基于UPLC-ABTS-PDA-Triple TOF/MS的辣木葉中抗氧化活性成分在線篩選

甘小娜，李廷釗，2，李波，2*

1.安利（中國(guó)）研發(fā)中心，上海 201203；2.安利（中國(guó)）植物研發(fā)中心，江蘇 無(wú)錫 214145

辣木為辣木科辣木屬落葉喬木辣木Moringa oleiferaLam.，起源于印度和非洲，主要分布于世界各地的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。辣木營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)突出，高纖維、高蛋白（氨基酸）、低脂肪，且富含維生素和礦物質(zhì)，被稱(chēng)為“素食黃金”“生命之樹(shù)”[3-4]。辣木葉不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其藥理作用也備受關(guān)注。近年來(lái)，化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)辣木葉含有黃酮、酚酸、硫苷、多糖等類(lèi)化合物[5-9]，具有良好的抗炎、抗菌、抗腫瘤、調(diào)血脂、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等活性[10-14]。辣木于20 世紀(jì)60 年代被引進(jìn)中國(guó)，目前在我國(guó)臺(tái)灣、云南、海南等地均有種植，并于2012 年11月12日被批準(zhǔn)為新資源食品。

自由基在體內(nèi)可氧化糖類(lèi)和脂質(zhì)，使蛋白變性、酶失活，從而引發(fā)動(dòng)脈硬化、高血壓、腫瘤等多種疾病[15]，因此，清除機(jī)體多余的自由基對(duì)治療相關(guān)疾病具有重要作用。目前已有不少文獻(xiàn)從清除自由基、抵抗光氧化損傷、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等方面對(duì)辣木的抗氧化活性進(jìn)行報(bào)道[12,16-17]，但大多是從其提取物的角度進(jìn)行評(píng)估，關(guān)于單體成分的研究相對(duì)較少。在線活性分析系統(tǒng)突破傳統(tǒng)天然成分活性分析的流程，集色譜分離與活性篩選于一體，具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于多種植物的活性成分快速篩選[18]。2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）是一種過(guò)氧化氫酶的底物，經(jīng)氧化后生成的自由基溶液對(duì)反應(yīng)體系具有較高的靈敏度，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于抗氧化活性的評(píng)估。本研究采用譜效結(jié)合的方法，使用超高效液相色譜-ABTS-二極管陣列檢測(cè)器-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-ABTSPDA-Triple TOF/MS）實(shí)現(xiàn)辣木葉中清除自由基活性物質(zhì)的快速篩選（圖1），為辣木葉活性成分研究及后期更好的開(kāi)發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 辣木葉中清除自由基活性物質(zhì)在線篩選系統(tǒng)示意圖

1 材料

1.1 儀器

液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：1290 型超高效液相色譜儀（包括自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵、柱溫箱和紫外檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司）串聯(lián)AB Sciex Triple TOF?4600型高分辨質(zhì)譜（Sciex 公司）；WF-600EHT 型超聲波清洗機(jī)（寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司）；XS2051/10 型萬(wàn)分之一電子天平、MS3002S 型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）；柱后反應(yīng)系統(tǒng)（包括溶劑管理器Reagent Manager、溫度控制模塊Temperature Control Module Ⅱ和柱后反應(yīng)模塊Post Column Reaction Module，Waters公司）。

1.2 試藥

辣木葉購(gòu)自云南西雙版納，由安利（中國(guó)）研發(fā)中心李波博士鑒定為辣木科植物辣木Moringa oleiferaLam.的葉，編號(hào)為SHRD-LMY，存放于安利（中國(guó)）研發(fā)中心樣品庫(kù)；對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：6361，純度≥99.4%）、新綠原酸（批號(hào)：3209，純度：99.3%）、隱綠原酸（批號(hào)：3208，純度≥98%）、維采寧-2（批號(hào)：3922，純度≥99.3%）、蘆?。ㄅ?hào)：5932，純度≥98.5%）、異牡荊素（批號(hào)：7449，純度≥99.3%）、牡荊素（批號(hào)：3593，純度≥99.9%）、異葒草苷（批號(hào)：4044，純度≥99.9%）、異槲皮苷（批號(hào)：8029，純度≥99.0%）、紫云英苷（批號(hào)：7346，純度≥98.7%）均購(gòu)于上海詩(shī)丹德公司；色譜純甲醇和乙腈均購(gòu)于德國(guó)Merck 公司；分析純乙醇購(gòu)于General-Reagent 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；色譜純甲酸（美國(guó)Honeywell 公司）；對(duì)照品水溶性維生素E（Trolox）（批 號(hào)：P1656511，純 度≥98.0%）、ABTS、過(guò)硫酸鉀[K2(SO4)2]均購(gòu)于Adamas Reagent公司；超純水采用美國(guó)密理博Milli-Q 型超純水機(jī)制備。

2 方法

2.1 辣木葉提取物抗氧化活性成分的鑒定

2.1.1 供試品溶液的制備 取辣木葉樣品50 g，加10 倍量超純水浸泡1 h 后水浴回流提取1.5 h，趁熱濾過(guò)，殘?jiān)偌? 倍量超純水提取1 h，趁熱濾過(guò)，合并2 次濾液，低溫真空濃縮至一定體積，然后進(jìn)行冷凍干燥，得辣木葉的水提取物（得率為19.4%）。精密稱(chēng)取辣木葉提取物25 mg，加50%甲醇10 mL，超聲提取10 min，濾過(guò)，即得。

2.1.2 ABTS 自由基溶液的制備 ABTS 自由基溶液的制備參考本課題組前期建立的方法[19]，取適量ABTS 和K2(SO4)2進(jìn)行反應(yīng)，最終得到在729 nm 波長(zhǎng)下吸光度值為0.70±0.02的自由基溶液。

2.1.3 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%乙酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%乙酸乙腈溶液，梯度洗脫（0～18 min，11%～13%B；18～36 min，13%～30%B；36～43 min，30%～70%B；43～52 min，70%～90%B；52～60 min，90%～11%B）；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為327、729 nm；流速為0.6 mL·min-1；進(jìn)樣體積為3 μL。

2.1.4 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為ESI-模式，一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)掃描范圍為m/z50～1800；離子源氣體1 壓力為344.7 kPa；離子源氣體2壓力為344.7 kPa；氣簾氣壓力為241.3 kPa；噴霧電壓為-4500 kV；離子源溫度為500 ℃；去簇電壓為100 V；碰撞能量為10 eV；二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)掃描范圍為m/z50～1250；去簇電壓為100 V；碰撞能量為±40 eV。

2.1.5 柱后反應(yīng)系統(tǒng)條件 反應(yīng)圈溫度為37.5 ℃；流速為0.3 mL·min-1。

2.1.6 辣木葉中抗氧化活性成分的鑒定 按照?qǐng)D1進(jìn)行進(jìn)樣分析，通過(guò)路徑A 得到辣木葉的指紋圖譜及質(zhì)譜信息，結(jié)合文獻(xiàn)和對(duì)照品信息對(duì)其中的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；通過(guò)路徑B 得到辣木葉中的在線抗氧化圖譜，與指紋圖譜保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，推斷辣木葉中的抗氧化活性成分。

2.2 活性化合物驗(yàn)證

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取Trolox對(duì)照品粉末適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg·mL-1的系列溶液，待用。

2.2.2 化合物單體及提取物的配制 精密稱(chēng)取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷對(duì)照品適量，分別加甲醇配成0.3 mg·mL-1的溶液；取辣木葉水提物適量，加超純水配成3 mg·mL-1的溶液，超聲提取15 min，濾過(guò)，待用。

2.2.3 吸光度的測(cè)定 取待測(cè)樣品30 μL，加ABTS自由基溶液5 mL，暗處反應(yīng)15 min，取200 μL轉(zhuǎn)移至96孔板，于729 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。

2.2.4 Trolox 當(dāng)量抗氧化能力（TEAC）值的計(jì)算 ABTS自由基清除活性用TEAC值來(lái)評(píng)價(jià)。以對(duì)照品Trolox 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以相對(duì)吸光度值（即空白溶液的吸光度值與對(duì)照品的吸光度值的差值）為縱坐標(biāo)（Y），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；按照公式（1）～（2）計(jì)算TEAC值。

式中，b為對(duì)照品Trolox 的質(zhì)量濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中的截距，k為該方程的斜率，A0為空白溶液的吸光度值，As為待測(cè)樣品的吸光度值，C為待測(cè)樣品的質(zhì)量濃度。

2.2.5 清除率的計(jì)算 辣木葉中化合物的抗氧化能力以其對(duì)自由基的清除率來(lái)衡量，按公式（3）計(jì)算。

式中，HO為辣木葉中化合物在波長(zhǎng)327 nm 下的峰高，HS為其清除ABTS 自由基后于波長(zhǎng)729 nm 下形成的負(fù)吸收峰峰高。

3 結(jié)果

3.1 辣木葉提取物化學(xué)成分的鑒定

采用UPLC-Q-TOF/MS，根據(jù)樣品多級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合天然產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)，部分化合物采用對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，對(duì)辣木葉樣品進(jìn)行分析，鑒定出21 個(gè)化合物（表1、圖2），主要為硫苷、苯丙素和黃酮類(lèi)等化合物，其中黃酮又包括碳苷黃酮和氧苷黃酮。

圖2 辣木葉提取物的質(zhì)譜基峰離子色譜圖

表1 辣木葉樣品主要成分鑒定結(jié)果

3.2 抗氧化活性成分的確定

供試品溶液經(jīng)路徑B，在柱后衍生系統(tǒng)中與自由基溶液反應(yīng)后，由PDA 記錄色譜信號(hào)，有自由基清除活性的化合物在729 nm 波長(zhǎng)下有負(fù)吸收峰，見(jiàn)圖3。由圖3可知，化合物新綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)具有自由基清除活性。

圖3 辣木葉水提物UPLC圖和在線抗氧化圖譜

3.3 清除率的計(jì)算

計(jì)算得到辣木葉中各主要活性化合物對(duì)自由基的清除能力，見(jiàn)圖4。3 個(gè)苯丙素類(lèi)化合物新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的清除率分別2.00、2.03、1.90，3個(gè)黃酮類(lèi)化合物蘆丁、異槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷) 的清除率分別為2.97、2.89、2.98。

圖4 辣木葉中各主要活性化合物的自由基清除率（,n=3）

3.4 活性化合物的驗(yàn)證

以對(duì)照品Trolox 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.365 4X-0.004 9(r=0.999 8）。以公式（2）計(jì)算各待測(cè)樣品的TEAC值，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 辣木葉提取物及各化合物樣品的TEAC值（,n=3）

4 討論

本研究通過(guò)UPLC-Q-TOF/MS 從辣木葉中共鑒定出化合物21個(gè)，其中包括黃酮類(lèi)化合物13個(gè)（黃酮氧苷9 個(gè)、黃酮碳苷4 個(gè)）、苯丙素類(lèi)化合物4 個(gè)、硫苷類(lèi)化合物4 個(gè)。運(yùn)用在線抗氧化活性成分快速分析方法鑒定了6 個(gè)主要的抗氧化活性成分，其中包括3 個(gè)苯丙素類(lèi)化合物（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸）和3 個(gè)黃酮類(lèi)化合物[蘆丁、異槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)]。在以ABTS 自由基作為抗氧化篩選試劑時(shí)，硫苷類(lèi)化合物和碳苷黃酮抗氧化活性較低，可能是這類(lèi)化合物的酚羥基數(shù)目、立體結(jié)構(gòu)和電性因素不利其發(fā)揮清除ABTS 自由基的作用[27]；而苯丙素類(lèi)化合物和以槲皮素為苷元的黃酮類(lèi)化合物均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，這可能與化合物的結(jié)構(gòu)及酚羥基數(shù)目有關(guān)。

本研究參考文獻(xiàn)[28]對(duì)活性化合物的自由基清除率進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同類(lèi)型化合物之間自由基清除率差異不大；在不同類(lèi)型化合物之間，由于最大吸收波長(zhǎng)差異較大，使其在相同質(zhì)量濃度同一波長(zhǎng)下的正峰高呈現(xiàn)較大差異，因此用該方法對(duì)不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型化合物的自由基清除活性進(jìn)行比較可能不太準(zhǔn)確；繼而本研究采用線下活性評(píng)價(jià)方法對(duì)各化合物的ABTS 自由基清除活性進(jìn)行驗(yàn)證比較，研究結(jié)果顯示其抗氧化活性為異槲皮苷＞蘆丁＞Trolox＞新綠原酸＞綠原酸＞隱綠原酸。本研究為辣木葉天然產(chǎn)物中抗氧化活性成分的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。