不同產(chǎn)地和不同品種枸杞子中多糖成分測定

王瑩，時銳，張南平，辜冬琳，昝珂，劉越，金紅宇，馬雙成

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

枸杞作為藥食兩用產(chǎn)品，在東亞等地區(qū)已具有兩千多年的使用歷史[1]。枸杞作為強壯滋補藥品，具有益精明目、延緩衰老、滋補肝腎等功效[2]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品?！吨袊参镏尽分杏杏涊d的枸杞屬植物大約有80 多種[3]，市場上廣泛應(yīng)用的種為寧夏枸杞Lycium barbarmL.和北方枸杞L.chinenseMill.var.potaninii（Pojark.）A.M.Lu?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版收載的枸杞子為寧夏枸杞的干燥成熟果實，這也是目前市場上的主流產(chǎn)品。北方枸杞為枸杞Lycium chineseMill.的變種，廣泛分布于河北北部、山西北部、陜西北部等地。在枸杞商品規(guī)格的質(zhì)量評價中，主要從性狀特點判定其優(yōu)劣，如顆粒大小、色澤等[4]，這種評判方法具有一定的局限性?！吨袊幍洹?020 年版規(guī)定以枸杞多糖和甜菜堿作為枸杞主要質(zhì)量控制指標(biāo)，其中規(guī)定多糖質(zhì)量分數(shù)不得少于1.8%，甜菜堿質(zhì)量分數(shù)不得少于0.5%[5]。

多糖為枸杞的主要成分且是重要的功效成分，已有研究表明，枸杞多糖（LBP）具有多種生物學(xué)活性，包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)血脂、降血糖、視網(wǎng)膜保護和保肝等[6]。不同產(chǎn)地及不同品種枸杞中多糖成分是否存在差異，是影響枸杞質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一?！吨袊幍洹?020 年版（一部）采用苯酚硫酸法測定LBP 含量，此法雖然可以從一定程度上表明多糖含量，但無法體現(xiàn)多糖結(jié)構(gòu)特征，無法揭示不同產(chǎn)地及不同品種枸杞中多糖成分的差異性。鑒于此，近年來已有部分學(xué)者通過多糖結(jié)構(gòu)分析，對不同產(chǎn)地LBP進行比較。Wu等[7]測定了50余批不同產(chǎn)地寧夏枸杞中多糖成分的重均相對分子質(zhì)量（Mw），同時進行比較以評價枸杞質(zhì)量；Liu 等[8]通過建立LBP 多元指紋圖譜對不同產(chǎn)地枸杞質(zhì)量進行評價。但目前此類研究主要集中于《中國藥典》2020年版記載品種寧夏枸杞的測定，對不同品種枸杞中多糖成分的分析鮮有報道。同時有研究指出，關(guān)于LBP 的報道雖多，但大部分研究為市場購買產(chǎn)品，多存在樣品產(chǎn)地及品種不確定的問題[9]。

為了深入探索不同品種及不同產(chǎn)地LBP 的差異性，本課題組分別從寧夏、青海、新疆、河北種植基地收集了多份枸杞樣品，并經(jīng)過性狀和顯微特征進一步確定其種，以保證來源正確。同時對其總糖含量、Mw及單糖組成進行測定，最終為枸杞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善及資源評價提供參考。

1 材料

LC-20AD 型高效液相色譜儀-示差檢測器、LC-20AD 型高效液相色譜儀-光電二極管陣列檢測器、UV-2700 型紫外分光光度計均購于日本島津公司；十八角度激光光散射儀（美國Wyatt公司）。

Zorbax Eclipse XDB型C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm，美國Agilent 公司）；SB-806 HQ 型凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm）和SB-804 HQ 型凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm）均購于日本Shodex 公司；對照品半乳糖（Gal，批號：100226-201807）、半乳糖醛酸（GalA，批號：111646-201702）、木糖（Xyl，批號：111508-201605）、核糖（Rib，批號：140668-202003）、葡萄糖醛酸（GlcA，批號：140648-202005）、甘露糖（Man，批號：140651-201805）、葡萄糖（Glc，批號：110833-201908）、阿拉伯糖（Ara，批號：1506-200202）、鼠李糖（Rha，批號：111683-201502）均購于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于99%；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，批號：BCBP1208V，純度為99%，美國Acros Organics公司）；對照品右旋糖酐（批號：1721，純度＞90%，美國聚合物標(biāo)準(zhǔn)品公司）；甲醇、乙醇、三氯甲烷、濃硫酸、氫氧化鈉、三氟乙酸、鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀均為分析純，購于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

枸杞樣品分別收集于寧夏、青海、新疆、河北枸杞種植基地，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張南平主任藥師鑒定確認其品種，共有19 批寧夏枸杞Lycium barbarmL.和3 批北方枸杞L.chinenseMill.var.potaninii（Pojark.）A.M.Lu，具體樣品信息見表1。

表1 22批枸杞樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 枸杞粗多糖的提取

參考文獻[10]實驗方法粉碎樣品，過三號篩，精密稱定約5 g，加入80%乙醇100 mL，加熱回流1 h后，趁熱濾過，濾渣用80%乙醇洗滌2 次。然后將濾紙連同濾渣放置于錐形瓶中，加水80 mL，加熱回流2 h，趁熱濾過，濾液在水浴鍋上蒸干后用5 mL水充分溶解，加入乙醇使其體積分數(shù)達到80%，4 ℃冰箱中置12 h 后取出，5000 r·min-1離心5 min（離心半徑為6 cm），棄去上清液。沉淀物分別用乙醇淋洗各2 次[11]，待溶劑揮干后沉淀物用熱水50 mL溶解，置于-20 ℃冰箱保存，作為枸杞粗多糖溶液。

2.2 枸杞粗多糖總糖含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取Glc 對照品約10 mg 置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得Glc 儲備液。分別精密量取Glc 儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置具塞試管中，分別加水補至2.0 mL后，加入5%苯酚溶液1.0 mL，將溶液充分混勻后滴加硫酸5.0 mL，混合均勻，室溫下靜置5 min，再水浴加熱15 min，后冰浴5 min終止反應(yīng)。采用紫外分光光度計在490 nm 處測定吸光度（A），空白對照以水代替對照品溶液。最終以Glc 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），A為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Glc線性方程：Y=0.81X-0.039 3（r=0.994 6）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取枸杞粗多糖溶液1.0 mL，置于20 mL 量瓶中，加水定容，搖勻，得到供試品溶液。

2.2.3 樣品含量測定 精密量取供試品溶液0.3 mL置具塞試管中，加水補至2.0 mL后，按2.2.1項下方法測定A值，每個樣品重復(fù)測定2次，通過Glc線性方程計算樣品中總糖含量，22批樣品的總糖含量見表2，質(zhì)量分數(shù)為3.24%～8.66%，同時發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞與北方枸杞在總糖含量上的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 22批枸杞樣品總糖質(zhì)量分數(shù)

2.3 枸杞粗多糖Mw測定

2.3.1 色譜條件 參考文獻[12]方法，采用凝膠滲透色譜-示差檢測器-光散射法（GPC-RI-MALLS）測定Mw。采用Shodex SB-806 HQ型凝膠柱和Shodex SB-804 HQ 型凝膠柱串聯(lián)進行分析，流動相為0.1%氯化鈉溶液；柱溫為40 ℃；柱流速為0.5 mL·min-1；進樣量為50 μL。

2.3.2 MALLS 檢測條件 石英玻璃樣品池，激光波長為658 nm。用甲苯對MALLS 90° PDA 進行校正，用Mw為44 000 右旋糖酐對照品對其余角度檢測器進行歸一化，折光指數(shù)增量值（dn/dc）為0.138。采用GPC-RI-MALLS 測定獲得Mw及數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）值，按公式（1）計算分散系數(shù)（PDI）。

2.3.3Mw測定結(jié)果 采用GPC-RI-MALLS 測定22批枸杞中提取的粗多糖的Mw及PDI，分別計算3個色譜峰在總峰面積中的占比，結(jié)果見表3。22批樣品的Mw為0.733×106～3.191×106，PDI 值為3.365～5.550。有報道對LBP 的Mw研究文獻進行總結(jié)，指出枸杞粗多糖的Mw為1.0×104～2.3×106[13]，這與本研究結(jié)果基本一致。

表3 22批樣品LBP的Mw、PDI及峰面積占比測定結(jié)果

從Mw測定色譜圖（圖1）來看，枸杞粗多糖在色譜圖呈現(xiàn)3 個不完全分離的色譜峰。同時發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞與北方枸杞的GPC-RI色譜圖存在明顯的區(qū)別，主要體現(xiàn)在峰2 和峰3 的色譜峰峰面積比例上（表3）。寧夏枸杞色譜圖中峰3 對峰2 的面積比為5.40～8.79，北方枸杞峰3 對峰2 的面積比僅為1.30～1.86。

圖1 GPC-RI-MALLS測定22批枸杞樣品Mw

2.4 LBP單糖組成測定

2.4.1 對照品溶液的制備 參考文獻[10]實驗方法，分別精密稱取對照品Man、Rib、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl和Ara適量，加水制成1.0 mg·mL-1的單標(biāo)溶液。精密吸取各單標(biāo)溶液1.0 mL置于10 mL量瓶中，加水制成含9種糖質(zhì)量濃度約為0.1 mg·mL-1的混合對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液500 μL，加0.25 mol·L-1NaOH 溶液75 μL，再加入0.5 mol·L-1PMP 甲醇溶液150 μL，混勻后于70 ℃反應(yīng)90 min。冷卻至室溫后加入0.25 mol·L-1HCl溶液75 μL。加三氯甲烷1 mL 萃取，除去下層有機層，重復(fù)萃取3次，取上層溶液即得。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密量取枸杞粗多糖溶液1.0 mL置于5.0 mL量瓶中，加水定容，制成多糖稀釋液，搖勻。精密量取多糖稀釋液1.0 mL，置于安瓿瓶中，加入等體積的4 mol·L-1三氟乙酸，密閉，于120 ℃反應(yīng)4 h。氮氣吹干，加甲醇適量，再吹干，以除盡剩余三氟乙酸，加水1.0 mL充分溶解。按2.4.1項下方法“加0.25 mol·L-1NaOH溶液75 μL”起同法處理，即得供試品溶液。

2.4.3 高效液相色譜-光電二極管陣列檢測法（HPLC-PDA）檢測 采用Zorbax Eclipse XDB 型C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為250 nm，進樣量為10 μL，流動相為乙腈-0.125 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（16∶84，加入1.0 mol·L-1氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6.9）。

2.4.4 單糖組成測定結(jié)果 選取10 批代表性樣品的粗多糖進行單糖組成測定，其中包括北方枸杞3批及寧夏枸杞7批（S1、S2、S14～18），寧夏枸杞分別來源于寧夏、青海和新疆3個產(chǎn)地，結(jié)果見圖2。

圖2 混合對照品和10批枸杞樣品單糖組成測定圖譜

從圖2 可看出，不同產(chǎn)地提取的枸杞粗多糖具有相同的單糖組成，均由9種單糖組成。HPLC 測定圖譜中13.61 min處色譜峰為衍生試劑色譜峰，其余色譜峰按保留時間順序依次為Man、Rib、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl 和Ara。其中，8 號和9號峰，即Xyl和Ara的分離效果與流動相體系的pH相關(guān)，當(dāng)調(diào)pH 為6.9 時，其分離效果達到最佳。以9 種單糖混合對照品所得峰面積為對照，分別計算樣品中各單糖含量及在總糖中的百分比，結(jié)果見表4。枸杞粗多糖中Ara含量最高，平均百分比高達32.2%。同時發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品單糖組成含比存在一定差異，尤其體現(xiàn)在寧夏枸杞和北方枸杞的GalA 含量上，7批寧夏枸杞LBP 中GalA 的平均質(zhì)量分數(shù)為21.1%；3 批北方枸杞LBP 成分中GalA 的平均質(zhì)量分數(shù)為11.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。若以樣品中Ara 峰面積與GalA 峰面積比作為指標(biāo)比較寧夏枸杞與北方枸杞差異，發(fā)現(xiàn)7 批寧夏枸杞樣品比值為1.39～1.69，而北方枸杞的比值為2.61～3.16。

表4 10批枸杞樣品LBP中各單糖占比

2.4.5 方法學(xué)驗證 對單糖組成測定方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、檢出限及回收率進行了驗證，結(jié)果見表5。從表5 結(jié)果可以看出，LBP 中9 種單糖的回收率為89.0%～103.9%，重復(fù)性結(jié)果RSD均小于4.7%。由于單糖組成測定步驟繁雜，需經(jīng)過水解、除酸和衍生化等步驟，故認為此方法學(xué)驗證結(jié)果可基本滿足測定要求。在穩(wěn)定性試驗中發(fā)現(xiàn)，6 h 內(nèi)樣品中9種單糖測定結(jié)果RSD均小于4.3%，穩(wěn)定性良好。6 h后樣品中GalA 和GlcA 成分的含量明顯下降，24 h穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示2 個成分的RSD 分別達到30.4%和23.4%，穩(wěn)定性較差。故在實際測定中建議樣品衍生化后應(yīng)在6 h內(nèi)完成HPLC檢測。

表5 LBP中單糖組成測定方法的驗證

2.5 單糖組成指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜建立 將2.4項下測定的10批樣品單糖組成數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012A版），確定9個共有峰。

2.5.2 相似度評價 本研究利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012A 版）分析不同產(chǎn)地不同品種樣品單糖組成指紋圖譜相似度。S17 樣品單糖組成含量比接近平均值，故以其色譜圖作為參照圖譜，樣 品S1、S2、S14、S15、S16、S18、S20、S21、S22 的相似度計算結(jié)果分別為0.973、0.993、0.984、0.993、0.991、0.985、0.955、0.953、0.958。9 批樣品與S17 的相似度均大于0.95，說明枸杞樣品雖來自不同地理區(qū)域，但單糖組成相似度較高。6 批寧夏枸杞與S17 的相似度在0.97 以上，而3 批北方枸杞與S17 的相似度為0.953～0.958，均低于0.96。故認為通過單糖組成指紋圖譜可初步對寧夏枸杞和北方枸杞進行區(qū)分。通過10 批樣品測定，初步建立了寧夏枸杞和北方枸杞單糖組成對照指紋圖譜，見圖3。

圖3 LBP中單糖組成的HPLC指紋圖譜

3 討論

現(xiàn)行枸杞標(biāo)準(zhǔn)僅測定總糖含量，難以反映不同種和不同產(chǎn)地LBP 成分的差異性。為了深入探索不同品種及不同產(chǎn)地LBP 的差異性，本研究分別從寧夏、青海、新疆、河北種植基地收集了共22批枸杞樣品進行提取純化，并對其初級結(jié)構(gòu)進行測定。收集的寧夏枸杞樣品主要為“寧杞1號”。據(jù)已有報道，目前寧夏枸杞種植面積突破200 萬畝（1 畝≈666.67 m2），其中80%以上種植品種為“寧杞1 號”，主要分布于寧夏、甘肅、青海、新疆等地[9]。故本研究中收集“寧杞1 號”樣品更能代表市場主流產(chǎn)品的質(zhì)量情況。在初級結(jié)構(gòu)測定方面，主要對Mw和單糖組成進行測定和比較。在多糖研究中一般認為單糖組成和Mw對多糖生物活性有較大的影響，如在LBP 文獻報道中，有學(xué)者指出其糖醛酸含量對其活性有重要影響[14-15]。前期本課題組研究亦發(fā)現(xiàn)Mw與LBP 活性密切相關(guān)[16]。

本研究對Mw的測定采用了GPC-RI-MALLS。植物多糖Mw的常用測定方法包括MALLS、GPC-RI 及基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法（MALDITOF-MS）。例如，Hu 等[17]以右旋糖酐為對照品，采用GPC-RI對短柄五加中多糖成分的Mw進行了測定；Yu 等[18]亦采用GPC-RI 對西洋參中多糖成分的Mw進行了測定；陳同強等[19]采用GPC-RI-MALLS 對紅芪多糖的相對分子質(zhì)量進行了檢測；胡坪等[20]采用MALDI-TOF-MS 對麥冬中多糖成分的Mw進行了測定。本研究中采用的MALLS 是一種相對分子質(zhì)量的絕對測定方法，其原理是利用激光照射到樣品在各個方向產(chǎn)生散射光，光散射強度與Mw和溶液的質(zhì)量濃度成正比，從而對相對分子質(zhì)量進行計算。已有研究采用GPC-RI-MALLS對制備的50批LBP進行測定[7]，結(jié)果表明此方法準(zhǔn)確快速，可作為LBP 的Mw測定方法。單糖組成則采用PMP 柱前衍生化結(jié)合HPLC-PDA 進行檢測，PMP 是常用的柱前衍生化試劑，其優(yōu)勢在于與還原糖在堿性條件下反應(yīng)后所得衍生化產(chǎn)物較為穩(wěn)定，且無立體異構(gòu)峰，便于分析。從實驗結(jié)果可以看出，此方法前處理操作重復(fù)性較好，且經(jīng)衍生化的9種單糖檢測限均低于20 μg·mL-1，靈敏度較高。為了進一步分析不同產(chǎn)地LBP 的差異性，本研究建立了單糖組成指紋圖譜并結(jié)合相似度對不同樣品進行分析。選擇了單糖組成較接近7 批寧夏枸杞單糖組成測定平均值的S17 樣品作為參照指紋圖譜。在LBP 的研究中，已有學(xué)者采用指紋圖譜對其單糖組成相似度進行分析[8]，其研究目的是比較不同產(chǎn)地寧夏枸杞中多糖組分差異，故收集的樣品均為寧夏枸杞樣品。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地寧夏枸杞中多糖組分的單糖組成高度相似，與本研究測定結(jié)果一致。

以上研究初步得出結(jié)論，通過多糖成分測定可有效區(qū)分寧夏枸杞和北方枸杞，主要差異性指標(biāo)包括：1）總糖含量，寧夏枸杞的總糖含量高于北方枸杞（P＜0.05）；2）Mw測定GPC-RI 色譜圖，不同相對分子質(zhì)量段的色譜峰面積存在顯著差異（峰2 與峰3 面積比）；3）單糖組成測定表明北方枸杞的GalA 含量明顯低于寧夏枸杞，以Ara與GalA 含量比作為指標(biāo)值，可有效區(qū)分不同枸杞品種。之所以選擇GalA 是因為其是寧夏枸杞和北方枸杞含量差異最大的成分，而Ara是枸杞中最主要成分，故選擇這2個成分比值能更準(zhǔn)確地表達兩者的差異。綜上所述，不同產(chǎn)地寧夏枸杞中多糖成分結(jié)構(gòu)高度一致，但寧夏枸杞與北方枸杞中粗多糖成分存在較大差異，進一步說明基于多糖成分對枸杞進行質(zhì)量評價的必要性。同時，本研究建立的方法可通過測定多糖成分初步區(qū)分寧夏枸杞與北方枸杞，可為完善枸杞質(zhì)量控制方法和枸杞資源評價提供參考。