家蠶絲腺中Abd-A 3 種剪接體的克隆、序列分析及原核表達(dá)

路慶君，羅竹星，劉華偉，魏 夢，王 圓，張照鋒，李游山，

（1. 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2. 陜西理工大學(xué)秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西 漢中 723001；3. 西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

家蠶（Bombyx mori）是鱗翅目的典型昆蟲，由野蠶馴化而來，是以桑葉為食、吐絲結(jié)繭的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲。蠶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于蠶絲，而絲腺是家蠶高效合成和分泌絲蛋白的重要器官[1]。絲腺從形態(tài)和功能上主要分為吐絲部、前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺[2]，后部絲腺合成絲素蛋白，中部絲腺合成絲膠蛋白，二者合成分泌的蛋白質(zhì)共同進(jìn)入前部絲腺發(fā)生構(gòu)象變化后到達(dá)吐絲部，最終形成蠶絲[1]。家蠶發(fā)育至5 齡期時(shí)，食桑量大幅增加，大量合成絲蛋白[3]。絲腺的蛋白質(zhì)組學(xué)研究還鑒定到絲腺腔內(nèi)容物中含有氧化還原酶、蛋白激酶、蛋白酶、蛋白酶抑制劑、表皮蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等多種物質(zhì)[4]。目前已發(fā)現(xiàn)有大量轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控絲腺發(fā)育、絲蛋白基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、絲腺細(xì)胞凋亡等生命過程[5]。研究表明，絲蛋白合成過程中有多種調(diào)節(jié)因子參與，如SGF-B、BmFA、Ub2a和Ub2b復(fù)合體、TRIO 復(fù)合體、PSGF調(diào)節(jié)蛋白等絲腺特異轉(zhuǎn)錄因子[6]。

前人研究表明，多數(shù)種類昆蟲的組織部位是由同源基因決定的[7]。家蠶絲腺的分化受到Dfd、Scr、Antp、Ubx、eve等同源異型結(jié)構(gòu)域基因的調(diào)節(jié)[2]。Dfd、Scr、Antp、Ubx都屬于Hox基因，Hox基因是同源異型盒（Homeobox）家族的成員之一，它們沿著昆蟲身體前后軸指定的區(qū)段順序排列[8]，是一類專門調(diào)控生物形體的基因。果蠅中Hox基因包括觸角復(fù)合體（Antennapedia complex，ANT-C）和雙胸復(fù)合體（Bithorax complex，BX-C）兩大類群，ANT-C 包括Dfd、Scr、Antp、Lab、Pb基因，主要負(fù)責(zé)果蠅頭部和前胸部的體節(jié)分化、器官形成及功能調(diào)控；BX-C 包括Ubx、Abd-A和Abd-B基因，主要負(fù)責(zé)果蠅后胸部和腹部的體節(jié)分化、器官形成及功能調(diào)控[9‐13]。其中，轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 廣泛存在于多個(gè)物種中，最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)存在7種剪接體，參與果蠅第2至第8腹節(jié)的形成，主要調(diào)控前后體節(jié)軸分化、生殖腺和脂肪體發(fā)育及中腸的形成等生理過程[14‐17]。Abd-A 還參與調(diào)控鱗翅目、半翅目等昆蟲中色素沉著模式的形成[18‐19]。家蠶轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 至少有3 種剪接體，能夠影響家蠶胚胎早期發(fā)育，參與調(diào)節(jié)第3 至第6腹節(jié)的發(fā)育和腹足的形成[20]，還參與調(diào)控變態(tài)發(fā)育期間翅形成相關(guān)成蟲盤的分化和發(fā)育[21]。

已有研究表明，參與調(diào)控絲蛋白基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子多屬于HOX 和FOX 家族[22]，而屬于HOX 家族的轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 也可能參與絲蛋白基因表達(dá)，或絲腺中其他相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。目前，轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 在家蠶胚胎發(fā)育以及變態(tài)發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能研究較為豐富，但對于Abd-A 在絲腺中生理功能的認(rèn)識(shí)還十分有限，家蠶絲腺中Abd-A 的剪接體形式及在生物進(jìn)化中的地位尚未全面闡述。為此，從家蠶絲腺中克隆轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 的不同剪接體，利用生物信息學(xué)方法對其序列進(jìn)行比對分析以及空間結(jié)構(gòu)預(yù)測，構(gòu)建不同昆蟲Abd-A 的系統(tǒng)發(fā)育樹，明確其進(jìn)化地位，并對轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 進(jìn)行原核表達(dá)，為后續(xù)探究Abd-A的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試家蠶為非滯育品種D9L，由陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院保存。家蠶在自然光照條件下以新鮮桑葉進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25 ℃，相對濕度為（75±5）%。收集若干5 齡第6 天家蠶的前部、中部、后部絲腺組織，液氮速凍處理后置于-80 ℃冰箱保存。pSL1180載體、pCold-SUMO 載體均由西南大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院生物學(xué)研究中心提供。

1.2 試劑

TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega 公司；限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、NotⅠ、KpnⅠ、HindⅢ均購自Takara 公司；TransStart FastPfuDNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、Trans2K PlusⅡ DNA Marker、EasySeeWestern Marker（25～90 ku）、抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)Marker（14.4～116 ku）、HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超敏型ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自上海昂羽生物技術(shù)有限公司；宿主菌大腸桿菌BL21（DE3）、Isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）、SDS-PAGE電泳相關(guān)試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 家蠶絲腺中Abd-A 的克隆 以Abd-A、silkworm 為關(guān)鍵詞，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行檢索，下載家蠶Abd-A L的mRNA 序列（GenBank 登錄號(hào)：AB461860），基于BmAbd-A L的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，正向引物：5′-GAAGATCTATGGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGA‐GGATCTGAGTTCCAAGTTCATCATCGATAGCAT-3′（雙實(shí)線為引入的BglⅡ酶切位點(diǎn)，單虛線為引入的c-Myc 標(biāo)簽對應(yīng)的編碼序列），反向引物：5′-ATTTGCGGCCGCTTACGTGGGGACCTTGTTCACTT-3′（雙實(shí)線為引入的NotⅠ酶切位點(diǎn)）。使用TRIzol 試劑分別提取5齡第6天家蠶的前部絲腺（ASG）、中部絲腺（MSG）、后部絲腺（PSG）總RNA，并利用MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA[23]。分別以前部、中部、后部絲腺組織cDNA 為模板，采用以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃2 min；95 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，經(jīng)過切膠、酶切回收后，將目的片段連接至pSL1180 載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 菌株，菌液PCR 篩選獲得陽性克隆后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.2 不同昆蟲Abd-A 的多序列比對 將1.3.1 中克隆的家蠶Abd-A 剪接體BmAbd-A L（A59T）編碼的氨基酸序列在NCBI 中進(jìn)行BLAST 分析，下載其他昆蟲的Abd-A 編碼的氨基酸序列，與克隆的BmAbd-A L（A59T）編碼的氨基酸序列通過ClustalX 1.81 軟件進(jìn)行多序列比對。最后將多序列比對結(jié)果導(dǎo)入軟件GeneDoc程序中進(jìn)行展示。

1.3.3 不同昆蟲Abd-A 的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 以Abd-A 為關(guān)鍵詞，在NCBI 中進(jìn)行檢索，下載昆蟲綱中代表性物種的Abd-A 剪接體編碼的氨基酸序列（表1），利用MEGA 5.02軟件中的鄰接法（Neighborjoining 法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用1 000 次bootstrap重復(fù)來評(píng)估拓?fù)涞臏?zhǔn)確性[24]。

表1 不同昆蟲Abd-A的序列信息Tab.1 Sequence information of Abd-A from different insects

續(xù)表1 不同昆蟲Abd-A的序列信息Tab.1（Continued） Sequence information of Abd-A from different insects

續(xù)表1 不同昆蟲Abd-A的序列信息Tab.1（Continued） Sequence information of Abd-A from different insects

1.3.4 家蠶Abd-A 的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 分別選取BmAbd-A L（A59T）的Q186—K307 序列，BmAbd-A S 的Q186—K302 序列，BmAbd-A 3 的Q186—K298序列，通過PDB（https://www.rcsb.org/）比對搜索，選擇與上述序列一致性高于80%的ultrabithorax（PDB登錄號(hào)：4CYC）序列作為模板，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）同源建模在線軟件構(gòu)建Abd-A 的三維結(jié)構(gòu)模型，并以QMEAN 值對模型進(jìn)行評(píng)估，利用可視化軟件PyMOL對結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行展示。

1.3.5 家蠶絲腺中Abd-A 原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 以1.3.1中構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒BmAbd-A L（A59T）-pSL1180、BmAbd-A S-pSL1180、BmAbd-A 3-pSL1180 為模板，設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物，正向引物：5′-CGGGGTACCATGAGTTCCAAGTTCATCATCGA-3′（雙實(shí)線部分為引入的KpnⅠ酶切位點(diǎn)），反向引物：5′-CCCAAGCTTTTACGTGGGGACCTTGTTCAC-3′（雙實(shí)線部分為引入的HindⅢ酶切位點(diǎn)）。采用以下程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95 ℃2 min；95 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。參照1.3.1 中的方法將目的片段克隆至pCold-SUMO 表達(dá)載體中。將pCold-SUMO 載體（對照組）及重組表達(dá)質(zhì)粒（試驗(yàn)組）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）菌株，在37 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L或0.5 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h。6 000 r/min離心30 min收集菌體，用結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 值7.9）重懸菌體，經(jīng)過超聲破碎、離心，分別收集菌體上清和沉淀，然后利用12.5% SDSPAGE 進(jìn)行電泳分離，最后用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。

1.3.6 Western blot 分析 將1.3.5 中誘導(dǎo)表達(dá)的上清樣品用12.5% SDS-PAGE 電泳分離后，電轉(zhuǎn)印跡至硝酸纖維素膜上。加入5%脫脂奶粉，4 ℃封閉過夜。分別以抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體（1∶1 000）和HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶40 000）作為一抗和二抗，利用超敏型ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，然后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶絲腺中Abd-A的克隆及序列分析

為探究轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 在家蠶絲腺中的剪接形式，對Abd-A 進(jìn)行了克隆，PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，前部、中部、后部絲腺中分別擴(kuò)增出1 000 bp左右的目的條帶（圖1A）。將前部、中部、后部絲腺中擴(kuò)增出的目的片段混合后連接至pSL1180載體。菌液PCR檢測結(jié)果顯示，6 個(gè)克隆均出現(xiàn)1 000 bp 左右的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1B）。經(jīng)測序和序列比對，發(fā)現(xiàn)家蠶絲腺中至少存在3種不同的Abd-A mRNA剪接體，它們的編碼區(qū)全長分別為1 059、1 044、1 032 bp（圖1C）。與編碼區(qū)為1 059 bp 的剪接體相比，編碼區(qū)為1 044 bp 的剪接體缺少第605—619 區(qū)（編碼氨基酸為DFPFP），編碼區(qū)為1 032 bp 的剪接體缺少第605—619 區(qū)和第652—663 區(qū)（編碼氨基酸為GEFN）。需要指出的是，編碼區(qū)為1 044、1 032 bp的剪接體在第174—175區(qū)的堿基為GG，而編碼區(qū)為1 059 bp 的剪接體在此區(qū)的堿基為AA。進(jìn)一步將3 種剪接體編碼的氨基酸序列在NCBI 中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)為1 044、1 032 bp 的剪接體編碼的氨基酸序列分別與已公布的家蠶Abdominal-A isoform S 和Abdominal-A isoform 3 的序列一致，故命名為BmAbd-A S、BmAbd-A 3；編碼區(qū)為1 059 bp的剪接體編碼的氨基酸序列與家蠶Abdominal-A isoform L 的序列在第59 位氨基酸有差異，該剪接體編碼蛋白質(zhì)的第59 位氨基酸由Ala 突變?yōu)門hr，將其命名為BmAbd-A L（A59T）。

圖1 家蠶絲腺中Abd-A的克隆及序列比對Fig.1 Cloning and sequence alignment of Abd-A from silk gland of B.mori

2.2 不同昆蟲Abd-A的多序列比對

為了鑒定不同昆蟲間的Abd-A 序列在結(jié)構(gòu)或功能上的重要保守區(qū)域和差異性位點(diǎn)，選擇菜粉蝶、中華蜜蜂、紅火蟻、黑腹果蠅、埃及伊蚊、赤擬谷盜、螢火蟲Abd-A編碼的氨基酸序列與家蠶Abd-A L（A59T）進(jìn)行多序列比對，結(jié)果如圖2 所示。家蠶Abd-A L（A59T）的氨基末端序列與菜粉蝶、赤擬谷盜、螢火蟲、中華蜜蜂、紅火蟻、黑腹果蠅相似性較高，但與埃及伊蚊差異較大；其羧基末端序列與菜粉蝶、赤擬谷盜、螢火蟲、中華蜜蜂、紅火蟻相似性較高。從整體上看，這些昆蟲的Abd-A 氨基酸序列差異較大，然而它們都具有Homeobox domain 和Abd-A domain 2 個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，其中Homeobox domain的氨基酸序列完全相同，該區(qū)域是DNA 結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域；Abd-A domain 的氨基酸序列羧基末端序列差異明顯，該區(qū)域?yàn)锳bd-A 的激活結(jié)構(gòu)域，其主要作用為轉(zhuǎn)錄激活。

圖2 不同昆蟲Abd-A的多序列比對結(jié)果Fig.2 Multiple sequence alignment results of Abd-A from different insects

2.3 家蠶絲腺中Abd-A的3種剪接體的三維結(jié)構(gòu)分析

為探究Abd-A 的3 種剪接體的空間結(jié)構(gòu)差異，利用SWISS-MODEL 同源建模軟件對Abd-A 的3 種剪接體編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。BmAbd-A L（A59T）、BmAbd-A S、BmAbd-A 3 三維結(jié)構(gòu)的QMEAN 值分別為0.64、0.59、0.61，它們的三維結(jié)構(gòu)中均有4 個(gè)α 螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。BmAbd-A L（A59T）三維結(jié)構(gòu)中，α1 螺旋由P195—M197 組成，α2 螺旋由R236—F248 組成，α3 螺旋由R254—L264 組成，α4 螺旋由E268—V289 組成（圖3A）；BmAbd-A S 三維結(jié)構(gòu)中，α1 螺旋由P195—S198 組成，α2 螺旋由R231—F243 組成，α3 螺旋由R249—L259 組成，α4 螺旋由E263—V284 組成（圖3B）；BmAbd-A 3 三維結(jié)構(gòu)中，α1 螺旋由P195—M197 組成，α2 螺旋由R227—F239 組成，α3 螺旋由R245—L255 組成，α4 螺旋由E259—V280 組成（圖3C）。將Abd-A 的3 種剪接體編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們的α2 螺旋、α3 螺旋、α4 螺旋結(jié)構(gòu)中的氨基酸組成相同，而α1螺旋結(jié)構(gòu)之間具有差異，BmAbd-A L（A59T）與BmAbd-A 3 中的α1 螺旋結(jié)構(gòu)均由3個(gè)氨基酸組成，BmAbd-A S 中的α1螺旋則由4個(gè)氨基酸組成。另外，α1螺旋與α2螺旋之間的無規(guī)則卷曲部分差異更大，與BmAbd-A S、BmAbd-A 3相比，BmAbd-A L（A59T）在此區(qū)域的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)更靈活，更易于產(chǎn)生構(gòu)象變化（圖3D）。

圖3 家蠶絲腺中Abd-A 3種剪接體編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)Fig.3 Three-dimensional structure of proteins encoded by three spliceosomes of Abd-A in silk gland of B.mori

2.4 不同昆蟲Abd-A的系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步研究家蠶絲腺中的3 種Abd-A 剪接體與其他昆蟲Abd-A 的親緣關(guān)系，選擇了35 種昆蟲的83 條Abd-A 序列（表1），構(gòu)建不同昆蟲Abd-A的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。從圖4 可以看出，多數(shù)昆蟲中的Abd-A 也存在不同剪接形式，其編碼的氨基酸序列也各有差異，形成3個(gè)進(jìn)化分支，膜翅目與鞘翅目聚為一支，雙翅目、鱗翅目分別為獨(dú)立的一支，基本符合物種的親緣進(jìn)化關(guān)系，說明Abd-A 的分子進(jìn)化過程與物種系統(tǒng)進(jìn)化一致。鞘翅目一支中，包括赤擬谷盜、瓢蟲、螢火蟲等7 個(gè)代表性物種，其中蜣螂的4 條Abd-A 氨基酸序列聚為獨(dú)立的一支；膜翅目一支中，包括中華蜜蜂、紅褐大齒猛蟻、紅火蟻等13 個(gè)代表性物種；鱗翅目一支中，包括家蠶、大蠟螟、玉米螟等10個(gè)代表性物種，其中菜粉蝶、小斑草眼蝶、帕眼蝶、夏威夷紅蛺蝶、黑脈金斑蝶、偏瞳蔽眼蝶的Abd-A 氨基酸序列聚為一支，家蠶、大蠟螟、玉米螟、海波斯莫科馬屬蛾的Abd-A 氨基酸序列聚為一支；雙翅目一支中，包括橘小實(shí)蠅、黑腹果蠅、黑水虻、甘藍(lán)癭蚊、埃及伊蚊，其中橘小實(shí)蠅、黑腹果蠅、黑水虻、甘藍(lán)癭蚊的Abd-A 氨基酸序列聚為一支，埃及伊蚊的Abd-A 氨基酸序列單獨(dú)聚為一支。家蠶的Abd-A 氨基酸序列與螟蛾科的大蠟螟在進(jìn)化關(guān)系上更近，其次為玉米螟。

圖4 不同昆蟲Abd-A的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Abd-A from different insects

2.5 家蠶絲腺中Abd-A的原核表達(dá)

2.5.1 轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 以構(gòu)建至pSL1180載體的3種Abd-A 剪接體的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出含限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的目的片段BmAbd-A L（A59T）、BmAbd-A S、BmAbd-A 3（圖5A），然后將目的片段連接至pCold-SUMO 表達(dá)載體。菌液PCR 檢測及測序結(jié)果顯示，Abd-A 的3 種剪接體的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖5B）。將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）菌株，以0.2、0.5 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，用12.5% SDSPAGE 電泳分離檢測。BmAbd-A L（A59T）、BmAbd-A S、BmAbd-A 3編碼蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量分別為38.31、37.68、37.23 ku，它們表達(dá)的攜有6×His-SUMO 標(biāo)簽融合蛋白的理論分子質(zhì)量分別為52.99、52.35、51.91 ku。圖6 結(jié)果顯示，0.2、0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)的菌體上清中均檢測到1 條52 ku 左右的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期大小基本一致，表明Abd-A 的3種剪接體的融合蛋白均以可溶形式表達(dá)。同時(shí)，在對照組菌體上清中檢測到6×His-SUMO標(biāo)簽蛋白的表達(dá)條帶，其理論分子質(zhì)量為16.29 ku。

圖5 家蠶絲腺中Abd-A的原核表達(dá)載體構(gòu)建Fig.5 Construction of prokaryotic expression vectors of Abd-A from silk gland of B.mori

2.5.2 轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 重組蛋白的Western blot分析 利用Western blot 進(jìn)一步分析Abd-A 的3 種剪接體重組蛋白的表達(dá)情況。圖7結(jié)果顯示，Abd-A的3 種剪接體重組蛋白均能與抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，在40～60 ku 處各檢測到1 條特異蛋白質(zhì)條帶，與目的蛋白大小一致，表明蛋白質(zhì)條帶分別為BmAbd-A L（A59T）、BmAbd-A S、BmAbd-A 3重組蛋白。

圖7 Abd-A的3種剪接體重組蛋白的Western blot分析Fig.7 Western blot analysis of recombinant proteins of three Abd-A spliceosomes

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，Abd-A 在5 齡第6 天家蠶的前部、中部、后部絲腺中都有表達(dá)。前人利用RT-PCR 技術(shù)也分別探究了Abd-A 在5 齡第2 天和5 齡第3 天家蠶絲腺中的表達(dá)情況，對于家蠶日系二化性品種Kinshu×Showa，Abd-A 在5 齡第2 天的中部絲腺和后部絲腺中都有表達(dá)，而在前部絲腺中沒有表達(dá)[25]；對于家蠶日系多化性N4 品種，Abd-A 在5 齡第3 天的前中部絲腺和后部絲腺中都有表達(dá)[26]。這與本研究的結(jié)果不盡相同，可能與其采用的家蠶品系、絲腺所處的發(fā)育階段不同有關(guān)。由于絲腺各區(qū)段在不同發(fā)育階段的生理狀態(tài)不同，其基因時(shí)空表達(dá)模式也會(huì)有所差異。本研究中，BmAbd-A S、BmAbd-A 3編碼區(qū)的第174—175位堿基均為AA，而BmAbd-A L（A59T）編碼區(qū)的第174—175位堿基為GG。測序結(jié)果表明，該突變并非PCR 擴(kuò)增引起的隨機(jī)突變，推測這可能是同源染色體上等位基因間的堿基突變造成的序列差異。本研究采用家蠶D9L 品系對Abd-A 基因進(jìn)行了鑒定，與前人采用家蠶N4 品系鑒定的Abd-A 基因序列有差異[25]，這可能與品種差異有關(guān)。需要指明的是，本研究從家蠶絲腺中克隆到Abd-A 的3 種剪接體，但不排除絲腺中還存在其他剪接體的可能性。

轉(zhuǎn)錄因子在分子結(jié)構(gòu)上通常含有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、與配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域等[27]，能夠協(xié)同其他因子對下游靶標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[5]。不同昆蟲Abd-A 的多序列比對結(jié)果顯示，Abd-A 編碼的氨基酸序列都具有完全保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Homeobox domain，這是Abd-A 作為Hox家族轉(zhuǎn)錄因子的特有結(jié)構(gòu)域，它們可專一地調(diào)控生物形體的構(gòu)建；而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域Abd-A domain的羧基端序列在不同昆蟲間存在較大差異，這可能與Abd-A 在不同昆蟲中的生理功能差異有關(guān)。Abd-A 的3 種剪接體編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)比對結(jié)果顯示，它們的α 螺旋結(jié)構(gòu)幾乎重疊，其中包括Abd-A的必需結(jié)構(gòu)域；而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)差異較大。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中已公布的Abd-A 序列，發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于多個(gè)物種中，昆蟲來源居多。來自35種昆蟲的Abd-A 氨基酸序列形成了3 個(gè)進(jìn)化分支，膜翅目與鞘翅目聚為一支，雙翅目、鱗翅目分別為獨(dú)立的一支，基本符合物種的遺傳進(jìn)化規(guī)律。

Abd-A 的功能最早在果蠅中進(jìn)行了研究，它界定在A4—A7 段，影響心臟的發(fā)育[28]。Abd-A 的表達(dá)受到長鏈非編碼RNA 如iab-8 的調(diào)控，其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致果蠅胚胎發(fā)育缺陷[29‐31]。Abd-A 在昆蟲體節(jié)和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，是害蟲遺傳控制的可能靶標(biāo)[32‐35]。在家蠶中Abd-A 能夠與轉(zhuǎn)錄因子POU-M2 相互作用，誘導(dǎo)家蠶蛹期的翅原基表皮蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)家蠶從幼蟲到蛹的轉(zhuǎn)變[21，36]。另有研究表明，家蠶絲腺中絲蛋白基因的區(qū)域特異性表達(dá)受到幾個(gè)包含同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[37]，如Antp 和Awh 對絲蛋白基因的直接調(diào)控[25，38‐39]。Abd-A 與Antp 和Awh 都是屬于Hox 家族編碼的轉(zhuǎn)錄因子，且Abd-A 在絲腺中有表達(dá)，這也暗示轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 也可能對家蠶絲腺中相關(guān)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)由于能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，成本較低，為應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)[40]。本研究選擇大腸桿菌BL21（DE3）菌株進(jìn)行原核表達(dá)，成功獲得大量Abd-A 重組蛋白，這可為后續(xù)利用EMSA、Pull-Down 等方法研究Abd-A 的功能及其對絲腺中相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

綜上，本研究成功從家蠶絲腺中克隆到Abd-A的3 種剪接體，并利用生物信息學(xué)方法分析了其序列特征、空間結(jié)構(gòu)和不同昆蟲間Abd-A 的進(jìn)化關(guān)系，通過原核表達(dá)獲得了可溶性的重組蛋白，這為后期研究轉(zhuǎn)錄因子Abd-A 調(diào)控家蠶絲腺中某些相關(guān)基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。