數(shù)越高或Simpson指數(shù)越低，說明采樣點的菌群多樣性較豐富。從表1可以看出，龍廣（LG）菌落較豐富、多樣性較好。

圖2為五個菌塘菌群樣品的稀釋曲線，Shannon指數(shù)先呈直線上升，后趨向平穩(wěn)，表明測序數(shù)據(jù)能較好地覆蓋菌塘中菌群的信息序列，曲線在平滑穩(wěn)定后產(chǎn)出的OTU數(shù)趨于穩(wěn)定，其中來自海子（HZ）的樣品Shannon指數(shù)稍低，說明該采集地的細菌多樣性低于其余四個菌塘。

2.2? 各樣品中細菌類群的相關(guān)性分析

圖3（參見封三）為五個菌塘菌群基于OTU序列所作的聚類樹，可以看出HZ和PL聚成一類，并和LG、XQ位于同一簇上，WT位于較遠分支，直觀反映了各個菌塘菌群的相似性和差異關(guān)系。

圖4（參見封三）的韋恩圖為各個菌塘菌群間OTU關(guān)聯(lián)分析，反映了各自生境中土壤菌群的復雜性和共性。五個菌塘共有的OTU數(shù)是471個，各個菌塘菌群互有重疊，反映的是菌塘間的共性;不重疊部分除了萬屯（WT）較多，有104個OTU外，其余菌塘均較少。除了萬屯（WT）位于生態(tài)公園內(nèi)，人類活動影響較小之外，其余四個采集地都在安龍縣農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果直觀反映出各菌塘土壤基質(zhì)微生物種類相似性和差異性。

2.3? 菌塘中細菌組成分析

五個菌塘細菌菌群歸屬于9個門，即變形菌門（Proteobacteria，68.88%～43.97%）、酸桿菌門（Acidobacteria，30.24%～10.33%）、放線菌門（Actinobacteria，15.70%～4.78%）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、candidate_division_WPS-1、綠彎菌門（Chloroflexi）和candidate_division_WPS-2，從圖5（參見封三）中可知，以變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為主。

由圖6（參見封三）可見，各菌塘在屬級水平上比較豐度，有27個屬，平樂（PL）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，7.52%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，5.89%）、Gp1（7.02%）;萬屯（WT）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，6.35%）、根瘤菌屬（Rhizobium，5.6%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，5.55%）;新橋（XQ）菌塘主要的屬有伯克氏菌屬（Burkholderia，9.53%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，5.67%）、Gp1（4.39%）;海子（HZ）菌塘主要的屬有Gp1（10.24%）、Gp2（9.5%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，8.86%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，6.54%）;龍廣（LG）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，6.51%）、Gp2（4.72%）、Gp1（4.16%）。

結(jié)合各個菌塘門、屬水平統(tǒng)計及表2所列前幾種優(yōu)勢屬可知，各個菌塘中的優(yōu)勢菌門和屬均是變形菌門及其下屬，這些菌群能起到固氮及吸收轉(zhuǎn)化磷、鉀等無機鹽的作用，并與黑柄乳菇菌絲、土壤腐殖質(zhì)等扭結(jié)形成菌根菌共生體，外部表現(xiàn)為根瘤形態(tài)。同時注意到各個菌塘的酸桿菌門及酸桿菌屬Gp1、Gp2和Gp3含量較高，通常認為這些菌增多可對被污染土壤進行修復。

3? 結(jié)論

采用高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學對黔西南州的野生黑柄乳菇五個菌塘進行分析，對菌群的組成和豐度形成了一個規(guī)律性的認識。各個菌塘中以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門為主，菌群的組成類型變化不大但豐度上有區(qū)別，例如萬屯（WT）菌塘變形菌門豐度達到68.88%，龍廣（LG）菌塘變形菌門豐度為43.97%;海子（HZ）菌塘酸桿菌門豐度為30.24%，萬屯（WT）菌塘酸桿菌門豐度為10.33%。采樣點萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園環(huán)境保護相對較好，土壤有機質(zhì)豐富，黑柄乳菇生活的菌塘中以固氮和轉(zhuǎn)化磷、鉀元素為主的變形菌門居多[18-19];海子鎮(zhèn)是安龍縣糧食主產(chǎn)區(qū)，自然環(huán)境受人類生產(chǎn)活動影響較大，與萬屯相比酸桿菌門豐度較高（通常認為在人類生產(chǎn)活動較多的環(huán)境，例如過度施肥、噴施農(nóng)藥等會引起土壤中酸桿菌屬含量升高）。酸桿菌門的Gp1、Gp2、Gp3能降低土壤中的重金屬和農(nóng)藥污染[20]，有助于恢復土壤生態(tài)。

乳菇作為貴州食用菌“黔菌”品牌重點打造的項目之一，其中的松乳菇已有少量人工栽培，但遠不能滿足市場需要。興義野生黑柄乳菇在當?shù)爻霎a(chǎn)豐富，味道鮮美，深受消費者喜愛，市場價格也在逐年攀升。對黑柄乳菇的菌塘菌群組成和豐度開展研究，進行深入了解，對下一步做“精”、做“特”食用菌產(chǎn)業(yè)具有理論指導意義。通過本次分析，發(fā)現(xiàn)生境中的酸桿菌門菌群較豐富，說明人類在野生菌產(chǎn)出區(qū)域活動過于頻繁，對土壤的理化性質(zhì)已造成影響，提醒我們注意保護當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境，保護野生黑柄乳菇及其他野生食用菌的可持續(xù)生長和出產(chǎn)品質(zhì)。

參考文獻：

[1]? 戴玉成，周麗偉，楊祝良，等.中國食用菌名錄[J].菌物學報，2010，29（1）：1-21.

[2]? 易筑剛，陳春旭，陳華，等.貴州兩種乳菇的鑒定及同源性分析[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2021，36（7）：766-770.

[3]? 陳新，康恒，邊銀丙.乳菇類外生菌根食用菌研究進展[J].菌物學報，2018，37（12）：1562-1571.

[4]? 鄭華英，徐麗麗，徐明.松乳菇松林下栽培及產(chǎn)菇情況初步研究[J].江蘇林業(yè)科技，2020，47（5）：28-31.

[5]? 王迪，何曉蘭，熊衛(wèi)萍，等.人工合成松乳菇菌根及雜菌侵染宿主的形態(tài)學觀察和分子鑒定[J].食用菌學報，2021，28（3）：129-134.

[6]? 易筑剛，陳春旭，陳華，等.松乳菇目的菌宿主辨識方法及非目的菌清除實驗效果分析[J].貴州林業(yè)科技，2021，49（4）：46-50.

[7]? 譚云，申愛榮，譚著明，等.紅汁乳菇培養(yǎng)基和菌株優(yōu)選[J].湖南林業(yè)科技，2021，48（6）：1-8.

[8]? 徐彥軍.3種松乳菇菌種在不同培養(yǎng)基中生長表現(xiàn)[J].種子，2020，39（11）：107-109.

[9]? 鄭旋，康超，楊玲，王晶，等.不同分離培養(yǎng)條件對松乳菇菌絲的影響研究[J].種子科技，2020，38（15）：16-17.

[10] 王秋艷，丁慧敏，朱亞男，等.多汁乳菇多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J].食品工業(yè)科技，2021，42（24）：313-319.

[11] 宋盛英，王勇，蘇上，等.橙黃色、紫褐色松乳菇的營養(yǎng)成分比較[J].食用菌，2020，42（1）：60-62.

[12] 白瑞，鮑中英，段淑紅，等.松乳菇多糖治療原發(fā)性肝癌的細胞實驗及機制[J].臨床與病理雜志，2019，39（10）：2110-2117.

[13] 陳璇，高慧，馮麗娜，等.燕山山脈一種香料型乳菇的香味成分分析[J].菌物學報，2019，38（10）：

1670-1680.

[14] 龔燕思，林菲菲，黃仁鴻，等.多汁乳菇對糖尿病小鼠血糖的影響[J].中國臨床藥理學雜志，2019，35（18）：2068-2070.

[15] 江波，胡芬，何標.松乳菇多糖通過PI3K/Akt信號通路對人骨肉瘤細胞MG-63裸鼠移植瘤生長的抑制作用[J].中國藥師，2019，22（9）：1591-1595.

[16] 徐漫，傅婉秋，戴傳超，等.外生菌根真菌促生微生物生態(tài)功能研究進展[J].生態(tài)學雜志，2018，37（4）：1246-1256.

[17] 于文海，左園園，劉平穩(wěn).外生菌根食用菌研究概況[J].現(xiàn)代食品，2018（15）：23-26.

[18] 劉平靜，肖杰，孫本華，等.長期不同施肥措施下土細菌群落結(jié)構(gòu)變化及其主要影響因素[J].植物營養(yǎng)與肥料學報，2020，26（2）：307-315.

[19] 吳慶梅，黃寶靈，呂成群，等.不同松林根際促生菌的數(shù)量研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2009，40（5）：521-526.

[20] 王繼玥，劉燕，劉勇，等.基于高通量測序檢測Pb污染對三葉草根際土壤細菌多樣性的影響[J].環(huán)境科學研究，2018，31（1）：102-110.

收稿日期：2022-01-25

基金項目：2021年貴州省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項目（S202110666097）。

作者簡介：秦婉琳（2001—），女，貴州畢節(jié)人，在讀本科生。

*為通信作者：伍燕（1974—），女，碩士，教授，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)應用研究。E-mail：767692523@qq.com。