舒肝解郁膠囊通過激活JAK1／STAT3信號(hào)通路改善大鼠抑郁癥及修復(fù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞

白天山，李志榕，黃 平，徐 燁，柳文華

1.開封市第五人民醫(yī)院醫(yī)教科，開封 475000；2.開封市第五人民醫(yī)院精神科一病區(qū)，開封 475000；3.商丘市第二人民醫(yī)院精神科三病區(qū)，商丘 476000；4.河南大學(xué)淮河醫(yī)院科研與研究生工作部，開封 475000

抑郁癥的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，神經(jīng)元和神經(jīng)的可塑性假說是目前公認(rèn)的主要病理機(jī)制之一［1］。研究證實(shí)［2］，抑郁癥患者存在海馬體積縮小和神經(jīng)元缺失的情況。因此，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡已成為抑郁癥的治療目標(biāo)之一。中醫(yī)學(xué)將抑郁癥歸為“郁證”范疇，為情志不舒、肝氣郁結(jié)所致，治療應(yīng)以疏肝理氣解郁為主［3］。舒肝解郁膠囊是具有疏肝理氣、健脾安神作用的中成藥，適用于情緒低落、興趣遲滯的單項(xiàng)抑郁癥患者的治療［4］。本研究通過慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)建立抑郁癥大鼠模型，探討舒肝解郁膠囊對(duì)抑郁癥及海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的改善和修復(fù)作用，并探討其機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SM2010R型徠卡切片機(jī)［徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司］；3550UV 型酶標(biāo)儀、7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；JP-K600型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥

舒肝解郁膠囊（批號(hào)200313，四川濟(jì)生堂藥業(yè)有限公司）；氟西?。ㄅ?hào)19041128，蘇州中化藥品工業(yè)有限公司）；JAK 激酶抑制劑AG490（批號(hào)YT316，北京百奧萊博科技有限公司）；兔抗鼠酪氨酸蛋白激酶-1 （tyrosine-protein kinase 1，JAK1，貨 號(hào)abx027832），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子-3（signal transducer activated transcription factor-3，STAT3，貨號(hào)A73260-100），磷酸化（p）-JAK1（貨號(hào)abx009836），p-STAT3（貨號(hào)20R-2918）多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自艾美捷科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄 性SD 大 鼠，50 只，6 周 齡，體 質(zhì) 量 為200～240 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。

2 方法

2.1 造模及給藥

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，稱體質(zhì)量后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、舒肝解郁膠囊組、陽性藥物組、舒肝解郁膠囊＋AG490組，每組10只。除對(duì)照組外，均采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)建立抑郁癥大鼠模型［5］，電擊足底（電流強(qiáng)度1 m A，電壓45 m V，10 s／次，間 隔1 min，共30 次），冰 水 游 泳（4 ℃，5 min），束 縛（8 h），搖 晃（1 次／s，15 min）、夾 尾（3 min），熱應(yīng)激（45℃，5 min），禁食（24 h），禁水（24 h），晝夜顛倒、傾斜鼠籠與潮濕墊料（100 g墊料中加入200 m L 水）。每天給予1種處理方式，順序隨機(jī)，連續(xù)處理21 d，單籠飼養(yǎng)。對(duì)照組除每天抓取1次外，正常飼養(yǎng)，不采取其他處理。舒肝解郁膠囊組自建模第1天開始給予舒肝解郁膠囊150 mg·kg－1（以質(zhì)量濃度5 g·L－1羧甲基纖維素鈉懸浮液配制）灌胃，陽性藥物組以氟西汀1.54 m L·kg－1灌胃（以質(zhì)量濃度為5 g·L－1的羧甲基纖維素鈉懸浮液配制），舒肝解郁膠囊＋AG490 組以舒肝解郁膠囊150 m L·kg－1＋AG490 5 m L·kg－1灌胃，對(duì)照組和模型組以質(zhì)量濃度為5 g·L－1的羧甲基纖維素鈉12.5 mg·kg－1灌胃，每日1次，至建模結(jié)束。

2.2 大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)

敞箱實(shí)驗(yàn)于灌胃結(jié)束24 h 后進(jìn)行。敞箱為80 cm×80 cm×4 cm 的無蓋立柱體，周壁均為黑色，底部為白色，底部劃分為16 cm×16 cm 的方格25個(gè)。將大鼠置于箱內(nèi)底板中心，以穿越底板格數(shù)為水平活動(dòng)得分，穿越1格記1分（4只腳均在同一格子內(nèi)），若沿線行走則每行走10 cm 記1分。以大鼠直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分（雙足離開底板），直立1次記1分，每次記錄10 min。水平活動(dòng)反映大鼠活動(dòng)度，垂直活動(dòng)反映大鼠對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度。敞箱實(shí)驗(yàn)得分＝水平活動(dòng)得分＋垂直活動(dòng)得分。

糖水消耗實(shí)驗(yàn)于敞箱實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行，以10 g·kg－1蔗糖溶液和自來水供大鼠飲用，通過測(cè)量禁水2.5 h后大鼠1 h內(nèi)的糖水和自來水消耗量，計(jì)算糖水消耗百分比。糖水消耗百分比＝（糖水消耗量／總液體消耗量）×100%。

2.3 海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞觀察

糖消耗實(shí)驗(yàn)后用斷頭法處死大鼠，每組任選5只取雙側(cè)海馬組織，以體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定24 h，組織塊常規(guī)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋，切片，厚度5μm。

Nissl染色：組織切片脫蠟、乙醇脫水及水洗后，加入緩沖亞甲藍(lán)染液染色10 min，0.2 mol·L－1乙酸鹽分色2 min，觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活情況，陽染為胞核淡染，胞質(zhì)藍(lán)色，細(xì)胞輪廓清晰，用ImagePro Plus 6.0軟件對(duì)存活神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，任選5個(gè)視野計(jì)算平均值。

Tunel染色：組織切片脫蠟水洗后加入Tunel反應(yīng)混合液，于濕盒中37℃孵育60 s，用PBS沖洗，加入POD 轉(zhuǎn)化劑，于濕盒中37℃孵育30 s，用PBS沖洗，加入DAB底物溶液，室溫孵育3 s，用PBS沖洗，用蘇木素復(fù)染，脫水，干燥，用中性樹膠封片，置于光鏡下觀察，陽染細(xì)胞核可見棕黃色顆粒，選擇具有代表性的海馬CA1 區(qū)分析結(jié)果，任選5 個(gè)視野計(jì)數(shù)Tunel陽性細(xì)胞數(shù)。

2.4 海馬組織JAK1、STAT 3 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

取出每組剩余5只大鼠的海馬組織立即置于液氮中，后保存于－80℃?zhèn)溆?。取保存于?0℃的左側(cè)海馬組織，置于液氮中研磨，用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定產(chǎn)物后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物序列見表1。根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，58℃退火40 s，72℃延伸50 s，重復(fù)45 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參基因，2－CT為目的基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

2.5 海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3和p-STAT3蛋白檢測(cè)

取保存于－80℃的每組右側(cè)海馬組織，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入封閉液置于室溫?fù)u床中封閉1 h，加入用封閉液稀釋的一抗（1∶500），4℃孵育過夜，用洗液洗膜3次，加入用封閉液稀釋的二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，于暗室中曝光、顯影和定影。用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 敞箱實(shí)驗(yàn)得分與糖水消耗百分比比較

與對(duì)照組比較，模型組敞箱實(shí)驗(yàn)得分及糖水消耗百分比降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組敞箱實(shí)驗(yàn)得分、糖水消耗百分比升高（P＜0.01）；與陽性藥物組比較，舒肝解郁膠囊組敞箱實(shí)驗(yàn)得分、糖水消耗百分比降低（P＜0.01）；與舒肝解郁膠囊組比較，舒肝解郁膠囊＋AG490組敞箱實(shí)驗(yàn)得分、糖水消耗百分比降低（P＜0.01）；模型組與舒肝解郁膠囊＋AG490組敞箱實(shí)驗(yàn)得分、糖水消耗百分比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2、圖1。

圖1 海馬CA1區(qū)Nissl染色結(jié)果（×400）Fig.1 Results of Nissl staining in CA1 area of hippocampus（×400）

表2 敞箱實(shí)驗(yàn)得分、糖水消耗百分比比較（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of scores of open field test and percentage of sugar water consumption（±s，n＝10）

表2 敞箱實(shí)驗(yàn)得分、糖水消耗百分比比較（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of scores of open field test and percentage of sugar water consumption（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.01；與陽性藥物組比較，△P＜0.05；與舒肝解郁膠囊組比較，▲P＜0.01。

項(xiàng)目 敞箱實(shí)驗(yàn)得分／分 糖水消耗百分比對(duì)照組 108.35±8.54 80.21%±5.01%模型組 22.34±4.65* 40.15%±3.36%*陽性藥物組 88.32±6.53*＃ 70.71%±4.01%*＃舒肝解郁膠囊組 70.42±5.36*?！?62.35%±3.85%*?！魇娓谓庥裟z囊＋AG490組 24.01±4.33*△▲ 41.37%±3.50%*△▲F 401.096 198.690 P＜0.001 ＜0.001

3.2 海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞存活情況比較

與對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)量減少（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)量增加（P＜0.01）；與陽性藥物組比較，舒肝解郁膠囊組神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)量減少（P＜0.01）；與舒肝解郁膠囊組比較，舒肝解郁膠囊＋AG490 組神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)量增加（P＜0.01）；模型組與舒肝解郁膠囊＋AG490組神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3、圖2。

圖2 海馬CA1區(qū)Tunel染色結(jié)果（×400）Fig.2 Results of Tunel staining in CA1 area of hippocampus（×400）

表3 海馬組織神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of survival number of nerve cells（±s，n＝10）

表3 海馬組織神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of survival number of nerve cells（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.01；與陽性藥物組比較，△P＜0.05；與舒肝解郁膠囊組比較，▲P＜0.01。

項(xiàng)目 神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)量／個(gè)對(duì)照組155.20±10.12模型組 45.40±5.85*陽性藥物組 122.40±8.35*＃舒肝解郁膠囊組 102.60±7.81*＃△舒肝解郁膠囊＋AG490組 46.40±6.01*△▲F 401.096 P＜0.001

3.3 海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較

與對(duì)照組比較，模型組的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組的凋亡細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01）；與陽性藥物組比較，舒肝解郁膠囊組凋亡細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.01）；與舒肝解郁膠囊組比較，舒肝解郁膠囊＋AG490 組凋亡細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01）；模型組與舒肝解郁膠囊＋AG490組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis of nerve cells（±s，n＝10）

表4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis of nerve cells（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.01；與陽性藥物組比較，△P＜0.05；與舒肝解郁膠囊組比較，▲P＜0.01。

項(xiàng)目 神經(jīng)元凋亡存活數(shù)量／個(gè)對(duì)照組6.80±2.50模型組 116.40±4.36*陽性藥物組 38.40±4.33*＃舒肝解郁膠囊組 58.60±4.20*?！魇娓谓庥裟z囊＋AG490組 114.40±4.80*△▲F 401.096 P＜0.001

3.4 海馬組織JAK1、STAT3 mRNA 表達(dá)水平比較

JAK1、STAT3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表5、圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)情況Fig.3 Protein expression of Jak1，p-jak1，STAT3 and p-STAT3 detected by Western blot

表5 JAK1、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n＝10）Tab.5 Comparison of relative expression of JAK1 and STAT3 mRNA（±s，n＝10）

表5 JAK1、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n＝10）Tab.5 Comparison of relative expression of JAK1 and STAT3 mRNA（±s，n＝10）

項(xiàng)目JAK1 STAT3對(duì)照組0.88±0.12 0.90±0.15模型組 0.85±0.13 0.84±0.14陽性藥物組 0.84±0.12 0.86±0.12舒肝解郁膠囊組 0.86±0.10 0.88±0.13舒肝解郁膠囊＋AG490組 0.87±0.11 0.85±0.14 F 0.092 0.156 P 0.984 0.958

3.5 海 馬 組 織p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3比較

與對(duì) 照 組 比 較，模 型 組p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥物組p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3升高（P＜0.01）；與陽性藥物組比較，舒肝解郁膠囊組p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3降低（P＜0.01）；與舒肝解郁膠囊組比較，舒肝解郁膠囊＋AG490組p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3降低（P＜0.01）；模型組與舒肝解郁膠囊＋AG490組p-JAK1／JAK1、p-STAT 3／STAT 3比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表6。

表6 p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3比較（±s，n＝10）Tab.6 Comparison of p-JAK1／JAK1 and p-STAT3／STAT3（±s，n＝10）

表6 p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3比較（±s，n＝10）Tab.6 Comparison of p-JAK1／JAK1 and p-STAT3／STAT3（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性藥物組比較，△P＜0.05；與舒肝解郁膠囊組比較，▲P＜0.05。

項(xiàng)目 p-JAK1／JAK1 p-STAT3／STAT3對(duì)照組0.88±0.08 0.92±0.08模型組 0.22±0.04* 0.25±0.05*陽性藥物組 0.61±0.06*＃ 0.71±0.06*＃舒肝解郁膠囊組 0.43±0.05*＃△ 0.54±0.05*?！魇娓谓庥裟z囊＋AG490組 0.23±0.04*△▲ 0.24±0.04*△▲F 123.137 132.048 P＜0.001 ＜0.001

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)［6］，慢性應(yīng)激狀態(tài)可促進(jìn)腦內(nèi)谷氨酸的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷，海馬體積縮小。海馬體積縮小則影響其對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺素軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致激素、神經(jīng)遞質(zhì)分泌發(fā)生改變，加重抑郁癥狀［7］。因此，減輕神經(jīng)元損傷在抑郁癥的治療中意義重大。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝郁是抑郁癥發(fā)病的核心，同時(shí)涉及脾、腎等多個(gè)臟器，因此疏肝理氣、健脾補(bǔ)腎是治療的關(guān)鍵［8］。

舒肝解郁膠囊由貫葉金絲桃和刺五加組成，貫葉金絲桃歸肝經(jīng)，可疏肝解郁、清熱利濕［9］。刺五加歸脾、肺、心及腎經(jīng)，可益氣健脾、補(bǔ)腎安神［10］。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果［11-12］表明，貫葉金絲桃中的間苯三酚類化合物及刺五加中的皂苷類化合物，可促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的重吸收與神經(jīng)突觸的重建，有抗抑郁及抗應(yīng)激作用。傅松年等［13］研究發(fā)現(xiàn)貫葉金絲桃提取物對(duì)抑郁模型小鼠抑郁行為有改善作用。徐向東等［14］認(rèn)為，刺五加含藥血清能促進(jìn)海馬神經(jīng)元的存活。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)舒肝解郁膠囊干預(yù)后抑郁癥大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)得分、糖水消耗百分比、神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)量增加，說明舒肝解郁膠囊能有效改善大鼠的抑郁行為，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞存活、抑制凋亡。

JAK1／STAT3信號(hào)通路是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同途徑，參與神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及炎癥反應(yīng)過程［15］。JAKs能促進(jìn)STATs磷酸化，與相應(yīng)的靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，激活相關(guān)基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄［16-17］。研 究 表 明［18］，在 腦 組 織 受 損 時(shí)，JAK1／STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可被激活誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，JAK1／STAT3信號(hào)通路的激活能減輕β-淀粉樣蛋白所致大鼠海馬神經(jīng)元損傷［19］。錢磊等［20］的研究顯示，JAK1／STAT3信號(hào)通路具有神經(jīng)保護(hù)作用。在本研究中，經(jīng)舒肝解郁膠囊干預(yù) 后 大 鼠p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3 升高，用JAK1／STAT3 抑制劑后，敞箱實(shí)驗(yàn)得分與p-JAK1／JAK1、p-STAT3／STAT3 降 低，表 明 舒 肝 解郁膠囊能改善抑郁癥大鼠抑郁行為，保護(hù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，其機(jī)制與JAK1／STAT 3信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，舒肝解郁膠囊可能通過激活JAK1／STAT3信號(hào)通路改善抑郁癥大鼠的抑郁行為，促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活、抑制凋亡。舒肝解郁膠囊中不同化學(xué)成分的藥理作用不同，對(duì)抑郁癥的影響機(jī)制不一，今后可進(jìn)一步探討舒肝解郁膠囊作用于抑郁癥的其他機(jī)制，為抑郁癥的治療提供更多參考信息。