抗TMV普通煙中N導(dǎo)入片段的特異分子標(biāo)記開發(fā)與交換單株篩選

劉勇，黃昌軍，陳姝敏，肖炳光，于海芹，袁誠，曾建敏，曹培健，李永平

生物技術(shù)

抗TMV普通煙中導(dǎo)入片段的特異分子標(biāo)記開發(fā)與交換單株篩選

劉勇1，黃昌軍1，陳姝敏2，肖炳光1，于海芹1，袁誠1，曾建敏1，曹培健3，李永平1

1 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家煙草基因工程研究中心，昆明，650021；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州 450001

【】導(dǎo)入片段賦予煙草品種對(duì)煙草花葉病毒（，TMV）抗性，但同時(shí)帶來產(chǎn)量低等連鎖累贅，為了篩選減少連鎖累贅的交換單株?！尽恳云胀煵葜械膶?dǎo)入片段為材料，利用茄科作物基因組序列數(shù)據(jù)和比較基因組學(xué)方法，開發(fā)了特異擴(kuò)增導(dǎo)入片段的系列分子標(biāo)記，通過分子標(biāo)記在種質(zhì)資源和分離群體中篩選交換單株?！尽块_發(fā)出23個(gè)導(dǎo)入片段特異的分子標(biāo)記，將攜帶導(dǎo)入片段的普通煙種質(zhì)劃分為Coker176、Samsun NN和Xanthi nc三種長度類型。供試90份抗TMV的普通煙資源中，85份屬于導(dǎo)入片段長度相對(duì)較短的Coker176類型，未發(fā)現(xiàn)比Coker176更短的種質(zhì)資源。利用導(dǎo)入片段末端分子標(biāo)記TN5.51，從不含基因的K326、Y87、5F、HD與Coker176配置的4個(gè)回交分離群體的22572株抗TMV單株中，篩選到11株導(dǎo)入片段交換單株， Coker176類型的導(dǎo)入片段在普通煙中的交換頻率為0.049%。其中24-8H等3個(gè)單株的導(dǎo)入片段縮短約一半，具有減少連鎖累贅的潛力。【】本研究獲得了普通煙中導(dǎo)入片段的系列分子標(biāo)記和長度縮短一半的交換單株，為解析導(dǎo)入片段連鎖累贅的分子機(jī)理、減少連鎖累贅奠定了基礎(chǔ)。

普通煙草；導(dǎo)入片段；分子標(biāo)記；交換單株

現(xiàn)代作物中的抗病基因大多通過種間雜交從攜帶抗病基因的野生種導(dǎo)入染色體導(dǎo)入片段(introgression segment)[1-2]，如煙草根黑腐病抗性[3-4]、小麥病蟲害抗性[5]。20世紀(jì)初，煙草野生種心葉煙（）被發(fā)現(xiàn)高抗煙草花葉病毒（，TMV）[6-9]。經(jīng)過近20年遠(yuǎn)源雜交，攜帶TMV抗性的心葉煙染色體被轉(zhuǎn)育至普通煙中，并逐漸縮短為包含基因的染色體片段（簡稱：導(dǎo)入片段）。隨后被廣泛應(yīng)用于白肋煙和烤煙品種抗TMV育種[10-14]。Whitham等[15]1994年克隆出基因、發(fā)現(xiàn)Samsun NN的部分導(dǎo)入片段替換了普通煙中T基因組序列。Lewis等[16]將抗TMV普通煙種質(zhì)資源Coker 176、Samsun NN等歸為第1組，提出導(dǎo)入片段整合在普通煙H染色體上，幾乎所有美國育種材料的導(dǎo)入片段位于H染色體上，將Xanthi nc、Xanthi NN歸為第2組，導(dǎo)入片段整合在普通煙未知染色體上，利用 AFLP標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Coker176的導(dǎo)入片段較小、Samsun NN的導(dǎo)入片段較大、Xanthi nc的導(dǎo)入片段最大。

研究發(fā)現(xiàn)栽培作物導(dǎo)入片段上與優(yōu)良抗病基因緊密連鎖的野生種基因組序列可能帶來連鎖累贅[2,17]。因?yàn)楫a(chǎn)量較低等連鎖累贅[18]，盡管TMV廣泛危害全世界煙草，卻只有約10%煙草種植者種植攜帶導(dǎo)入片段的煙草品種[6]。美國轉(zhuǎn)基因烤煙田間試驗(yàn)表明：基因本身無不利性狀、導(dǎo)入片段上與基因連鎖的心葉煙基因組序列導(dǎo)致連鎖累贅[17]。因此，縮短普通煙中的導(dǎo)入片段（保留基因減少其他心葉煙基因組序列），可減少連鎖累贅，從而提高基因的育種利用潛力[17]。但野生種導(dǎo)入片段在栽培種中很少發(fā)生染色體交換[17]、即使發(fā)生了交換也難以依靠表型篩選出交換單株。因?yàn)榭緹煯a(chǎn)量低等連鎖累贅表型屬于數(shù)量性狀，受環(huán)境條件的影響較大且難以測(cè)量。導(dǎo)致近50年來煙草育種未能縮短導(dǎo)入片段[19]。

分子標(biāo)記、基因組測(cè)序和生物信息學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)為研究作物種間雜交的導(dǎo)入片段創(chuàng)造了條件。目前抗TMV的心葉煙無公開的基因組序列，抗TMV的白肋煙品種TN90[20]、煙草野生祖先種和雖發(fā)布了基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，但尚未組裝為染色體物理圖譜[21]，不能滿足開發(fā)導(dǎo)入片段分子標(biāo)記的需要。與煙草同屬茄科植物的番茄發(fā)布了精細(xì)的基因組序列圖譜，番茄基因組中存在基因的同源體[22]。本研究根據(jù)茄科作物之間存在基因組共線性[22-24]，以栽培煙草中廣泛利用的Coker176類型的導(dǎo)入片段為材料，利用番茄基因組數(shù)據(jù)和比較基因組學(xué)的方法，開發(fā)了導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記，對(duì)90份普通煙資源的導(dǎo)入片段長度類型進(jìn)行劃分和評(píng)估。從上萬份回交群體單株中篩選到導(dǎo)入片段長度減半的交換單株。為解析導(dǎo)入片段連鎖累贅的分子機(jī)理、減少連鎖累贅奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草材料心葉煙、Coker176、Samsun NN、SR1(不含基因)，普通煙TMV抗性分離回交群體K326×C176，Y87×C176，5F×C176，HD×C176，90份抗TMV煙草枯斑資源（見表2）為云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保存。參考基因組序列(TN90 )[20]、和來自茄科作物基因組網(wǎng)（http://solgenomics.net/）。

1.2 DNA提取、PCR檢測(cè)

取煙草新鮮嫩葉，-80℃保存。采用CTAB方法或者Qiagen DNeasy 96 plant kit試劑盒（QIAGEN）提取煙草總基因組DNA。采用紫外分光光度法（Nanodrop）和瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測(cè)DNA質(zhì)量，去掉DNA濃度低于8 ng/μL的樣品。質(zhì)量合格的DNA樣品，用0.5×TE溶液稀釋至30～50 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系總體積均為20 μL，其中30～50 ng/μL DNA 樣品2.5 μL、10×PCR buffer 2.0 μL，dNTPs 1.2 μL，F(xiàn)/R引物各1.5 μL，rTaq 酶0.3 μL，ddH2O 12.6 μL。PCR反應(yīng)在Ependorff梯度擴(kuò)增儀上(Master Cycler )上進(jìn)行。擴(kuò)增的程序?yàn)椋?）94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4℃保存；采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 N導(dǎo)入片段分子標(biāo)記開發(fā)

參考番茄基因組采用比較基因組學(xué)的方法開發(fā)分子標(biāo)記，其原理為：烤煙和白肋煙等屬于分類學(xué)上的普通煙，普通煙為異源四倍體，兩個(gè)祖先種分別為和。普通煙的基因與或的同源基因的序列差異小。心葉煙在煙草屬的進(jìn)化樹上距離和較遠(yuǎn)。因此，心葉煙的基因與和的同源基因的序列差異較大。本研究以基因比對(duì)匹配值95%作為判斷序列差異標(biāo)準(zhǔn)，匹配值大于95%判斷為相同的基因、匹配值小于等于95%判斷為不同的基因。若某個(gè)基因不同于或的同源基因，則判斷該基因來源于心葉煙。具體為：以煙草抗TMV的基因序列（Genbank登錄號(hào)U15605.1）[15]，比對(duì)番茄基因組（http://solgenomics.net/）。挑選煙草基因匹配的番茄基因 Solyc11g011350.1.1，該基因位于番茄11號(hào)染色體的4.39 Mb處。為了便于估算距離，本研究中基因的特異分子標(biāo)記N1N2以TN4.39表示。調(diào)取番茄11號(hào)染色體4.39 Mb左右兩側(cè)1.5 Mb范圍內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)的低拷貝基因。對(duì)某個(gè)位點(diǎn)的低拷貝基因采用BLAST方法，分別調(diào)取TN90基因組中對(duì)應(yīng)的2條最佳匹配基因序列，將這2條基因序列與祖先種和基因組（http://solgenomics.net/）進(jìn)行BLASTn比對(duì)，分別選取比對(duì)值最高的一個(gè)結(jié)果。根據(jù)這2條基因序列與野生祖先種和比對(duì)匹配值判斷該基因是否來自心葉煙。若這2條基因序列在祖先種基因組比對(duì)匹配最高值均小于等于95%，則判斷該位點(diǎn)的基因來自心葉煙、替代了普通煙的基因。并根據(jù)TN90基因組數(shù)據(jù)庫中調(diào)取的序列，設(shè)計(jì)TN90特異引物。在Coker176，心葉煙，Samsun NN和 SR1(不含基因) 中擴(kuò)增，SR1無條帶而其他3份材料有特異條帶的引物為導(dǎo)入片段的特異標(biāo)記。若某個(gè)位點(diǎn)的2條序列在祖先種基因組比對(duì)匹配最好值均大于99%，則設(shè)計(jì)保守引物擴(kuò)增測(cè)序，根據(jù)測(cè)序序列設(shè)計(jì)心葉煙特異的引物，再次在上述品種中擴(kuò)增，如果心葉煙有特異條帶，則開發(fā)為導(dǎo)入片段的特異標(biāo)記，如果心葉煙無特異條帶，則表示該基因?yàn)槠胀熁蚧蚋叨缺Ｊ鼗騕25]。

1.4 資源中N導(dǎo)入片段的長度估算

首先采用基因的特異分子標(biāo)記N1N2鑒定出攜帶基因的普通煙種質(zhì)資源[16]。然后采用導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記（GL3.50，GL4.06，TN4.39(N1N2)，TN5.226，TN5.51）和普通煙標(biāo)記TN5.77檢測(cè)導(dǎo)入片段的長度[25]。根據(jù)導(dǎo)入片段的上鄰近的陽性和陰性標(biāo)記的相對(duì)番茄染色體物理位置估算長度。若距離基因近的一側(cè)標(biāo)記有特異擴(kuò)增產(chǎn)物、距離基因遠(yuǎn)的一側(cè)相鄰標(biāo)記無特異擴(kuò)增產(chǎn)物，表明該資源的導(dǎo)入片段末端位于這兩個(gè)標(biāo)記之間。

1.5 Coker 176回交群體中N導(dǎo)入片段的交換單株篩選

以普通煙品種Coker176為導(dǎo)入片段的供體，與不含基因的云煙87（Y87）、K326、紅花大金元（HD）和5F回交，獲得回交分離群體。塑料大棚內(nèi)在裝填漂浮育苗基質(zhì)的32孔盤中播種、定植3～4片的煙苗。4～5片時(shí)，用油漆毛刷摩擦接種TMV（TMV病葉汁液稀釋100倍）。控制塑料大棚內(nèi)氣溫不高于28℃。接種后3～5 d調(diào)查接種葉是否產(chǎn)生枯斑，拔除無枯斑的煙苗，將表現(xiàn)枯斑的煙苗重新定植至拔除的孔中。對(duì)枯斑單株編號(hào)，采集葉片樣品提取DNA。采用TN5.51標(biāo)記和E1E2標(biāo)記[16]PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。篩選出TN5.51標(biāo)記陰性且E1E2標(biāo)記陽性的交換單株。根據(jù)篩選的枯斑單株總數(shù)和交換單株總數(shù)，計(jì)算交換頻率。對(duì)交換單株采用導(dǎo)入片段的系列分子標(biāo)記評(píng)價(jià)導(dǎo)入片段的大小，確定每個(gè)交換單株距離基因最遠(yuǎn)的有特異擴(kuò)增（陽性）的分子標(biāo)記、距離基因最近的無特異擴(kuò)增（陰性）分子標(biāo)記。導(dǎo)入片段末端位于這兩個(gè)標(biāo)記之間，導(dǎo)入片段的大小采用距離基因最近的陰性標(biāo)記對(duì)應(yīng)的番茄基因組物理位置估算。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于基因組共線性開發(fā)N導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記

挑選番茄11號(hào)染色體Solyc11g011350.1.1基因左右兩側(cè)1.5 Mb的低拷貝基因，在Genbank中Blast確定基因的保守區(qū)域，根據(jù)基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對(duì)心葉煙、Samsun NN和SR1進(jìn)行 PCR擴(kuò)增測(cè)序。如果Samsun NN的擴(kuò)增序列與心葉煙的擴(kuò)增序列一致、并與SR1的擴(kuò)增序列存在多態(tài)性。則根據(jù)該基因的多態(tài)性設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)88對(duì)PCR引物。通過在心葉煙、Samsun NN（攜帶較長的導(dǎo)入片段）、Coker176（攜帶較短的導(dǎo)入片段）和SR1（無導(dǎo)入片段）的DNA中PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，共開發(fā)出23個(gè)導(dǎo)入片段特異擴(kuò)增的分子標(biāo)記（表1，圖1），標(biāo)記編號(hào)中的數(shù)字表示在番茄11號(hào)染色體上的物理位置，分布在番茄11號(hào)染色體3.50 Mb～5.51 Mb約2.01 Mb區(qū)域內(nèi)。

表1 特異擴(kuò)增導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記

Tab.1 The molecular marker of specific amplified N introgression segment

續(xù)表1

標(biāo)記名稱Marker name引物序列（5'-3'）Primer對(duì)應(yīng)番茄11號(hào)染色體的位置The location in tomato chromosome 11/Mb擴(kuò)增產(chǎn)物大小 Amplification production size/bpCoker176N. glutiosaSamsun NNSR1 TN5.05F: GGGGAGGTGTTGTTGATGTR: GGGATTTTATCCGTCTCACC5.05913+++- TN5.06F: GACCCAATAAAATCCCGCTAAR: CCCCATTCTCACCACTGTCT5.06860+++- TN5.10F: GGACGATATGATCTTTCGATTGR: AAACTGCTTTTGCACGTCCT5.10722+++- TN5.132F: GTCATGAAGCTTCCCCATGTR: ACGATTATCGGGACATCTG5.132632+++- TN5.13F: AAAACGAAAGCAGCGTAGGAR: TCCCTCCTATTGGGGAGTTT5.131031+++- TN5.14F: CCGTTTCGTTGTATGTGAAGGR: AACCAGAAGCCATCAGACCT5.141004+++- TN5.15F: GGGGTGAAGGATTTGGTGTTR: ACCTGGTCCACCTCTCCTTT5.15562+++- TN5.2F: CGACTTTCAAAGGGAATCCAR: TGCCTGCCAAGTGACTACAG5.2950+++- TN5.226F: TGTGGCAAGTTTTGAGAGTCAR: CCAAGGCTTATCCCAAACAA5.226650+++- TN5.26F: TCCAAGAATGCAGCAATGATR: TTTTCTTGTTTGACACGTGGA5.26700++-- TN5.34F: CACTTTGGCCTCTCACACAAR: AAACTTGTTCATAGTCTGCGAAT5.34648++-- TN5.38F :ACTTCGCCCTAGCTTGGATTR: GGTCCTTTTCCGTGCTATGA5.38688++-- TN5.44F: AGGAGCCTGTGAAACCAAAAR: GGAGCCCATATAACGAATGAC5.44600++-- TN5.46F: TTTTTCGTTGTTTTCGCACAR: ACCAGAGCGATTGTTTGGTC5.46885++-- TN5.49F: AGGACATGACCCCTGATTGTR: CATCGATTGCCAAGGAAAAT5.49620++-- TN5.51F: TTCGGGTTTTTAGTTCGGTTTR: AGGCACCATGTCACAAAACA5.51845++--

注：M: DL2000 marker，1：Coker176，2：心葉煙，3：Samsun NN，4：SR1。

Note: M: DL2000 marker，1：Coker176，2：，3：Samsun NN，4：SR1.

圖1導(dǎo)入片段特異分子標(biāo)記擴(kuò)增示意圖

Fig.1 Amplification schematic ofintrogression segment specific molecular marker

2.2 普通煙種質(zhì)資源N導(dǎo)入片段長度

對(duì)90份包含基因的普通煙種質(zhì)資源，采用5個(gè)導(dǎo)入片段特異和1個(gè)普通煙特異標(biāo)記檢測(cè)，可劃分為3種類型（表2）。Coker176類型包含85份資源， Coker176的TN4.39與TN5.51標(biāo)記檢測(cè)為陽性且GL4.06和TN5.77標(biāo)記檢測(cè)分別為陰性和陽性。TN4.39與TN5.51標(biāo)記在番茄11號(hào)染色體上的物理距離為1.12 Mb，GL4.06和TN5.77標(biāo)記的物理距離為1.71 Mb，因此，Coker176的導(dǎo)入片段長度為1.12～1.71 Mb之間（參比番茄11號(hào)染色體）。Xanthi nc包含2份資源，GL3.50標(biāo)記和TN5.51標(biāo)記檢測(cè)Xanthi nc為陽性，GL3.50標(biāo)記和TN5.51標(biāo)記在番茄11號(hào)染色體上的物理距離為2.01 Mb，因此Xanthi nc的導(dǎo)入片段長度為大于2.01 Mb（參比番茄11號(hào)染色體）。Samsun NN類型包含3份資源，GL3.50標(biāo)記和TN5.226標(biāo)記Samsun NN檢測(cè)為陽性、TN5.51標(biāo)記檢測(cè)為陰性。GL3.50標(biāo)記和TN5.226標(biāo)記在番茄11號(hào)染色體上的物理距離為1.72 Mb，因此Samsun NN的導(dǎo)入片段長度為大于1.72 Mb小于2.01 Mb（參比番茄11號(hào)染色體）。

表2 枯斑資源的導(dǎo)入片段長度

Tab.2 The length of the N introgression segment for the necrotic germplasms

2.3 普通煙中短N(yùn)導(dǎo)入片段篩選

利用導(dǎo)入片段上距離基因最遠(yuǎn)的分子標(biāo)記TN5.51，在Coker176作為導(dǎo)入片段供體親本的4個(gè)回交分離群體中，篩選TN5.51標(biāo)記為陰性且基因?yàn)殛栃缘慕粨Q單株。對(duì)獲得的交換單株采用分子標(biāo)記鑒定交換位點(diǎn)（表3）。結(jié)果表明，從苗期接種表現(xiàn)枯斑的22572株中篩選到交換單株11株。 Coker176長度類型的導(dǎo)入片段在普通煙（烤煙）中的交換頻率為0.049%。其中24-8H等3個(gè)交換單株的導(dǎo)入片段縮短了約50%（47.08%）。

表3 分離群體中導(dǎo)入片段交換單株的導(dǎo)入片段大小

Tab.3 The size of the N introgression segment of the exchange plant in the separation group

注：導(dǎo)入片段長度按照2.16 Mb計(jì)算。

Note: Theintrogression segment length is set to 2.16 Mb.

3 討論

茄科作物的抗病育種通常需要通過外源染色體導(dǎo)入片段的分子標(biāo)記來保留抗病基因、縮短導(dǎo)入片段。但是野生種導(dǎo)入片段在栽培種中發(fā)生染色體交換的頻率極低，導(dǎo)致利用栽培種分離群體開發(fā)野生種導(dǎo)入片段的特異分子標(biāo)記難度大[26]。高通量測(cè)序和基因組序列圖譜有助于開發(fā)分子標(biāo)記[27]，但重要的茄科作物基因組巨大，目前有些作物缺乏高質(zhì)量的基因組序列圖譜[28]，或已有高質(zhì)量基因組序列圖譜未包含野生種導(dǎo)入片段，不能用于開發(fā)野生種導(dǎo)入片段的特異分子標(biāo)記。而且，包含野生種導(dǎo)入片段的種質(zhì)資源基因組從頭測(cè)序成本高，組裝為高質(zhì)量基因組序列圖譜難度大。在上述情況下，開發(fā)栽培種中野生種導(dǎo)入片段分子標(biāo)記的一種選擇為：利用同科作物的高質(zhì)量基因組序列圖譜和共線性方法，開發(fā)尚未測(cè)序組裝的野生種導(dǎo)入片段的特異分子標(biāo)記，輔助組裝野生種導(dǎo)入片段的基因組序列。本研究采用染色體共線性方法首次開發(fā)了特異擴(kuò)增導(dǎo)入片段的系列分子標(biāo)記23個(gè)、分布在番茄11號(hào)染色體3.50～5.51 Mb，約2.01 Mb區(qū)域內(nèi)。

經(jīng)檢測(cè)云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保存的90份抗TMV普通煙枯斑資源（不包括野生煙和黃花煙等）屬于導(dǎo)入片段長度較短的Coker176類型，未發(fā)現(xiàn)比Coker176更短的抗TMV普通煙資源。90份資源包括中國、美國、巴西等國家歷年審定的烤煙和白肋煙品種。其中Vamorr48為美國1949年登記的抗TMV品種[29]、PVH01為巴西抗TMV品種。從1949年登記的Vamorr48至最近選育的烤煙和白肋煙品種[30]，導(dǎo)入片段都屬于Coker176類型，可見篩選出導(dǎo)入片段短于Coker176的煙草種質(zhì)資源概率極小。

綜上所述，利用分子標(biāo)記從人工創(chuàng)制的回交群體中，篩選更短導(dǎo)入片段材料是較為可行的選擇。本研究結(jié)果表明Coker176的基因在導(dǎo)入片段上是偏向分布的，基因位于導(dǎo)入片段的左末端，與基因連鎖的累贅基因位于右側(cè)的可能性較大。假定距離基因的物理距離越遠(yuǎn)、染色體交換概率越高，可優(yōu)先采用右側(cè)最末端的TN5.51標(biāo)記篩選交換單株。若獲得基因陽性且TN5.51標(biāo)記陰性的交換單株，再選用更多標(biāo)記檢測(cè)估算交換單株導(dǎo)入片段的長度，挑選N導(dǎo)入片段最短的單株用于抗病育種。本研究首次從Coker176回交群體中獲得導(dǎo)入片段縮短約一半的單株，為解析導(dǎo)入片段連鎖累贅的分子機(jī)理、減少連鎖累贅奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在缺乏組裝質(zhì)量高的導(dǎo)入片段煙草基因組情況下，利用煙草與番茄基因組共線性方法開發(fā)了特異擴(kuò)增導(dǎo)入片段分子標(biāo)記23個(gè)。采用分子標(biāo)記可將攜帶導(dǎo)入片段的普通煙種質(zhì)劃分為Coker176、Samsun NN和Xanthi nc三種類型。常見的普通煙枯斑資源屬于導(dǎo)入片段相對(duì)較短的Coker176類型，未發(fā)現(xiàn)比Coker176更短的資源。利用導(dǎo)入片段末端分子標(biāo)記TN5.51，從4個(gè)分離群體的22572株接種TMV表現(xiàn)枯斑反應(yīng)的單株中篩選到11株交換單株。其中24-8H等3個(gè)單株的導(dǎo)入片段縮短約一半，具有減少連鎖累贅的潛力。

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The development of molecular markers of theintrogression segment in(TMV) resistant tobacco germplasms and exchange plant screening

LIU Yong1*，HUANG Changjun1，CHEN Shumin2，XIAO Binguang1, YU Haiqin1，YUAN Cheng1, ZEN Jiagmin1, CAO Peijian3, LI Yongping1

1 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding, National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, China;2 Institute of Vegetables and Flowers, CAAS (Chinese Academy of Agricultural Sciences), Beijing 100081, China;3 Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC, Zhengzhou 450001, Henan, China

Many good disease-resistant genes incrop cultivars come from the chromosome introgression segment of wild species, but the non-target genome sequences on the exogenous chromosomes introgression segment may cause linkage drag, which limits the utilization of good genes of wild species. One of the well-known exogenous chromosome introgression segment in crop breeding is thegene (introgression segment) inintrogressed from. Theintrogression segment endows resistance against(TMV) while causing linkage drag in tobacco leaf production.To screen shortintrogression segment exchange plant,molecular markers specific to theintrogression segment were developed using the tomato genome as reference.A total of 23introgression segment specific molecular markers were developed. The markers are located in 3.50Mb ～ 5.77Mb of chromosome 11 of tomato reference genome. Using fiveintrogression segment specific markers and onespecific markers, three length types of introgression segments were distinguished, named Coker176, Samsun NN and Xanthi nc. Eighty-five from 95 testedgermplasms had relatively short introgression segments, which belong to the Coker176 type. No germplasm carrying shortersegment than the Coker176 was found. Using the introgression segment end molecule mark TN5.51, 11 exchange plants were screened from 22572 plants from 4 separation groups inoculated with TMV to show necrotic lesion. Theintrogression segment of the Coker176 length type has an average exchange frequency of 0.049% in. Among them, theintrogression segments of 24-8H and other 2 exchange plants were shortened by about half, showing the potential to reduce the linkage drags.The series molecular markers specific to theintrogression segment and the exchange plants with halfintrogression segment were developed, which provides a basis for analyzing the molecular mechanism of linkage drag and reducing the linkage drag.

;introgression segment; molecular marker; exchange plant

Corresponding author. Email：645312752@qq.com

劉勇，黃昌軍，陳姝敏，等. 抗TMV普通煙中N導(dǎo)入片段的特異分子標(biāo)記開發(fā)與交換單株篩選[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2022，28（3）.LIU Yong，HUANG Changjun，CHEN Shumin, et al. The development of molecular markers of the N introgression segment in tobacco mosaic virus (TMV) resistant tobacco germplasms and exchange plant screening[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(3). doi:10.16472/ j.chinatobacco. 2021.T0234

中國煙草總公司云南省公司科技項(xiàng)目“利用短N(yùn) 導(dǎo)入片段材料定向改良云煙87 品種TMV 抗性”（2018530000241003）

劉勇（1970—），博士，研究員，主要研究方向：煙草抗病育種，Tel：0871-65106352，Email：645312752@qq.com

2021-12-15；

2022-02-22