基于抗炎生物效價的甘草傳統(tǒng)感官評價科學性研究△

王鈞楠，周永峰，崔園園，鞏穎，柏兆方，朱廣偉，華國棟，張萍*

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學中心，北京 100039；3.成都中醫(yī)藥大學 藥學院，四川 成都 611137；4.北京中醫(yī)藥大學 東方醫(yī)院，北京 100078；5.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700；6.北京中醫(yī)藥大學 東直門醫(yī)院，北京 100700

甘草來源于豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根及根莖[1]，是中藥大品種之一，在中藥應用中具有十分重要的地位，被譽為中藥中的“國老”。甘草質量是其臨床療效的保證。感官評價是甘草質量評價的一種重要方法，主要是根據藥材的形、色、氣味、斷面等性狀信息來判斷質量的優(yōu)劣，這種質量評價方法來源于古代臨床應用的總結，具有直觀簡便等優(yōu)勢[2]。但是由于這種傳統(tǒng)的評價方法存在主觀性較強等問題，其是否還適用于現代的甘草質量評價、能否準確反映其臨床活性的差異性有待進一步探討。

甘草調和諸藥，在臨床上應用廣泛，具有抗炎、保肝、調節(jié)免疫等多種藥理活性[3]?，F代研究表明，多種疾病的發(fā)生和發(fā)展都伴隨著炎癥的產生[3-6]，抑制炎癥反應是甘草發(fā)揮多種藥效作用的共性特征。因此，抗炎可能是甘草質量評價的一個重要指標。炎癥小體是炎癥反應的重要組成部分，與眾多炎癥性疾病及免疫性疾病密切相關，包括黑素瘤缺乏因子2（AIM2）、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）、NLR 家族CARD 結構域包含蛋白4（NLRC4）等[7]。NLRP3 炎癥小體是其中最具有特點的一種，能夠被多種刺激劑（如尼日利亞菌素、三磷酸腺苷等）激活，也因此成為目前國內外研究最廣泛、最深入的一類炎癥小體。激活后的炎癥小體可通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）對白細胞介素-1β（IL-1β）及IL-18 前體物質進行水解，最終產生并釋放活性IL-1β、IL-18 炎癥因子，介導炎癥反應的發(fā)生[8]。

本研究借助現代測量工具及分析儀器，將甘草的性狀特征定量化，與根據抗炎生物效價分級后的甘草樣品進行整合分析，考察各性狀特征與抗炎活性的關聯(lián)度，旨在考察甘草傳統(tǒng)感官評價能否準確地反映其抗炎活性，以期為甘草感官評價的實際應用提供參考，并為其科學性提供數據支持。

1 材料

1.1 儀器

CM-5型色彩色差儀（日本柯尼卡美能達公司）；FOX 3000 型電子鼻系統(tǒng)（法國Alpha MOS 公司）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）系統(tǒng)、TC10 型自動細胞計數儀均購自美國Bio-Rad公司；JJT1300型潔凈工作臺（北京冠鵬凈化設備有限公司）；TGL-16M 型臺式高速離心機、HERAcell vios 160i 型恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱均購自美國Thermo公司；HW·SY11-K 型電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；OV200 型臺式真空冷凍離心濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）；SN510C 型立式壓力蒸汽滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司）；OZ17581、OZ13247、OZ05171 型微量移液器（德國Eppendorf 公司）；Promega GloMax 20/20型發(fā)光檢測儀（美國Promega公司）。

1.2 實驗動物

無特定病原體（SPF）級C57BL/6 雌性小鼠2 只（9～11 周齡），購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，本研究經中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心審查，實驗動物倫理審查編號為IACUC-2020-0037。

1.3 試藥

DMEM 培養(yǎng)基（批號：K0111200）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：K0911200）、乙二胺四乙酸（EDTA，0.5 mol·L-1，批號：K1905010）、胰蛋白酶（Trypsin）-EDTA消化液（0.25%，批號：K1207050）均購自美國Macgene公司；opti-MEM培養(yǎng)基（批號：31985070，美國Gibco 公司）；巨噬細胞集落刺激因子（M-csf，批號：#87394）、MCC950（純度≥98%）均購于美國MedChemExpresss 公司；胎牛血清（FBS，批號：2037144，以色列Biolnd 公司）；尼日利亞菌素（Nigericin，批號：HY-100381）、脂多糖（LPS）均購自美國Invivogen 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號：1121E0327，德國Sigma-Aldrich 公司）；IL-1βELISA檢測試劑盒（批號：2018-3，北京達科為生物技術有限公司）；CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay（批號：0000418489）、Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay（批號：0000443211）均購自美國Promega 公司；NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）及Caspase-1 抗體均購自美國Adipogen公司；IL-1β抗體購自美國R&D 公司；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG 抗體及辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體購自美國Santa Cruz公司。

10 個批次甘草樣品編號S1～S10，批號分別為J180228001、H190077001-3、20032604、H190080001-3、H190074001-3、H190078001-3、C200015001、J170042001、H190075001-3、CA180140001，經解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心肝病研究所肖小河研究員鑒定均為烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch。

2 方法

2.1 供試品的制備

按照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版方法[1]制備甘草提取液，抽濾，精密吸取續(xù)濾液10 mL 分裝于專用離心管中，于臺式真空冷凍離心濃縮儀中揮干溶劑至恒重，-20 ℃保存，備用。給藥時現配現用，在離心管中加入opti-MEM 培養(yǎng)基1 mL 復溶，超聲30 min（250 W，40 kHz）使其溶解至無明顯固體顆粒，0.22 μm 微孔濾膜濾過后即得。

2.2 甘草抗炎生物效價的測定

2.2.1 細胞的獲取及培養(yǎng) 75%乙醇消毒后，取C57BL/6雌性小鼠后腿骨，將5 mL DMEM培養(yǎng)基用注射器注入骨髓，在裝有20 mL DMEM 培養(yǎng)基的離心管中反復吹打3 次，吹打過程中保持后腿骨在培養(yǎng)基液面以下，加入M-csf 5 μL，吹勻，將含有細胞的培養(yǎng)基轉移至細胞培養(yǎng)皿中，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。3 d 后，補充適量的DMEM 培養(yǎng)基和M-csf，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。然后，將貼壁的小鼠原代骨髓巨噬細胞（BMDM）用消化液[Trypsin-EDTA∶EDTA（2∶1）]消化1～2 min后，更換DMEM培養(yǎng)基，并制成細胞密度為1×106個/mL的培養(yǎng)基溶液，吸取含細胞的培養(yǎng)基500 μL于24孔細胞培養(yǎng)板孔內，于20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)至細胞貼壁。

對于建筑工程，采用以上介紹的裝配建筑方案無疑是一個非常好的選擇。根據該工程的特點，站內全部取消了建筑物，站內的35 kV、10 kV配電裝置均采用E-HOUSE集裝箱布置，二次設備采用預制式艙，均由廠家成套供應。土建施工單位僅需進行基礎施工即可。

2.2.2 NLRP3炎癥小體細胞模型的構建 首先，棄去24孔細胞培養(yǎng)板孔內的DMEM培養(yǎng)基，加入含有LPS（50 ng·mL-1）的opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內靜置4 h；然后，設置空白組、模型組及給藥組，棄去孔板內的opti-MEM 培養(yǎng)基，給藥組分別加入生藥質量濃度為0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1的甘草提取液，空白組及模型組加入等量opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內與細胞共培養(yǎng)1 h；最后，模型組及給藥組內加入Nigericin（50 μg·mL-1，DMSO）溶液，空白組加入含有等質量濃度DMSO 的opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃下共培養(yǎng)30 min，收集細胞上清液及裂解液。

2.2.3 關鍵指標的檢測 通過蛋白質印跡（Western blot）法對細胞上清液中的IL-1β、caspase-1蛋白及裂解液NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、ASC 等蛋白的表達進行檢測，并應用Image J 1.8.0軟件對目標蛋白條帶進行灰度值分析。取BMDM 上清液及裂解液前處理后，電泳，再經轉膜將蛋白條帶轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經過孵育相應的一抗及二抗，顯影，在X光片上顯示蛋白條帶。

通過Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay 檢測試劑盒對細胞上清液中caspase-1 的表達量進行檢測，具體操作按照試劑盒說明書進行。

通過酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）對細胞上清液中IL-1β的表達量進行檢測，具體操作按照IL-1βELISA檢測試劑盒說明書進行。

2.2.4 細胞存活率的檢測

通過CellTiter-Glo（CTG）發(fā)光法檢測細胞存活率。取培養(yǎng)至對數生長期的小鼠BMDM，分別設置空白孔、對照孔及梯度濃度給藥孔（生藥質量濃度分別為0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1），孵育6 h后，吸取細胞上清液50 μL轉移至96孔白板中，每孔加入CTG 溶液50 μL，振蕩1 min，測定各孔發(fā)光強度，并通過公式（1）計算細胞存活率。

2.2.5 生物效價的標化 IL-1β炎癥因子是NLRP3炎癥小體介導表達的下游關鍵蛋白，且實驗結果相對穩(wěn)定，故采用ELISA 測定法檢測IL-1β的表達量，來表征甘草的生物效價。

以MCC950 為陽性對照化合物，依據《中國藥典》2020 年版（四部）[9]【生物檢定統(tǒng)計法】項下的“量反應平行線法”對甘草醇提物抑制小鼠BMDM 分泌IL-1β活性的效價值進行標化。定義MCC950的生物效價為1000 U·mg-1，將抑制率和相應給藥濃度輸入效價計算軟件BioCalculate V2.0 得到各個批次甘草抑制小鼠BMDM分泌IL-1β的效價。

2.3 感官參數的數據采集

2.3.1 甘草斷面直徑（2R）的測量 10 個批次甘草樣品均為類圓形片，若為類橢圓形片，則以其短直徑作為斷面直徑測量結果。為了減小實驗誤差，每批次樣品隨機取3組，每組100個飲片作為測量對象[10]，記錄2R。

2.3.2 甘草色度的測定 色度常用的評價系統(tǒng)是CIE 1976L*a*b*標準色度系統(tǒng)，其中L*表示明度，a*和b*表示不同的色調方向。L*值越大明度越大，感覺越白；反之越暗。a*表示紅綠方向，+a*表示紅方向，-a*表示綠方向。b*表示黃藍方向，+b*表示黃方向，-b*表示藍方向[11]。

采用色彩色差儀對甘草粉末進行色度測量。取適量甘草粉末加入專用容器中，在容器底部平鋪成3～5 mm 厚度，校準儀器后，將其放置于測定凹槽內進行色度測量，記錄甘草樣品的L*、a*和b*值。每批次樣品重復測定3次，取其色度指標的平均值。

2.3.3 甘草氣味的測定 為了使樣品在利用電子鼻檢測時響應值達到最佳狀態(tài)，參考文獻[12-13]方法對樣品進樣量、頂空溫度及頂空時間進行單因素考察。精密稱取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 頂空瓶中，在頂空溫度40 ℃、頂空時間120 s 條件下，分別考察進樣量為500、1000、2000、2500 μL 時樣品的響應值；精密稱取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 頂空瓶中，在頂空時間120 s，進樣量2500 μL條件下，分別考察頂空溫度為40、45、50、55 ℃時樣品的響應值；精密稱取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 頂空瓶中，在頂空溫度55 ℃、進樣量2500 μL 條件下，分別考察頂空時間為120、240、360 s 時樣品的響應值。

經過單因素考察，確定電子鼻的檢測條件為進樣量2500 μL、頂空溫度55 ℃及頂空時間240 s，并采用自動頂空進樣方式，對甘草樣品進行氣味檢測。取同一批次甘草樣品（S7）重復測定5 次，計算12個傳感器的RSD 以考察電子鼻儀器精密度。12 個傳感 器LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTI、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2 的RSD 分 別 為1.449%、2.933%、2.211%、0.435%、3.278%、1.356%、1.756%、1.133%、1.343%、0.935%、1.641%、1.536%，RSD均小于4%，說明儀器精密度良好。以采集時間為橫坐標（X），各傳感器響應值為縱坐標（Y）繪制傳感器響應曲線，見圖1。

圖1 電子鼻系統(tǒng)12根傳感器對甘草氣味的響應強度曲線

按單因素考察后實驗條件采集多批次樣品的氣味數據，按公式（2）計算雷達圖面積（S），用于表征甘草的氣味信息，并以各傳感器最大值繪制雷達圖，見圖2。

圖2 12根傳感器對甘草氣味的雷達圖

式中a、b為兩傳感器響應值的點與雷達圖圓點連線圍成的三角形的兩邊長，c為兩邊的夾角，均為30°。

2.4 數據分析

將采集的甘草樣品感官數據及等級劃分數據導入Simca 14.1軟件中，進行主成分分析（PCA），并基于PCA 進行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA），以增大組間差異，更好地挖掘與甘草抗炎活性相關的關鍵感官參數。根據PCA 及OPLS-DA 的得分圖，判斷兩等級甘草樣品的差異。根據OPLSDA 的loading 圖及變量重要性投影（VIP）確定兩者間的差異成分，并通過獨立t檢驗分析兩者差異成分，驗證OPLS-DA結果。

3 結果

3.1 甘草提取物對LPS 聯(lián)合Nigericin 誘導的小鼠原代骨髓巨噬細胞NLRP3炎癥小體的影響

經過Western blot 法檢測空白組、模型組及給藥組BMDM 上清液及裂解液中各關鍵蛋白的表達（圖3A），再通過灰度值分析對關鍵蛋白IL-1β，caspase-1及其前體蛋白pro-IL-1β、pro-caspase-1 的條帶進行量化（圖3B～E），以判斷甘草提取物是否產生抑制作用。Lamin B 為細胞裂解液的上樣量對照，考馬斯藍（coomassie）染色為上清液的上樣量對照。實驗結果顯示，與模型組相比，給藥組細胞上清液中目的蛋白IL-1β、caspase-1 的灰度值明顯降低，即其表達量顯著減少，并且隨著給藥濃度的增大，2 種蛋白的表達量呈現逐漸減少的趨勢，而在裂解液中兩蛋白的前體蛋白pro-IL-1β及pro-caspase-1 的表達則恰恰相反，說明甘草提取物能夠抑制pro-IL-1β及pro-caspase-1 的剪切，從而抑制LPS 聯(lián)合Nigericin誘導的小鼠BMDM 細胞上清液中IL-1β、caspase-1蛋白的表達。甘草提取物對細胞裂解液中NLRP3、ASC蛋白表達無明顯影響。通過試劑盒進一步檢測IL-1β的表達及caspase-1的活性，結果見圖4A、B，發(fā)現甘草提取物對IL-1β的表達有抑制作用，并能夠抑制caspase-1的活性，且在質量濃度0.312 5～2.500 0 mg·mL-1呈一定的劑量依賴性；對甘草提取物的細胞毒性進行了檢測，結果見圖4 C，甘草提取物在質量濃度2.500 0 mg·mL-1時對BMDM 無毒性作用，故選取質量濃度0.312 5～2.500 0 mg·mL-1進行藥效檢測。

圖3 甘草提取物對LPS聯(lián)合Nigericin誘導的小鼠BMDM的NLRP3炎癥小體激活的抑制作用（n=2）

圖4 甘草提取物的細胞毒性及對LPS聯(lián)合Nigericin誘導的小鼠BMDM的NLRP3炎癥小體通路關鍵蛋白caspase-1及IL-1β表達的影響（, n=3）

3.2 甘草樣品生物效價的標化及分級

根據2.2.4 項下方法進行生物效價的標化，結果見表1。根據生物效價，將10 個批次甘草樣品分成2個等級，結果見表2。

表1 S1甘草提取物與MCC950的劑量及對應的IL-1β表達抑制率

表2 10個批次甘草樣品的抗炎生物效價及分級結果

3.3 甘草樣品的感官參數測定結果

根據2.2 項下各感官參數的測定方法對相應參數數據進行采集，結果見表3。

表3 10批次甘草樣品的斷面直徑、色度值及雷達圖面積

3.4 PCA及OPLS-DA結果及驗證

PCA 結果見圖5，將不同等級的甘草樣品分為兩類，說明兩等級甘草樣品在性狀特征方面存在一定的差異。進一步應用OPLS-DA 挖掘兩組甘草樣品的內在差異（圖6），R2X和R2Y分別表示所建模型對X 和Y 矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，理論上R2和Q2越接近1 說明模型的擬合準確性越好。該模型R2X=0.534，R2Y=0.863，Q2=0.75，說明模型的擬合能力較好，預測能力較強；loading 圖（圖7）和VIP 分析，loading 圖上距離原點越遠，VIP 值＞1的參數對模型的貢獻度較大，即成為差異性因素的可能性較大，因而b*和2R可能是導致兩組樣品差異的關鍵參數。

圖5 甘草樣品PCA得分

圖6 甘草樣品OPLS-DA得分

圖7 甘草樣品OPLS-DA的loading圖

將兩組甘草樣品的b*和2R實測值進行比較，結果見圖8，兩者b*的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而2R的差異無統(tǒng)計學意義。

圖8 兩等級甘草樣品的b*及2R的實測值比較

4 討論

近年來，已經有研究報道了甘草中的活性成分對NLRP3 炎癥小體的影響，并對其作用機制進行了深入研究。Li 等[14]研究發(fā)現，異甘草素通過抑制磷酸化核轉錄因子-?B（p-NF-?B）、NLRP3 的蛋白質的分泌，促進caspase-1、IL-1β和消皮素蛋白N 端（GSDMD-N）的裂解，上調微小核苷酸（miRNA）-27a mRNA 表達，并降低脾酪氨酸激酶（SYK）的mRNA 和蛋白質水平等方式抑制NLRP3 介導的焦亡。付書彬等[15]報道，甘草查耳酮A 可通過抑制caspase-1 前體的剪切，阻斷caspase-1 p20 介導的pro-IL-1β的成熟，抑制NLRP3 炎癥小體介導的免疫炎癥反應。Xu 等[16]也發(fā)現了甘草中的活性成分對NLRP3炎癥小體的抑制作用。目前，甘草提取物對炎癥小體的作用尚無人進行驗證，本研究在前人研究[14-16]的基礎上構建了炎癥小體細胞模型，確定了在體外甘草提取物對LPS 聯(lián)合Nigericin 誘導的小鼠BMDM的NLRP3炎癥小體激活的抑制作用，并通過檢測其下游關鍵蛋白IL-1β的表達量建立了不同批次甘草樣品的生物效價，為甘草質量評價提供新的方法。

自古以來，顏色就在甘草質量評價中占據了重要地位?！侗静萁浖ⅰ酚涊d：“赤皮斷理，……最佳……”[17]，《新編中藥志》記載：“甘草以皮細緊、色紅棕、斷面黃白色……為佳”[18]?？梢姡诠糯?，甘草以外皮色赤、色紅棕、斷面色黃白者為佳。隨著科技的進步，研究者們利用現代儀器對甘草的顏色進行了更深入的研究。曹光昭等[19]將甘草的止咳藥效與其色度值進行相關性分析，初步確定了b*與其止咳藥效的相關性。本研究通過現代機器視覺客觀量化了甘草的性狀參數，彌補了性狀評價方法過于依賴經驗的不足之處，大大提高了其客觀性，降低了因評價人員不同而導致的質量評價差異，并且經過進一步與其抗炎活性進行整合分析，確定了甘草的b*與甘草抗炎活性的相關性較強。但由于市場上多為烏拉爾甘草，本研究未收集到脹果甘草和光果甘草樣品，并且應用樣品量較小，可加大樣品量及其他基原甘草樣品進行進一步驗證。