利巴韋林、 磷酸氯喹、 鹽酸阿比多爾等抗病毒藥物的紅外光譜表征

陳靖奕，朱 南，昝佳男，肖子康，鄭 晶，劉 暢，沈 睿，王 芳, *，劉云飛，蔣 玲

1. 南京曉莊學(xué)院電子工程學(xué)院，江蘇 南京 211171 2. 南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210019 3. 南京林業(yè)大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210037

引 言

磷酸氯喹(chloroquine phosphate)，利巴韋林(ribavirin)和鹽酸阿比多爾(arbidol hydrochloride)為經(jīng)過臨床試驗被認(rèn)為治療新冠肺炎有效的臨床藥物[1-2]，均被列入《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中。 自新冠肺炎(COVID-19)疫情發(fā)生以來，國內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)正在加快推進(jìn)新冠病毒(SARS-CoV-2)抗體藥物的研發(fā)。 藥物多晶型與藥物的熔點、 穩(wěn)定性、 溶解性、 密度等物理化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，從而影響藥效及藥物間的相互作用[3]。 在制藥工藝中，將這些性質(zhì)與加工特性、 儲存特性結(jié)合在一起考慮是非常必要的。 研究發(fā)現(xiàn)，利巴韋林作為臨床一線抗病毒治療藥物，用于病毒引起的肺炎、 支氣管炎、 皮膚皰疹等疾病的治療。 其存在晶A、 晶B、 晶C、 和晶D四種晶型[4]。 藥動學(xué)實驗表明，只有晶A型在臨床治療中有顯著優(yōu)勢。 遠(yuǎn)紅外光譜技術(shù)(以下稱之為： 太赫茲光譜技術(shù))作為一種快速檢測手段，可表征分子間的弱相互作用，如氫鍵、 范德華力、 晶格間的堆積力等。 多項研究表明[5]，利用太赫茲光譜技術(shù)可以快速篩選出優(yōu)勢晶型藥物，大大地縮短了研發(fā)時間，降低了研發(fā)成本。

高溫、 高濕以及暴露時間均是影響藥物穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，輕則影響治療效果，重則關(guān)乎生命安全。 傳統(tǒng)的藥物穩(wěn)定性檢測手段包括質(zhì)譜分析法、 拉曼光譜分析法、 紅外光譜分析法(特指中紅外)、 熱重分析法、 X射線粉末衍射分析法以及掃描電子顯微分析法等在判別藥物結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性時均存在一定的弊端，不能同時將結(jié)構(gòu)、 晶型、 甚至生產(chǎn)工藝給藥效帶來的影響反映到圖譜的變化上。

通過測試和分析三種臨床試驗認(rèn)為治療新冠肺炎有效藥物： 磷酸氯喹，利巴韋林和鹽酸阿比多爾的遠(yuǎn)紅外(以下稱之為太赫茲)和中紅外(以下稱之為紅外)光譜，獲取每種藥物光譜中所有特征峰位置，并通過理論分析得到其對應(yīng)的振動模式。 不僅可以有效地檢測藥物結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，發(fā)生了什么改變，還可以實時監(jiān)測優(yōu)勢藥物晶型是否在向其他晶型轉(zhuǎn)變。 該研究對深入理解磷酸氯喹，利巴韋林和鹽酸阿比多爾等抗病毒藥物的藥學(xué)特性，藥物間相互作用，控制藥物生產(chǎn)過程，指導(dǎo)藥物存儲和使用有重大意義。

1 實驗部分

1.1 儀器

采用德國布魯克公司的VERTEX 80V型傅里葉紅外光譜儀，頻譜范圍為： 10～15 500 cm-1，通過不同的光學(xué)選件，來覆蓋遠(yuǎn)紅外、 中紅外和近紅外光譜區(qū)域。 中紅外波段有效頻率范圍為： 400～4 000 cm-1； 遠(yuǎn)紅外波段配置4個分束器： 6，25，50和125 μm，本工作選擇的是6 μm分束器，有效頻率范圍為： 30～680 cm-1(0.9～20.4 THz)； 真空環(huán)境下的分辨率可達(dá)2 cm-1； 信噪比優(yōu)于50 000∶1(峰-峰值)。 中紅外光譜測試時，光學(xué)腔始終保持在真空環(huán)境，樣品腔處在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下； 遠(yuǎn)紅外光譜測試時，通過給樣品腔和光學(xué)腔抽真空的方式減少環(huán)境中水汽對光譜的影響。 所有測試均在室溫下完成，測試原理和方法已經(jīng)在前期研究中詳細(xì)闡述，在這里不再贅述[6]。

1.2 樣品制備

三種抗病毒藥物磷酸氯喹(C18H26ClN3·2H3PO4)，利巴韋林(C8H12N4O5)和鹽酸阿比多爾(C22H25BrN2O3S·HCl)購于Sigma-Aldrich公司，純度99%以上，樣品測試前均未經(jīng)進(jìn)一步純化。 由于樣品在遠(yuǎn)紅外波段的吸收很強(qiáng)，光譜測試前，將純樣與聚乙烯粉末以1∶10的質(zhì)量比混合，研磨均勻后壓成0.5～1 mm厚，直徑為13 mm的薄片。 同時制備純聚乙烯樣品薄片作為測試背景，純聚乙烯樣品的質(zhì)量需與測試樣品中聚乙烯含量(質(zhì)量)相同，這樣可以排除聚乙烯吸收的影響。 中紅外光譜測試前樣品制備相對簡單，只需將一定質(zhì)量的樣品跟溴化鉀混合，充分研磨后壓成直徑為13 mm的透明薄片即可。

1.3 方法

以利巴韋林為例，計算了其基于晶體結(jié)構(gòu)的振動光譜； 初始晶體結(jié)構(gòu)來自劍橋晶體庫，對應(yīng)的refcode為VIRAZL[7]，正交(斜方)晶型，晶格參數(shù)為：a=14.863，b=7.512，c=8.788，α=90.000，β=90.000，γ=90.000。 其單分子和單晶胞結(jié)構(gòu)如圖1所示，每個晶胞包含4個單分子。 利用Crystal14軟件計算得到優(yōu)化后結(jié)構(gòu)的振動光譜，計算結(jié)果無虛頻，選擇B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組，同時添加了GRIMME倫敦色散校正系數(shù)，TOLINTEG=(10 10 10 10 20)。

圖1 利巴韋林單分子(優(yōu)化后, a)和晶體(b)結(jié)構(gòu)Fig.1 The monomer (after optimization, a) andcrystal structure (b) of Ribavirin

因磷酸氯喹和鹽酸阿比多爾分子量較大，需要耗費較多的計算資源，且劍橋晶體庫中沒有合適的晶體結(jié)構(gòu)，故只計算了其優(yōu)化后單分子結(jié)構(gòu)的振動光譜。 優(yōu)化前和優(yōu)化后的磷酸氯喹和鹽酸阿比多爾單分子結(jié)構(gòu)見圖S1，磷酸氯喹經(jīng)優(yōu)化后磷酸分子中O—H鍵均被拉長，其中O50—H53鍵拉長后發(fā)生斷裂，使得N16—H53之間形成了氫鍵。 利用Guassian16軟件，結(jié)合密度泛函理論(density functional theory，DFT)，選擇B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組進(jìn)行理論振動光譜分析，計算結(jié)果無虛頻，擬合半寬高均為4 cm-1。

圖S1 優(yōu)化前(a)和優(yōu)化后(b)的鹽酸阿比多爾和 磷酸氯喹單分子結(jié)構(gòu)Fig.S1 The structures of Arbidol hydrochloride and Chloroquine phosphate before (a) and after (b) optimization

2 結(jié)果與討論

2.1 太赫茲光譜表征研究

鹽酸阿比多爾、 利巴韋林和磷酸氯喹等三種抗病毒藥物的太赫茲理論(基于單分子結(jié)構(gòu))和實驗光譜，如圖2所示。 因理論計算初始結(jié)構(gòu)基于單分子，只考慮了分子內(nèi)的相互作用力； 而實驗光譜基于無定形固態(tài)晶體結(jié)構(gòu)，除了分子內(nèi)的相互作用力外，還存在分子間的相互作用力，理論研究表明這些分子間的弱相互作用力(如晶胞堆積力、 氫鍵和范德華力等)均落在太赫茲波段[8]，這就造成了理論和實驗光譜之間存在一定的偏差。 從圖2(b)可以看出，鹽酸阿比多爾特征峰主要位于： 2.24，3.14，3.72，4.25和5.38 THz附近； 利巴韋林特征峰主要位于： 2.01，2.68，3.37，4.05，4.83，5.45，5.92，6.42和7.14 THz附近； 磷酸氯喹特征峰主要位于： 1.26，1.87，2.37，3.06，3.78，5.09和6.06 THz附近。 鹽酸阿比多爾主要振動模式源于HCl和H2O分子的面外搖擺，除此之外還伴隨著苯硫甲基、 吲哚、 二甲氨甲基和羥基的振轉(zhuǎn)動； 利巴韋林的主要振動模式來自集體振動以及呋喃核糖基和羧酰胺的面外搖擺； 磷酸氯喹的主要振動模式源自磷酸分子和二乙基的振轉(zhuǎn)動。

圖2 三種抗病毒藥物的理論(a, 基于單體)和 實驗光譜(b)對比Fig.2 Comparison of theoretical (a, based on the monomer) and experimental (b) spectra of three antiviral drugs

前期，我們對構(gòu)成DNA/RNA的堿基、 堿基對、 特征片段的太赫茲光譜詳細(xì)研究[9-13]后發(fā)現(xiàn)，太赫茲光譜反映的是分子內(nèi)和分子間的一種集體振動，無論是單體、 二聚體還是多聚體的理論光譜均不能很好的重現(xiàn)實驗結(jié)果。 只有將考慮了周期性邊界條件的晶體結(jié)構(gòu)作為理論計算的初始構(gòu)型，才能讓理論和實驗結(jié)果一致吻合。 圖3為利巴韋林理論(基于晶體)和實驗光譜對比圖，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，除部分特征峰發(fā)生了簡并外，理論與實驗光譜較為吻合，說明考慮了周期性邊界條件的密度泛函理論可以較好地描述實驗結(jié)果。

圖3 利巴韋林太赫茲實驗和理論(基于晶體)光譜對比Fig.3 Comparison of experimental and calculation (based on the crystal) THz spectra of Ribavirin

表1給出了利巴韋林實驗和理論(基于晶體)太赫茲光譜中所有特征峰位置及其對應(yīng)的振動模式，從表中可以看出，10 THz以下的振動模式均表現(xiàn)為晶胞中所有分子參與的集體振動，以三氮唑的面外彎曲、 羧酰胺的面外擺動和呋喃核糖基的弱面內(nèi)伸縮為主。

表1 利巴韋林實驗和理論(基于晶體)太赫茲光譜特征峰位置及其對應(yīng)的振動模式

2.2 中紅外光譜表征研究

太赫茲光譜主要源于分子的集體振動，分子結(jié)構(gòu)和晶型的改變、 甚至生產(chǎn)工藝上的差異均能使其光譜發(fā)生變化，但也因其振動模式過于復(fù)雜，難以精準(zhǔn)解析。 中紅外光譜主要源自部分基團(tuán)或者原子的振動，雖只能將結(jié)構(gòu)的變化反映到光譜的變化上，但因其振動模式簡單，可對光譜精準(zhǔn)解析。 將太赫茲光譜和中紅外光譜相結(jié)合，既可以從結(jié)構(gòu)、 晶型、 生產(chǎn)工藝上發(fā)現(xiàn)分子間的差異，還可對光譜進(jìn)行比較深入的解析。

圖4為鹽酸阿比多爾實驗和理論(基于單體)中紅外光譜圖，有效頻率范圍為400～4 000 cm-1，因1 800～2 800 cm-1范圍內(nèi)無特征，故略去。 從圖中可以看出，理論和實驗光譜較為吻合。 因理論計算基于諧振子模型，而實驗環(huán)境復(fù)雜，一般會通過給理論光譜乘上一個頻率校正因子，來消除理論偏差，校正因子的大小取決于選擇的理論計算方法和基組。 文中選擇基于密度泛函理論(DFT)的B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組，故乘上了0.977的頻率校正因子[14]。

表2列出了鹽酸阿比多爾在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)中紅外光譜中所有特征峰位置及其對應(yīng)的主要振動模式。 從表中可以看出，鹽酸分子的振動峰在483 cm-1附近； 苯硫甲基的振動峰主要在687，741和3 117 cm-1附近； 吲哚、 二甲氨甲基、 羧酸乙酯和甲基的振動貫穿整個中紅外波段。 2 800 cm-1以下，基團(tuán)的振動以面內(nèi)外彎曲和搖擺為主； 2 800 cm-1以上，基團(tuán)的振動過渡為面內(nèi)伸縮。

圖5為磷酸氯喹實驗和理論(基于單體)中紅外光譜圖，有效頻率范圍為400～4 000 cm-1，因1 800～2 400 cm-1范圍內(nèi)無特征，故略去。 從圖中可以看出，理論和實驗光譜較為吻合。 為了消除理論計算帶來的偏差，同樣乘上0.977的頻率校正因子[14]。

圖4 鹽酸阿比多爾實驗(a)和理論(b, 基于單體)中紅外光譜對比圖，頻率范圍400～4 000 cm-1Fig.4 Comparison of the experimental (a) and calculated (b, based on the monomer) MIR spectraof Abidol hydrochloride ranging between 400 and 4 000 cm-1

表2 鹽酸阿比多爾實驗和理論(基于單體)中紅外光譜特征峰位置及其對應(yīng)的振動模式Table 2 Experimental and calculated (based on the monomer) MIR vibration frequenciesand corresponding vibrational modes for Abidol hydrochloride

續(xù)表2

圖5 磷酸氯喹實驗(a)和理論(b, 基于單體)中紅外光譜對比圖，頻率范圍400～4 000 cm-1Fig.5 Comparison of the experimental (a) and calculated (b, based on the monomer) MIR spectraof Chloroquine phosphate ranging between 400 and 4 000 cm-1

表S1列出了磷酸氯喹在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)中紅外光譜中所有特征峰位置及其對應(yīng)的主要振動模式。 從表中可以看出，磷酸的振動峰主要集中在500～1 400 cm-1范圍內(nèi)，呈現(xiàn)面內(nèi)外彎曲和搖擺； 1 400～1 600 cm-1范圍內(nèi)，以喹啉基、 二乙基和戊二胺的面內(nèi)搖擺和彎曲為主； 2 600 cm-1以上，基團(tuán)的振動過渡為N—H，O—H和 C—H鍵面內(nèi)伸縮。

圖6為利巴韋林實驗(與《藥品紅外光譜集第一卷》結(jié)果吻合，光譜號22)和理論(基于單體和晶體)中紅外光譜圖，有效頻率范圍為400～4 000 cm-1，因1 800～2 800 cm-1范圍內(nèi)無特征，故略去。 為了消除理論計算帶來的偏差，也乘上0.977的頻率校正因子[14]。 與前面不同的是，用于理論計算的初始結(jié)構(gòu)除了單體外，還對比了考慮周期性邊界條件的晶體。 我們發(fā)現(xiàn)，考慮了周期性邊界條件的晶體結(jié)構(gòu)的理論光譜與實驗光譜吻合得更好，尤其是400～1 000 cm-1。 這說明，即便中紅外光譜主要來自基團(tuán)的振動，分子內(nèi)作用力起主導(dǎo)作用，也不可忽視分子間的作用力，尤其在1 000 cm-1以下的低頻段。 要精準(zhǔn)地描述中紅外光譜中特征峰的振動模式，最好以晶體結(jié)構(gòu)作為理論計算的初始構(gòu)型。

表S1 磷酸氯喹實驗和理論(基于單體)中紅外光譜特征峰位置及其對應(yīng)的振動模式Table S1 Experimental and calculated (based on the monomer) MIR vibration frequenciesand corresponding vibrational modes for Chloroquine phosphate

圖6 利巴韋林實驗(a)和理論(b, 基于單體; c, 基于晶體)中紅外光譜對比圖，頻率范圍400～4000 cm-1Fig.6 Comparison of the experimental (a) and calculated (b, based on the monomer and (c) based on the crystal)MIR spectra of Ribavirin ranging between 400 and 4 000 cm-1

表S2列出了利巴韋林在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)中紅外光譜中所有特征峰位置及其對應(yīng)的主要振動模式。 從表中可以看出，1 000 cm-1以內(nèi)既存在分子內(nèi)作用力，也存在一些分子間作用力，如： 432 cm-1對應(yīng)的振動模式中，呋喃核糖上O—H鍵面內(nèi)搖擺屬于分子內(nèi)作用，羧酰胺上NH2鍵面外搖擺來自分子間作用。 1 000 cm-1以下的振動模式主要源自呋喃核糖基、 三氮唑和羧酰胺的面內(nèi)外彎曲和搖擺，1 000 cm-1以上的振動模式主要來自C—H，O—H，N—H和NH2鍵的面內(nèi)搖擺和伸縮。 同樣，2 800 cm-1以上，基團(tuán)的振動過渡為面內(nèi)伸縮。

表S2 利巴韋林實驗和理論(基于單體*和晶體#)中紅外光譜特征峰位置及其對應(yīng)的振動模式

續(xù)表S2

3 結(jié) 論

以磷酸氯喹，利巴韋林和鹽酸阿比多爾這三種廣譜抗病毒藥物為例，研究了它們的太赫茲和中紅外振動光譜，獲得了光譜中所有特征峰信息。 既可以從結(jié)構(gòu)、 晶型、 生產(chǎn)工藝上發(fā)現(xiàn)分子間的差異，還可以對光譜進(jìn)行比較深入的解析。

藥物多晶是藥物研發(fā)的壁壘之一，生產(chǎn)、 存儲和使用環(huán)境也是影響藥物穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。 紅外光譜技術(shù)可同時將結(jié)構(gòu)和晶型的變化反映到紅外圖譜上。 我們前期研究一種治療高磷酸鹽血癥藥物，四水合碳酸鑭時還發(fā)現(xiàn)，三種不同工藝獲得的藥物，擁有同樣的PXRD圖譜，但藥效卻相差甚遠(yuǎn)，利用太赫茲光譜可快速作出鑒別(與南京卡文迪許生物工程技術(shù)有限公司合作，已申請發(fā)明專利)，篩選出最優(yōu)藥物[15]。

以考慮了周期性邊界條件的利巴韋林晶體結(jié)構(gòu)為例，結(jié)合密度泛函理論和Crystal14軟件，選擇B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組，考慮倫敦色散校正系數(shù)，對其太赫茲和中紅外光譜進(jìn)行了表征。 研究表明，理論和實驗光譜一致吻合，太赫茲波段所有特征峰對應(yīng)的振動模式均源自所有原子參與的集體振動，主要表現(xiàn)為三氮唑的面外彎曲、 羧酰胺的面外搖擺和呋喃核糖基的弱面內(nèi)伸縮。 中紅外波段，以晶體結(jié)構(gòu)作為理論計算初始構(gòu)型的振動光譜比單分子結(jié)構(gòu)計算結(jié)果與實驗光譜更加吻合，尤其是400～1 000 cm-1的低頻波段，說明雖然中紅外光譜主要來自分子內(nèi)基團(tuán)和部分原子的振動，卻也有分子間的相互作用存在，要想精準(zhǔn)的表征特征峰的振動模式，最好選擇晶體結(jié)構(gòu)作為初始計算構(gòu)型。

結(jié)合密度泛函理論和Gaussian16軟件，選擇B3LYP雜化泛函和6-311++G(d,p)基組，對三種抗病毒藥物的中紅外光譜進(jìn)行了詳細(xì)表征，得到了所有特征峰對應(yīng)的振動模式。 發(fā)現(xiàn)，2 800 cm-1以下，振動模式主要源自基團(tuán)的面內(nèi)外彎曲和搖擺； 2 800 cm-1以上，振動模式過渡為C—H，O—H和N—H鍵的面內(nèi)伸縮。

我們期望，該項研究可以為藥物生產(chǎn)和存儲過程中控制生成目標(biāo)晶型藥物，抑制優(yōu)勢藥物晶型向其他晶型的轉(zhuǎn)化的快速檢測提供幫助； 為研究藥物的藥學(xué)特性、 藥物間相互作用，同時，為解決類似生產(chǎn)工藝等導(dǎo)致藥物藥效發(fā)揮等疑難雜癥問題提供借鑒。