外源水楊酸對低溫脅迫下低溫敏感性不同的烤煙品種煙葉生理特性的影響

陳錦芬，侯爽，顧開元，郭金格，汪芬芬，鄒聰明，項巖所保，董華，孫浩巍，謝小玉*

農藝與調制

外源水楊酸對低溫脅迫下低溫敏感性不同的烤煙品種煙葉生理特性的影響

陳錦芬1，侯爽1，顧開元1，郭金格1，汪芬芬1，鄒聰明2，項巖所保3，董華3，孫浩巍4，謝小玉1*

1 西南大學農學與生物科技學院，重慶北碚 400715；2 云南省煙草農業(yè)科學研究院，云南昆明 657000；3 云南香料煙有限責任公司，云南保山 687800；4云南省煙草質量監(jiān)督檢測站，云南昆明 650106

【】探究低溫脅迫下外源水楊酸對低溫敏感型不同烤煙品種葉片生理特性的影響，并篩選最佳外源水楊酸的緩解濃度?！尽恳缘蜏夭幻舾行推贩N紅花大金元及低溫敏感型品種K326為材料，通過盆栽試驗研究不同濃度外源水楊酸對4℃低溫脅迫下紅花大金元和K326葉片相對電導率（REC）、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性、滲透調節(jié)物質含量及多酚代謝的影響?！尽康蜏孛{迫下，2個低溫敏感性不同的烤煙品種的相對電導率、丙二醛含量、多酚氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性均顯著上升，其中，K326的丙二醛含量上升幅度遠大于紅花大金元，達94.07%；而3個抗氧化酶活性均被顯著降低，K326的可溶性糖含量及總酚含量、紅花大金元的可溶性蛋白含量均顯著上升。施加外源水楊酸后，K326及紅花大金元的葉片相對電導率及丙二醛含量均顯著降低，而3個抗氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性均顯著上升，紅花大金元的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量、K326的總酚含量均顯著上升；當外源水楊酸濃度為50～100 mg/L時對各個指標的緩解效果較好。【】外源水楊酸濃度50 mg/L處理對紅花大金元及K326的緩解效果均達到最佳。

烤煙；低溫脅迫；外源水楊酸；生理特性

低溫是影響作物生長發(fā)育主要的非生物脅迫之一。低溫脅迫會抑制種子出芽、生長及發(fā)育[1]，打破光合[2]及抗氧化系統(tǒng)[3]、滲透調節(jié)物質的平衡，并降低植株的生物量[4]。煙草是典型的喜溫作物，對低溫的反應十分靈敏[5]。研究發(fā)現，低溫脅迫下，煙草幼苗的生長發(fā)育及光合作用受到抑制，抗氧化系統(tǒng)被破壞，導致代謝紊亂，造成抗逆性下降[6-7]。此外，若移栽時遭遇極端低溫，還會導致煙苗生長緩慢、早花且葉片形狀狹長[8]。這些都將導致煙葉的產量及質量受損。因此，研究煙草的抗寒機理，對促進其壯苗的培育及后期產量及品質的提升具有重要意義。

水楊酸是一種小分子酚類物質，也是一種調節(jié)植物響應外界脅迫的重要激素[9]。研究發(fā)現，水楊酸可以通過抑制活性氧的產生并促進活性氧的清除，以緩解低溫脅迫所造成的氧化傷害[10]。但是水楊酸在煙草體內含量很低[11]，故可以通過施加外源水楊酸誘導煙草產生抗逆性[12]。研究發(fā)現，外源水楊酸可通過提高蔗糖代謝水平、增強抗氧化酶活性、誘導抗寒基因的表達以及保護細胞超微結構等方式來增強植物的耐寒性[13-15]。

目前，已有許多關于煙草低溫脅迫的研究，但是低溫脅迫下外源水楊酸對不同抗性烤煙品種葉片生理特性的影響鮮見報道。本研究以低溫不敏感型烤煙品種紅花大金元及低溫敏感型烤煙品種K326為試驗材料，采用盆栽試驗方法探究低溫脅迫對煙草生理特性的影響及外源水楊酸對煙草抗氧化系統(tǒng)、滲透調節(jié)物質及多酚代謝的影響，探究外源水楊酸對提高煙草耐寒性的作用，并篩選最適水楊酸濃度，旨在為煙草冷害防控技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

以烤煙品種K326（低溫敏感型）及紅花大金元（以下簡稱紅大，低溫不敏感型）為材料，種子由玉溪中煙種子有限責任公司提供。

將種子分別播種于育苗盤中，待長出4片真葉時，選取長勢相對一致且健康的煙苗移至高為17 cm、直徑為15 cm的花盆中，按照常規(guī)管理方法供給水肥。在人工氣候培養(yǎng)箱（白天溫度為25℃，光照強度為20000 lx，夜間溫度為20℃，光照強度為0 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗）養(yǎng)至長出第9片真葉時在培養(yǎng)箱中進行4℃低溫脅迫處理3 d，之后采用隨機區(qū)組法設7個處理（見表1），每個處理3個重復，每個重復3盆煙苗。水楊酸處理組（S1～S5）分別于每天9：00—10：00根施50 mL不同濃度的外源水楊酸溶液，共施3 d；試驗對照組（CK）及脅迫對照組（CK0）以等量清水根施。于第7 d上午9：00開始取樣。

表1 試驗設計

Tab.1 Test design

1.2 取樣與測定方法

取樣：脅迫處理3 d后，選取各處理長勢較為一致的煙株5株，分別選取自上而下的第3片葉剪下用冰盒帶回，剪碎混勻后一部分用于相對電導率的測定，另一部分置于液氮中固定片刻后轉入超低溫冰箱保存并用于生理指標的測定。

相對電導率：稱取0.2 g煙葉剪碎置于20 mL去離子水中，真空抽提2～3次，在20℃～25℃恒溫下用電導儀測定電導率T1，測完再放入100℃沸水中水浴30 min，取出后自然冷卻至室溫測定煮后電導率T2，相對電導率（REC）=T1/T2×100%。

生理指標：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）及苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）及總酚（TP）含量的測定均采用相應試劑盒（上海優(yōu)選生物科技有限公司）測定。

1.3 數據分析

采用軟件Excel 2010對數據進行運算和作圖，采用SPSS 22.0鄧肯氏（Duncan’s）法進行方差分析。采用隸屬函數值法對低溫脅迫緩解程度進行分析：當緩釋劑的施用與該指標測定值呈正相關時，選用公式：Z(i) =（Zi–Zmin）/（Zmax–Zmin），呈負相關時則選用公式：Z(i) =1–（Zi–Zmin）/（Zmax–Zmin）。式中：Z(i)為某系列指標的隸屬值，Zi為某系列指標的測定值，Zmax為該系列指標測定的最大值，Zmin則是最小值，最后取所有指標的平均值即為該處理的綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下不同濃度外源水楊酸對煙葉相對電導率及丙二醛含量的影響

圖1A表明，4℃低溫脅迫下，煙葉的相對電導率顯著上升。其中，低溫敏感型品種K326顯著上升了69.45%，而低溫不敏感型品種紅大則顯著上升了61.10%。施用外源水楊酸以后煙葉的相對電導率下降，當其濃度為50 mg/L時，K326品種的相對電導率降幅最大，較CK0下降了25.84%；當外源水楊酸濃度為100 mg/L時，紅大的相對電導率較CK0下降了26.33%，與CK差異不顯著。

圖1B表明，4℃低溫處理使煙葉的丙二醛含量顯著增加，K326及紅大分別增加了94.07%和41.66%。施用外源水楊酸后K326煙葉的丙二醛含量顯著下降，分別較CK0下降了52.95%、52.65%、45.68%、14.77%及12.78%，其中，當水楊酸濃度為10～25 mg/L時緩解效果最好；當外源水楊酸的濃度為25 mg/L時對紅大的緩解效果最好，較低溫處理顯著降低了17.22%。

注：同一圖中不同大寫字母表示K326的處理差異顯著（<0.05），同一圖中不同小寫字母表示紅花大金元的處理差異顯著（<0.05），下同。

Note: Different uppercase letters means significant differences at level of＜0.05 in the treatment of K326, while different lowercase letters means significant differences at level of＜0.05 level in the treatment of Hongda, the same below.

圖1 低溫脅迫下不同濃度外源水楊酸對煙葉相對電導率及丙二醛含量的影響

Fig.1 Effects of different concentrations of SA on REC and MDA of tobacco leaves under low temperature stress

2.2 低溫脅迫下不同濃度外源水楊酸對煙葉抗氧化酶活性的影響

圖2A表明，低溫脅迫下，煙葉的SOD 活性顯著下降，K326及紅大分別較CK下降了11.78%及14.51%。隨著外源水楊酸濃度的上升，煙葉的SOD 活性呈先上升后下降的趨勢，當濃度為50 mg/L時，兩個品種的SOD活性均達到最高水平，其中，K326較CK0顯著上升了30.11%，紅大則顯著上升了34.50%。

圖2B表明，4℃低溫脅迫導致K326和紅大葉片的POD活性分別顯著下降了28.92%及15.83%。施加外源水楊酸可提高POD酶的活性，當其濃度為100～150 mg/L時，緩解效果最佳，其中，K326分別較CK0上升了41.92%和49.62%，紅大分別較CK0上升了31.25%及27.10%，差異顯著。

圖2C表明，4℃低溫脅迫下，K326及紅大煙葉的CAT酶活性分別下降了25.92%及18.46%。隨著根施外源水楊酸濃度的上升，K326的POD酶活性分別較CK0上升了31.92%、69.36%、104.53%、79.17%及37.56%，而紅大則分別較CK0 上升了44.02%、83.54%、66.82%、39.43%及26.66%，其中，濃度為50 mg/L的外源水楊酸對K326的CAT酶活性提升幅度最大，而紅大則在濃度為25 mg/L時上升幅度最大。

2.3 低溫脅迫下不同濃度外源水楊酸對煙葉滲透調節(jié)物質含量的影響

圖3A表明，4℃低溫脅迫下，低溫敏感型品種K326煙葉的可溶性糖含量較CK上升了47.71%，差異達顯著水平，而不敏感型品種紅大煙葉可溶性糖含量雖上升了30.29%但無顯著性差異。施用外源水楊酸后，紅大的可溶性糖含量持續(xù)上升。而K326的可溶性糖含量呈先上升后下降的趨勢，當外源水楊酸濃度>10 mg/L時，與CK0無顯著差異。其中，當外源水楊酸濃度分別為10 mg/L及25 mg/L時，K326及紅大的可溶性糖含量分別升高了25.71%、38.07%，達到最高。

圖3B表明，4℃低溫脅迫下，低溫敏感性品種K326的可溶性蛋白含量與CK相比差異不顯著，而低溫不敏感型品種紅大則顯著上升了54.71%。施加外源水楊酸以后煙葉的可溶性蛋白含量上升。隨著根施外源水楊酸濃度的上升，紅大分別較CK0顯著上升了14.32%、37.97%、79.04%、71.63%及60.36%，而K326則分別較CK0上升了23.98%、37.69%、67.94%、57.17%及52.96%。其中，外源水楊酸濃度為50 mg/L時，兩個品種的可溶性蛋白含量上升幅度均達到最大。

2.4 低溫脅迫下不同濃度外源水楊酸對煙葉多酚代謝的影響

圖4A表明，4℃低溫脅迫下，煙葉總酚含量升高。當外源水楊酸濃度為50 mg/L時，K326和紅大的總酚含量分別增加了9.32%和7.90%達到最高。

圖4B、C表明，4℃低溫脅迫顯著升高了PPO及PAL活性。施加外源水楊酸可繼續(xù)提高PPO及PAL活性。當外源水楊酸濃度為100 mg/L時，K326和紅大的PPO的酶活性分別升高了8.65%、20.22%，PAL的酶活性分別升高了45.38%和36.07%達到最高水平。

2.5 綜合評價

通過隸屬函數分析（表2）表明，當外源水楊酸濃度為50 mg/L時，兩個烤煙品種的緩解效果均達到最佳。

表2 外源水楊酸緩解低溫脅迫對不同烤煙品種傷害的綜合評價

Tab.2 Comprehensive evaluation of SA in alleviating the injury of different varieties of flue-cured tobacco under low temperature stress

3 討論

前人研究發(fā)現，低溫脅迫誘導葉片相對電導率及丙二醛含量顯著增加，施用外源緩釋劑以后，丙二醛的產生受到抑制，相對電導率也顯著降低[16]，這與本試驗的研究結果一致。產生這一現象的原因可能是因為低溫脅迫導致植物細胞膜脂過氧化，促進了丙二醛的大量產生，而當丙二醛含量在細胞中累積到一定程度時，相對電導率就會上升。此時，外源緩釋劑的施加保護了細胞膜的穩(wěn)定性，維持了細胞結構的完整性[17-18]。本研究發(fā)現，低溫脅迫對K326的影響大于紅花大金元，而在施加外源水楊酸以后，紅大煙葉的膜透性也總是小于K326。

低溫脅迫對抗氧化酶的活性產生影響，本研究發(fā)現，4℃低溫脅迫顯著降低了SOD、POD、CAT這3個酶的活性，根施水楊酸后酶活性上升，隨水楊酸濃度增加呈現先上升后下降的趨勢。這與張俊康等[19]及張翔等[14]的研究結果一致。說明重度低溫脅迫會導致植物體內的活性氧大量產生，氧化酶的活性在超負荷工作后會降低[20]。而外源水楊酸的緩解效果一是體現在其本身具有清除活性自由基的功能，二是通過提高抗氧化酶的活性和非酶類抗氧化物質的含量來促進活性氧的清除[21]。

植株在受到脅迫時，滲透調節(jié)物質含量顯著上升[22]。本研究發(fā)現，4℃低溫脅迫下兩個烤煙品種的可溶性糖含量均顯著上升，施加外源水楊酸后滲透調節(jié)物質的含量進一步提升，可維持胞內較高的滲透壓，防止植株因吸水困難而干枯[23]，與楊小環(huán)等[24]的研究結果一致。此外，隨著外源水楊酸濃度的上升，滲透調節(jié)物質的含量均呈現先上升后下降的趨勢，這可能是因為水楊酸也是一種植物體內的滲透調節(jié)物質，當其濃度太高時，為了保持細胞澎壓的穩(wěn)定，可溶性糖及可溶性蛋白的產生會受到抑制。

已有研究表明，低溫處理下植物總酚含量、苯丙氨酸解氨酶及多酚氧化酶的活性會有所上升[25]，與本研究結果一致。但周培祿等[26]卻在K326烤煙品種中發(fā)現煙葉總酚含量受低溫脅迫影響較小。本研究發(fā)現，低溫脅迫對耐寒品種紅花大金元的總酚含量影響較小，但是對低溫敏感型品種K326影響較大；施加外源水楊酸后，兩個烤煙品種的總酚含量、PAL及PPO的酶活性均有不同程度的提高，說明該舉措可能有利于增強煙苗的抗逆能力。

作物的抗寒性受多種因素同時影響，所以需利用多個指標綜合評價施加外源水楊酸對煙草的影響。前人研究發(fā)現，隸屬函數分析法在水稻[27]、棉花[28]、花生[29]等作物抗寒性研究上廣為應用，本研究利用隸屬函數分析法對兩個不同品種煙葉的相對電導率、丙二醛含量、3個抗氧化酶的活性、2個滲透調節(jié)物質含量及多酚代謝產物進行綜合分析。發(fā)現兩個烤煙品種施加外源水楊酸以后所表現的抗寒系數具有一致性，均在外源水楊酸濃度為50 mg/L時達到最佳。

4 結論

施加外源水楊酸能顯著降低低溫脅迫下煙草葉片的相對電導率、抑制丙二醛的產生，增強抗氧化酶活性、提高滲透調節(jié)物質，并促進總酚的產生及多酚代謝酶活性的提升。這對于煙草幼苗的低溫脅迫有明顯的緩解作用。通過隸屬函數分析發(fā)現，耐寒性品種紅大及冷敏感型品種K326均在外源水楊酸濃度為50 mg/L對4℃低溫脅迫的緩解效果最佳。

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Effects of exogenous salicylic acid on physiological characteristics of flue-cured tobacco leaves with low temperature sensitivity under low temperature stress

CHEN Jinfen1, HOU Shuang1, GU Kaiyuan1, GUO Jinge1, WANG Fenfen1, ZOU Congming2, XIANGYAN Suobao3, DONG Hua3, SUN Haowei4, XIE Xiaoyu1*

1 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China;2 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 657000, China;3 Yunnan Oriental Tobacco Co., Ltd, Baoshan 687800, China;4 Yunnan Tobacco Quality Inspection & Supervision Station, Kunming 650106, China

This study aims to explore the effects of exogenous salicylic acid on physiological characteristics of flue-cured tobacco leaves with low temperature sensitivity under low temperature stress, and to screen the optimal addition concentration of exogenous salicylic acid.A pot experiment was conducted with cold-tolerant variety Hongda and cold-sensitive variety K326 as materials. The effects of different concentrations of exogenous salicylic acid on relative electrical conductivity, malondialdehyde content, antioxidant enzyme activity, osmotic regulation substance content and polyphenol metabolism of tobacco leaves under low temperature stress at 4 ℃ were studied.The results showed that low temperature stress significantly increased relative electrical conductivity, malondialdehyde content, activity of PPO and PAL, and decreased antioxidant enzyme activity. Among them, the content of MDA in flue-cured tobacco variety K326 increased significantly by 94.07%,which was significantly higher than that of Hongda. Then, the contents of soluble sugar and total phenol of K326 and the Hongda’ssoluble protein content were increased significantly. After the application of exogenous salicylic acid, the relative conductivity and MDA content decreased significantly, while the activities of three antioxidant enzymes and PAL increased significantly. The contents of soluble sugar and soluble protein of Hongda and the total phenol content of K326 increased significantly. When the concentration of exogenous salicylic acid was 50～100 mg/L, the remission effect were better.When the concentration of exogenous salicylic acid was 50mg/L, the mitigation effect on the two varieties was the best.

flue-cured tobacco; low temperature stress; exogenous salicylic acid; physiological characteristics

Corresponding author. Email：xiexy8009@163.com

云南省煙草公司科技計劃重點項目“烤煙養(yǎng)分調控與烘烤特性相關性研究”（2020530000241025）；云南省技術創(chuàng)新人才項目（2019HB068）；云南省萬人計劃（YNWR-QNBJ-2018-400）

陳錦芬（1996—），碩士研究生，主要從事植物生理與分子生物學研究，Tel：023-68251264，Email：1252440242@qq.com

謝小玉（1968—），博士，教授，主要從事植物生理與分子生物學研究，Tel：023-68251264，Email：xiexy8009@163.com

2021-11-08；

2022-02-21

陳錦芬，侯爽，顧開元，等.外源水楊酸對低溫脅迫下低溫敏感性不同的烤煙品種煙葉生理特性的影響[J]. 中國煙草學報，2022，28（3）.CHEN Jinfen, HOU Shuang, GU Kaiyuan, et al. Effects of exogenous salicylic acid on physiological characteristics of flue-cured tobacco leaves with low temperature sensitivity under low temperature stress[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(3). doi:10.16472/ j.chinatobacco. 2021.218