過表達(dá)脂肪非典型鈣黏蛋白4對結(jié)直腸癌化療耐藥的影響

楊少賓，王昱良，李俊娜，王朝杰

1.黃河三門峽醫(yī)院消化內(nèi)科，三門峽 472000；2.河南省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，鄭州 450003

多項(xiàng)研究表明［1-2］，結(jié)直腸癌病死率高的一個(gè)重要原因?yàn)榛熌退帲ㄔl(fā)性、繼發(fā)性2種，其中繼發(fā)性耐藥較常見，可導(dǎo)致病情反復(fù)或加重，使治療的難度增大。脂肪非典型鈣黏蛋白4（fat atypical cadherin 4，F(xiàn)AT4）為鈣黏蛋白超家族成員之一，屬于單跨膜蛋白受體，能對上游相關(guān)信號通路的細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)進(jìn)行調(diào)控［3］。有研究發(fā)現(xiàn)［4-5］，F(xiàn)AT4屬于腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中呈低表達(dá)，可能參與正常組織向腫瘤組織轉(zhuǎn)變的過程。目前，F(xiàn)AT4過表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞繼發(fā)性化療耐藥性的影響及具體機(jī)制尚不明確。本文分析FAT4過表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞繼發(fā)性化療耐藥性的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Mx3005P型實(shí)時(shí)熒光定量分析（RT-PCR）儀（美國安捷倫科技公司）；TC2323型CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）；CH2-TKC-3 型倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；Mod 550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

奧沙利鉑（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司）；青霉素、鏈霉素均購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司）；LipofectamineTM3000 試 劑（美 國Life Technologies 公 司）；過 表 達(dá)FAT4慢病毒核心質(zhì)粒、空載體慢病毒均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒［東仁化學(xué)科技（上海）有限公司］；FAT4、β-actin引物序列均購自日本Ta KaRa Bio株式會(huì)社；兔抗人FAT4、P53、磷酸化-p53（p-p53）、鼠雙微粒體基因2（murine double minute2，MDM2）一抗及山羊抗兔IgG 二抗均購自美國Novus Biologicals公司。

1.3 細(xì)胞系

正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞系FHC、人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞系FHC、人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞，分別接種于含質(zhì)量濃度為50 mg·L－1胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度37℃，每2 d更換1次培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)前培養(yǎng)4 d。

2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞與正常腸黏膜上皮細(xì)胞中FAT4 m RNA 表達(dá)水平的檢測

用RT-PCR 法檢測。取處于對數(shù)生長期的正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞、人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RTPCR 反 應(yīng)。反 應(yīng) 體 系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）12.5μL，cDNA 模 版2μL，上、下 游 引 物 各1μL，雙 蒸 水8.5 μL。反 應(yīng) 條 件：95 ℃預(yù) 變 性，5 min；95℃變性，5 s；60℃退火延伸，20 s，40 個(gè) 循環(huán)。引物序列見表1。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算FAT4 m RNA 的相對表達(dá)水平（2－△△CT）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.3 過表達(dá)人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞中的FAT4及轉(zhuǎn)染

用胰酶消化、收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，根據(jù)病毒包被、轉(zhuǎn)染試劑要求，將過表達(dá)FAT4慢病毒核心質(zhì)粒包裝成病毒，按照LipofectamineTM3000 試劑說明書，用其與空載體慢病毒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，6 h。隨后更換新鮮的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞分為3組：以過表達(dá)FAT4 病毒轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以空載體病毒轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞作為對照組，以無病毒轉(zhuǎn)染HCT116 細(xì)胞作為空白組。轉(zhuǎn)染48 h后，用倒置熒光顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)、發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率＝（發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)）×100%。

2.4 轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞中FAT4 mRNA 表達(dá)水平的檢測

用RT-PCR 進(jìn) 行 檢 測。取2.3 項(xiàng) 下 的3 組 細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算FAT4 m RNA 的相對表達(dá)水平（2－△△CT）。

2.5 轉(zhuǎn)染后HCT116 細(xì)胞中FAT4 蛋白表達(dá)水平的檢測

用Western blot檢測。取2.3項(xiàng)下3組細(xì)胞，用PBS清洗2次，RIPA 裂解液進(jìn)行冰上裂解，30 min。以4℃，12 000 r·minL－1離心10 min，半徑為8 cm，取上清液。用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，沸水浴變性10 min。以質(zhì)量濃度120 g·L－1的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉1 h。加兔抗人FAT4一抗（1∶1 000），4℃，搖床孵育，過夜。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加Ig G二抗（1∶2 500），室溫下孵育2 h。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑。用Image Quant LAS4000生物分子成像儀曝光成像，觀察條帶灰度值。目的蛋白水平＝目的蛋白條帶灰度值÷β-actin條帶灰度值。

2.6 FAT4 過表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞化療耐藥影響的檢測

用CCK-8法檢測。取2.3項(xiàng)下3 組細(xì)胞，接種于96孔板，各組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，以不同質(zhì)量濃度（1.6、2.4、3.2、4.0、4.8μg·m L－1）的奧沙利鉑干預(yù)各組細(xì)胞，以未處理細(xì)胞為對照孔，僅加培養(yǎng)液200μL。處理24 h后，各孔加CCK-8 5μL，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，箱內(nèi)溫度37℃。以含質(zhì)量濃度為1.0 mg·L－1DMSO 的DMEM 溶液加入各孔，振蕩10 min。待結(jié)晶溶解后，用酶標(biāo)儀檢測570 nm 處的吸光度（A），并計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）及 化療耐藥 倍 數(shù)（resistance fold，RF）。IC50＝（實(shí)驗(yàn)孔吸光度值÷對照孔吸光度值）×100%。RF＝耐藥細(xì)胞IC50值÷親本細(xì)胞IC50值。

2.7 FAT4 過表達(dá)對人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞凋亡率影響的檢測

用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。取2.3項(xiàng)下3組細(xì)胞，接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，以最接近IC50值質(zhì)量濃度（3.2μg·m L－1）的奧沙利鉑干預(yù)各組細(xì)胞24 h。隨后各孔加不含EDTA 的胰酶消化，以EP管收集各組細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次。管內(nèi)加1×binding buffer 200μL重懸細(xì)胞，于細(xì)胞重懸液內(nèi)加入Annexin V-PE 5 μL，混勻，室溫下避光孵育10 min。以7-AAD 5μL加入各管，吹打混勻，4 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

取2.3項(xiàng)下3組細(xì)胞，接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，以質(zhì)量濃度3.2μg·m L－1的奧沙利鉑干預(yù)24 h。將細(xì)胞置于RIPA 裂解液中裂解，以12 000 r·min－1離心15 min，離心半徑8 cm，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管。用PBS洗滌蛋白A／G 瓊脂糖珠2次，制備成20μL 蛋白A／G 瓊脂糖珠工作液。4℃，振蕩10 min，去除非特異性結(jié)合蛋白干擾。以12 000 r·min－1離心15 s，離心半徑為8 cm，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，棄蛋白A／G 瓊脂糖珠，加p53 抗體或MDM2抗體（或FAT4抗體）5μL。4℃，緩慢振蕩過夜。以12 000 r·min－1離心15 s，離心半徑為8 cm，收集免疫沉淀產(chǎn)物。以經(jīng)過預(yù)冷的PBS洗滌，重復(fù)3次。加上樣緩沖液15μL，置于沸水浴中變性5 min，用Western blot檢測FAT4、p53、p-p53及MDM2蛋白的表達(dá)水平。

2.9 p53、p-p53及MDM2蛋白相對表達(dá)量的檢測

用Western blot檢測。取2.3項(xiàng)下3組細(xì)胞，接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，以質(zhì)量濃度為3.2μg·m L－1的奧沙利鉑干預(yù)各組細(xì)胞24 h，開始實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞裂解、蛋白定量、沸水浴變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉等步驟同1.2.5。加兔抗人p53（1∶1 000）、p-p53（1∶1 000）及MDM2（1∶1 000）一抗，置于4℃搖床中孵育過夜。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加IgG 二抗（1∶2 500），室溫下孵育2 h。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑，曝光成像，觀察條帶灰度值。目的蛋白水平＝目的蛋白條帶灰度值／β-actin條帶灰度值。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組計(jì)量資料比較用單因素方差分析，兩兩樣本比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞與正常腸黏膜上皮細(xì)胞中FAT4的表達(dá)水平

人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞中FAT4 mRNA 的相對表達(dá)量為（0.36±0.12），正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞中FAT4 m RNA 的相對表達(dá)量為（1.02±0.35），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.989，P＝0.002）。FAT4在結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中呈低表達(dá)。

3.2 轉(zhuǎn)染效率

經(jīng)檢測，對照組轉(zhuǎn)染效率為89.58%，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染效率為90.05%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖1。

圖1 LipofectamineTM 3000介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞后的顯微鏡下照片F(xiàn)ig.1 Pictures of transfected HCT116 cells mediated by LipofectamineTM 3000 plasmid under microscope

3.3 HCT116細(xì)胞中FAT4 m RNA、蛋白的相對表達(dá)量

各組FAT 4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組、對照組比較，實(shí)驗(yàn)組FAT 4 mRNA、蛋白的相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；空白組與對照組FAT 4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2、圖2。

圖2 Western blot檢測HCT116細(xì)胞中FAT4蛋白的表達(dá)量Fig.2 Expression of FAT4 protein in HCT116 cells detected by Western blot

表2 各組FAT4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量的比較（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of relative expression of FAT4 mRNA and protein in each group（±s，n＝5）

表2 各組FAT4 mRNA、蛋白相對表達(dá)量的比較（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of relative expression of FAT4 mRNA and protein in each group（±s，n＝5）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05。

項(xiàng)目 FAT4 mRNA FAT4蛋白空白組0.36±0.11 0.27±0.10對照組 0.34±0.13 0.26±0.11實(shí)驗(yàn)組 1.15±0.19ab 0.98±0.18ab F 49.178 46.908 P＜0.001 ＜0.001

3.4 過表達(dá)FAT4對HCT 細(xì)胞化療耐藥性的影響

各組細(xì)胞增殖活性均隨奧沙利鉑質(zhì)量濃度增加而降低（P＜0.05）。各組IC50值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組、對照組比較，實(shí)驗(yàn)組IC50值降低（P＜0.05）；空白組與對照組IC50值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組RF 分別為5.65、5.75、2.18 倍。結(jié)果見表3、表4。

表3 各組不同奧沙利鉑質(zhì)量濃度時(shí)A值的比較（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of A value of different oxaliplatin concentrations in each group（±s，n＝5）

表3 各組不同奧沙利鉑質(zhì)量濃度時(shí)A值的比較（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of A value of different oxaliplatin concentrations in each group（±s，n＝5）

奧沙利鉑質(zhì)量濃度／（μg·mL－1）空白組 對照組 實(shí)驗(yàn)組1.6 93.02±4.51 92.54±4.96 87.65±3.65 2.4 79.12±4.03 78.65±4.13 70.05±3.44 3.2 63.05±3.28 62.68±3.77 52.13±2.96 4.0 36.04±2.74 35.74±2.61 22.36±2.14 4.8 15.02±1.08 14.54±1.02 9.54±1.07 F 449.074 394.159 663.965 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 各組IC50值的比較（±s，n＝5）Tab.4 Comparison of IC50 values in each group（±s，n＝5）

表4 各組IC50值的比較（±s，n＝5）Tab.4 Comparison of IC50 values in each group（±s，n＝5）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05。

項(xiàng)目 IC50／（μg·mL－1）空白組3.52±0.05對照組 3.51±0.02實(shí)驗(yàn)組 3.28±0.01ab F 61.444 P 0.016

3.5 過表達(dá)FAT4對HCT 細(xì)胞凋亡的影響

各組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組、對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；空白組與對照組細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖3、表5。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡Fig.3 Comparison of apoptosis detected by flow cytometry in each group

表5 各組細(xì)胞凋亡率的比較（±s，n＝5）Tab.5 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n＝5）

表5 各組細(xì)胞凋亡率的比較（±s，n＝5）Tab.5 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n＝5）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05。

項(xiàng)目 細(xì)胞凋亡率空白組4.61%±0.41%對照組 5.02%±0.43%實(shí)驗(yàn)組 23.62%±0.85%ab F 788.709 P＜0.001

3.6 Co-IP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及p53、p-p53、MDM2 蛋白 的相對表達(dá)量

Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)AT4與p-p53、MDM2均存在特異的相互作用。

Western blot結(jié)果顯示，各組p-p53、MDM2 蛋白的相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組p53蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組、對照組比較，實(shí)驗(yàn)組p-p53蛋白的相對表達(dá)量升高，MDM2蛋白的相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；空白組與對照組p-p53、MDM2蛋白的相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖4、表6。

圖4 Western blot檢測各組p53、p-p53、MDM2蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of P53，p-P53 and MDM2 proteins detected by Western blot in each group

表6 各組P53、p-P53、MDM2蛋白相對表達(dá)量的比較（±s，n＝5）Tab.6 Comparison of the relative expression of P53，p-P53 and MDM2 in each group（±s，n＝5）

表6 各組P53、p-P53、MDM2蛋白相對表達(dá)量的比較（±s，n＝5）Tab.6 Comparison of the relative expression of P53，p-P53 and MDM2 in each group（±s，n＝5）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05。

項(xiàng)目 P53 p -P53 MDM2空白組0.72±0.09 0.27±0.03 0.65±0.06對照組 0.73±0.08 0.26±0.04 0.65±0.08實(shí)驗(yàn)組 0.73±0.09 0.78±0.05ab 0.29±0.03ab F 0.022 265.300 59.450 P 0.978 ＜0.001 ＜0.001

4 討論

結(jié)直腸癌為臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，多數(shù)患者早期癥狀不典型，確診時(shí)通常已處于中晚期，病死率高［6-7］。FAT4為原鈣黏蛋白家族成員之一，在細(xì)胞增殖及細(xì)胞平板極性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［8-9］。有研究顯示［10-12］，F(xiàn)AT4在肝癌、胃癌和乳腺癌等腫瘤中呈低表達(dá)，且進(jìn)一步低表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力。目前，盡管FAT4 涉及多種惡性腫瘤，但其在結(jié)直腸癌中的作用，特別是對繼發(fā)性化療耐藥性的影響及機(jī)制仍不清楚。本研究對FAT4對結(jié)直腸癌繼發(fā)性化療耐藥性問題進(jìn)行分析，化療藥物選擇奧沙利鉑，因其應(yīng)用較廣泛，具有一定典型性。

FAT 家族成員能對Hippo信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與正常機(jī)體細(xì)胞發(fā)育、增殖過程，其中FAT4同樣被發(fā)現(xiàn)可影響腫瘤進(jìn)展［13］。另外，F(xiàn)AT4 還是重要的甲基化修飾因子，可導(dǎo)致基因突變的風(fēng)險(xiǎn)增加，降低基因 錯(cuò) 配 修 復(fù) 能 力［14-15］。研 究 證 實(shí)［16］，F(xiàn)AT4 高度甲基化能引發(fā)FAT4低表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力，還可限制YAPI的表達(dá)，對哺乳動(dòng)物心臟生長造成影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組、對照組比較，實(shí)驗(yàn)組IC50值、RF降低，CCK-8實(shí)驗(yàn)A值降低，凋亡率增加，提示過表達(dá)FAT4 能抑制人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)化療敏感性。WEI R 等［17］研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT4過表達(dá)能抑制大腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與本研究共同證實(shí)FAT4過表達(dá)的作用。

p53基因與其上、下游基因共同構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中MDM2-p53信號通路發(fā)揮重要作用。p53基因是一個(gè)經(jīng)典抑癌基因，激活后能對下游一系列基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡及DNA 修復(fù)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)［18］，p53 失活在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。還有學(xué)者提出［19］，細(xì)胞在暴露于DNA 損傷藥物后，可導(dǎo)致p53表達(dá)水平上升，推測p53可能在促進(jìn)DNA 修復(fù)中有一定作用。MDM2主要作為p53的負(fù)性調(diào)控因子存在，可特異性標(biāo)記p53蛋白，p53蛋白高表達(dá)可激活MDM2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使p53蛋白被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，降低細(xì)胞內(nèi)p53的含量。呂磊等［20］發(fā)現(xiàn)，膀胱癌耐藥菌株增殖受MDM2-p53通路影響。本研究推測FAT4 過表達(dá)是否為調(diào)節(jié)HCT116 細(xì)胞內(nèi)P53、MDM2表達(dá)，發(fā)揮增強(qiáng)HCT116細(xì)胞化療耐藥性作用。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組p-p53的蛋白相對表達(dá)量增高，MDM2蛋白的相對表達(dá)量降低，且Co-IP 實(shí)驗(yàn)證明FAT4與p-p53、MDM2有互相作用，提示過表達(dá)FAT4可調(diào)節(jié)p-p53、MDM2蛋白的表達(dá)。因此，推測FAT4過表達(dá)降低HCT116細(xì)胞化療耐藥性的作用機(jī)制，可能與調(diào)節(jié)MDM2-p53通路有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)AT4 過表達(dá)可降低結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞化療耐藥性，增加化療敏感性，該作用可能與MDM2-p53通路有關(guān)，這一結(jié)論可為臨床指導(dǎo)結(jié)直腸癌化療耐藥治療提供新方向。本研究不足之處在于，僅選用一個(gè)細(xì)胞株，未能全面概括FAT4對不同亞型細(xì)胞化療耐藥的影響及機(jī)制，故仍需深入研究，并在臨床加以證實(shí)。