辣椒枯萎病生物防治研究進(jìn)展

趙志祥，嚴(yán)婉榮，王 寶，何 舒，曾向萍，肖彤斌

（海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/海南省植物病蟲(chóng)害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?？谧魑镉泻ι锟茖W(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南 ?？?571100）

辣椒枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的頑固性土傳病害，在熱帶、亞熱帶和溫帶辣椒種植區(qū)均有發(fā)生，給辣椒生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。20 世紀(jì)50 年代，我國(guó)首次報(bào)道該病[2]。隨后，墨西哥[3]、埃塞俄比亞[4]、巴基斯坦[5]和埃及[6]等地也相繼報(bào)道。近年，隨著北方設(shè)施蔬菜和南方冬季露地瓜菜的盛行，辣椒種植面積不斷擴(kuò)大，病原菌在土壤中的積累越來(lái)越多，枯萎病的發(fā)生逐年加重。目前，該病害在海南、湖南、黑龍江、上海、山東、浙江等辣椒主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[7]。

對(duì)于該病的防治，生產(chǎn)上以化學(xué)藥劑為主，但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，增加了辣椒枯萎病的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，而且對(duì)生態(tài)環(huán)境和人畜健康產(chǎn)生不利影響[8]。因此，安全、高效、環(huán)境友好型的生物防治方法，已成為辣椒枯萎病防治的研究熱點(diǎn)[9]。鑒于此，綜述近20 a 來(lái)國(guó)內(nèi)外用于辣椒枯萎病生物防治的微生物種類(lèi)、植物來(lái)源及其生防機(jī)制研究進(jìn)展，分析目前生防產(chǎn)品使用中存在的問(wèn)題，并對(duì)辣椒枯萎病生物防治的未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行展望，為辣椒枯萎病生物防治研究和應(yīng)用提供參考。

1 辣椒枯萎病的生防微生物種類(lèi)

辣椒枯萎病生防微生物主要包括生防真菌、細(xì)菌和放線菌。生防真菌主要有木霉菌（Trichodermaspp.）、叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）、非致病尖孢鐮刀菌（Non‐pathogenicF.oxysporum）和其他寄生性真菌。該類(lèi)真菌可以優(yōu)先占據(jù)植物體表的侵入點(diǎn)，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，阻礙病原菌的侵入，從而抑制病原菌生長(zhǎng)。生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌（Bacillusspp.）、假單胞桿菌（Pseudomonasspp.）和少數(shù)其他拮抗細(xì)菌，主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、抗生等作用方式抑制病原菌生長(zhǎng)或直接滅殺病原菌，或者影響土壤酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)間接抑制病原菌的生長(zhǎng)，或者誘導(dǎo)辣椒產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，提高抗病能力。由于生防細(xì)菌具有繁殖速度快、易定殖、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，成為辣椒枯萎病等多種植物病害生物防治研究的熱點(diǎn)。放線菌是重要的拮抗菌，產(chǎn)生抗生素是其抑制植物病原菌生長(zhǎng)的主要方式。目前研究報(bào)道最多的生防放線菌為鏈霉菌（Streptomycesspp.）。表1簡(jiǎn)要列出了近年來(lái)用于辣椒枯萎病生物防治的菌株類(lèi)型、作用方式等。

表1 辣椒枯萎病生物防治策略Tab.1 Biocontrol strategies used for the management of Fusarium wilt of pepper

1.1 真菌

用于辣椒枯萎病生物防治的真菌主要有木霉、叢枝菌根、非致病尖孢鐮刀菌和其他寄生性真菌等。

1.1.1 木霉菌 木霉菌廣泛分布于土壤、海水、河流、湖泊、堆肥和植物體表等生態(tài)環(huán)境中，極易分離和培養(yǎng)，對(duì)多種植物病原菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，且能夠分解纖維素，是一種理想的生防菌。已報(bào)道用于辣椒枯萎病防治的主要有哈茨木霉（T.harzianum）、淡綠木霉（T. viride）、刺孢木霉（T.asperellum）和深綠木霉（T. aureiviride）等[9‐12]。HEWEDY 等[9]用體外培養(yǎng)的方法研究了4 種木霉菌對(duì)辣椒尖孢鐮刀菌的拮抗作用，結(jié)果表明，體外抑菌率為35.71%～85.75%；在離體培養(yǎng)條件下以刺孢木霉菌株ta3 和tl 對(duì)辣椒尖孢鐮刀菌的拮抗能力較強(qiáng)；在溫室條件下以哈茨木霉菌株th7 和th6 防治病害的效果最為顯著。SAHI等[10]評(píng)價(jià)了哈茨木霉、淡綠木霉、康氏木霉（T.koningii）、深綠木霉和擬康氏木霉（T. pseudokoningii）對(duì)辣椒尖孢鐮刀菌的體外抑制作用。其中，淡綠木霉體外抑制活性最強(qiáng)，抑制率為62.00%；其余依次為哈茨木霉（36.00%）、深綠木霉（24.00%）、康氏木霉（18.00%）和擬康氏木霉（6.00%）。BHAT 等[11]測(cè)定了多種木霉菌對(duì)辣椒尖孢鐮刀菌的抑菌活性，結(jié)果表明，哈茨木霉1、2、5號(hào)菌株和淡綠木霉2號(hào)菌株的生長(zhǎng)速率明顯快于鐮刀菌，且對(duì)鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為40.00%～50.00%；淡綠木霉2 號(hào)菌株較好地抑制枯萎病菌并使辣椒間接增產(chǎn)30.00%；哈茨木霉1 號(hào)菌株可使枯萎病發(fā)病率降低39.70%。 此外，DAR 等[12]、REPALLE 等[13]也發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉、淡綠木霉對(duì)辣椒枯萎病菌有一定的抑制活性。

研究特定的木霉菌株對(duì)辣椒枯萎病菌的作用機(jī)制及對(duì)枯萎病的防治效果，對(duì)于優(yōu)選木霉菌株從而提高生物防治效率具有重要意義。目前，生產(chǎn)上應(yīng)用的木霉菌制劑多為活孢子制劑，常受到田間溫度、濕度、雨水、土壤微生物和化學(xué)農(nóng)藥等因素的干擾，大田防治效果不穩(wěn)定，限制了木霉活孢子制劑的大面積推廣。

1.1.2 叢枝菌根 AM 普遍存在于大多數(shù)陸生植物中并與根系形成共生關(guān)系，有利于植物的營(yíng)養(yǎng)吸收、生長(zhǎng)和存活。AM 在營(yíng)養(yǎng)循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，保護(hù)植物免受不利環(huán)境條件的脅迫。植物根系中的AM 已被證實(shí)可以減少植物土傳病原菌造成的危害，增強(qiáng)菌根植物的抗性。JAMIOLKOWSKA 等[14]研究了AM 對(duì)甜椒幼苗的促生作用及對(duì)枯萎病的防治效果，結(jié)果表明，接種AM 的根系比單獨(dú)接種尖孢鐮刀菌的根系發(fā)育得好，且甜椒的生長(zhǎng)速度和莖干質(zhì)量更高，間接促進(jìn)了甜椒幼苗的光合作用。AM與其他生防微生物混合使用能夠起到更好的防病促生效果。AL‐MORAD 等[15]報(bào)道了AM 和哈茨木霉混合使用較單一使用能更好地促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)并提高抗枯萎病的能力，分析辣椒與其防御反應(yīng)相關(guān)的一系列形態(tài)和生物化學(xué)改變發(fā)現(xiàn)，AM 和哈茨木霉均能誘導(dǎo)辣椒防御酶活性的升高。JALALULDEEN等[16]通過(guò)接種AM 真菌Glomus mosseae，研究了AM和放線菌對(duì)辣椒枯萎病的防治作用，在接種后第10天，放線菌+AM 處理的辣椒根過(guò)氧化物酶（POD）活性比清水對(duì)照提高了186.90 倍，而接種AM 的辣椒根POD活性提高了167.20%；此外，其他防御酶活性也相應(yīng)升高。結(jié)果表明，AM 和放線菌混合接種降低了辣椒根死亡率，提高了辣椒苗木質(zhì)化程度，增加了同工酶含量，明顯抑制了尖孢鐮刀菌對(duì)辣椒苗的侵染，并能誘導(dǎo)辣椒抗枯萎病。KUMAR 等[17]篩選出11 株AM，其中，Glomus bagyarajii提高辣椒株高、莖圍、植物總質(zhì)量以及菌根定殖的效果最好，且最重要的是，與清水對(duì)照相比，Glomus bagyarajii能顯著降低辣椒發(fā)病率，說(shuō)明Glomus bagyarajii對(duì)辣椒多種病害具有一定的生防潛力?？梢?jiàn)，AM 對(duì)辣椒苗期枯萎病具有顯著防效，因此，可以將生態(tài)系統(tǒng)中豐富的AM 資源應(yīng)用于辣椒育苗環(huán)節(jié)，為辣椒規(guī)?；a(chǎn)中苗期枯萎病的防治提供一條經(jīng)濟(jì)有效的生防途徑。同時(shí)，由于AM 與其他生防微生物搭配使用具有較好潛能，生產(chǎn)上可以將不同類(lèi)型、不同作用機(jī)制的生防菌與AM 混合使用，以提高其防病促生和誘導(dǎo)抗枯萎病能力。

1.1.3 非致病尖孢鐮刀菌 非致病性尖孢鐮刀菌利用弱毒株系的交互保護(hù)作用，通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)局部及系統(tǒng)抗性，減輕致病性尖孢鐮刀菌侵染引起的病害發(fā)生程度。爭(zhēng)奪空間和營(yíng)養(yǎng)、產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物和誘導(dǎo)抗性是其對(duì)病原體的不同作用方式。據(jù)報(bào)道，非致病性尖孢鐮刀菌可與生物防治劑和特定的殺菌劑兼容[18]。該類(lèi)菌株在與其他土壤微生物競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程中，誘導(dǎo)分泌出大量化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能多樣的次生代謝產(chǎn)物。次生代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制包括真菌寄生、抗生、競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)植物抗性和植物化學(xué)變化，以及形成生物肥料和產(chǎn)生有益酶等。事實(shí)證明，非致病性鐮刀菌也表現(xiàn)得像內(nèi)生菌一樣，進(jìn)入宿主系統(tǒng)并誘導(dǎo)防御反應(yīng)[19]。詹洪[20]研究發(fā)現(xiàn)，接種非致病尖孢鐮刀菌7 d 后再接種各寄主對(duì)應(yīng)的致病菌株，非致病性菌株FJAT-92 對(duì)辣椒枯萎病的盆栽防效為63.00%。非致病性尖孢鐮刀菌FO47已被證實(shí)對(duì)多種尖孢鐮刀菌有生防效果，其作用機(jī)制包括與致病性尖孢鐮刀菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)等[21]。JOSHI 等[22]從印度北阿坎德邦土壤和植物樣本中分離鑒定出48株尖孢鐮刀菌，其中1 株對(duì)辣椒具有極強(qiáng)的致病性，11 株是非致病菌。在體外聯(lián)合培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，65號(hào)非致病菌株表現(xiàn)出的拮抗辣椒尖孢鐮刀菌能力最強(qiáng)。然而，微生物種間的這種干擾作用往往易受各種因素影響。同時(shí)，在大面積應(yīng)用時(shí)，必須考慮選用無(wú)致病力或弱致病力菌株，并注意防止新選擇的誘導(dǎo)菌的致病性變異問(wèn)題，否則產(chǎn)生的后果將不堪設(shè)想。

1.1.4 其他寄生性真菌 其他寄生性真菌包括植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）、土壤寄生真菌（Soil parasitic fungi）和昆蟲(chóng)病原真菌（Entomopathogenic fungi）等。植物內(nèi)生真菌寄生于寄主植物體內(nèi)，具有競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)的特性，被用于植物病害尤其是枯萎病、疫病等土傳病害的防治。MMBAGA 等[23]從山茱萸（Cornus florida）莖組織中分離得到16 株內(nèi)生真菌。其中，一株內(nèi)生真菌A22F1（Nigrospora sphaerica）顯著降低了3 個(gè)辣椒品種的疫病發(fā)生率，其在離體條件下對(duì)辣椒和番茄尖孢鐮刀枯萎病菌也有一定的生物活性。昆蟲(chóng)病原真菌主要有白僵菌（Beauveriaspp.）、綠僵菌（Metarhiziumspp.）等。EL‐KICHAOUI 等[24]首次報(bào)道了球孢白僵菌（B.bassiana）對(duì)加沙地區(qū)辣椒枯萎病具有一定的防治效果，并利用半流體技術(shù)測(cè)定了球孢白僵菌對(duì)辣椒枯萎病菌的室內(nèi)抑制作用，而后在田間條件下比較了其與多種化學(xué)殺菌劑的防效差異，結(jié)果表明，蟲(chóng)生真菌尤其是球孢白僵菌是防治辣椒枯萎病的理想菌種資源。JABER 等[25]通過(guò)平板對(duì)峙和盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌菌株Naturalis 和綠僵菌菌株Bipesco 5 能夠降低辣椒枯萎病的發(fā)生率和危害程度，并促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)。其作用方式為競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位以及產(chǎn)生抗生素，這是首次采用綠僵菌防治植物病害的報(bào)道。此外，部分真菌寄生或腐生于土壤中，更具有競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位的優(yōu)勢(shì)。菌株LJS2L1 是從辣椒根際農(nóng)家肥土壤中分離出的一株毛殼菌（Chaetomium），該菌對(duì)辣椒尖孢鐮刀菌萎蔫專(zhuān)化型有較好的抑制作用，且對(duì)辣椒其他土傳病害也有一定的拮抗作用[26]。莫維弟等[27]也發(fā)現(xiàn)，毛殼菌菌株LB010402 對(duì)辣椒枯萎病菌有較好的抑制作用，抑制率為60.47%。

1.2 細(xì)菌

目前，研究較多的用于辣椒枯萎病生物防治的細(xì)菌有芽孢桿菌、假單胞桿菌和少數(shù)其他拮抗細(xì)菌。

1.2.1 芽孢桿菌 研究表明，芽孢桿菌能有效防治植物病害，尤其是植物土傳病害。ABADA 等[28]報(bào)道，殼聚糖芽孢桿菌（B. chitinosporus）、凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans）、腐殖芽孢桿菌（B. humilus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）均能顯著降低辣椒枯萎病的發(fā)病率，其中，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌在質(zhì)量濃度為60 mg/mL 時(shí)，完全抑制病原菌的生長(zhǎng)，土壤中加入殼聚糖芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、腐殖芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌后，辣椒的株高和產(chǎn)量均高于清水對(duì)照。YANTI 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，5 株番茄根部?jī)?nèi)生菌對(duì)辣椒枯萎病有較好的防治效果，經(jīng)鑒定，均為芽孢桿菌，其中，假蕈狀芽孢桿菌（B.pseudomycoides）NBRC101232、蘇云金芽孢桿菌ATCC10792 和蕈狀芽孢桿菌（B.mycoides）兼具防治辣椒枯萎病和青枯病的潛力。CHOWDHURY 等[30]發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌LBF-01 對(duì)辣椒尖孢鐮刀枯萎病菌有較好地抑制活性，并能促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)，田間條件下施用LBF-01，枯萎病的發(fā)生率僅為清水對(duì)照的1/9；種子滅菌后，LBF-01處理的種子萌發(fā)潛力和幼苗活力較清水對(duì)照分別提高24.00%和52.80%。芽孢桿菌是研究最多的生物防治制劑之一，其誘導(dǎo)抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的潛力在小麥、玉米、大豆、辣椒、番茄、土豆、黃瓜等多種農(nóng)作物中得到證實(shí)[31]。

枯草芽孢桿菌Cas15能顯著降低辣椒枯萎病的發(fā)病率，并能誘導(dǎo)辣椒對(duì)枯萎病產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，Cas15 處理后的辣椒株高比清水對(duì)照增加27.24%～54.53%，平均單果質(zhì)量增加36.92%，平均單株產(chǎn)量增加49.68%，顯著提高了辣椒產(chǎn)量[32]。WU 等[33]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌SL-44顯著提高辣椒防御酶，包括POD、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性；SL-44 處理的辣椒幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性也有所提高；辣椒抗性基因CaPIN Ⅱ的表達(dá)量顯著增加；SL-44濾液使辣椒枯萎病菌菌絲破裂，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致該病原菌死亡?？梢?jiàn)，枯草芽孢桿菌SL-44 不僅能誘導(dǎo)辣椒幼苗的系統(tǒng)抗性，而且還能產(chǎn)生抗真菌化合物，從而抑制甚至破壞枯萎病菌菌絲的生長(zhǎng)。混合施用枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌能進(jìn)一步提高植株的防病促生能力。WU 等[34]報(bào)道，在溫室條件下，解淀粉芽孢桿菌ljx101 和枯草芽孢桿菌lja002 混合施用可使辣椒的成活率提高58.42%，根系中PPO、POD 和SOD 活性較單獨(dú)接種辣椒枯萎病菌處理分別提高45.54%、68.78%和46.21%。

解淀粉芽孢桿菌廣泛分布于自然環(huán)境，產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物，直接或間接地對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量和誘導(dǎo)植物抗病性。因此，在植物病害生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可以減輕化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的壓力。2019 年，全球新增生物殺菌/線蟲(chóng)劑13種，其中，3 種來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌及其組合物[35]。解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生伊枯草菌素（Iturin）、芽孢菌霉素（Bacillomycin）、桿菌溶素（Bacilysin）、泛革素（Fengycin）、表面活性素（Surfactin）等脂肽（Lipopeptide）類(lèi)活性物質(zhì)，能夠防治多種植物病害[36]。解淀粉芽孢桿菌菌株P(guān)PL 抗菌譜較廣，其產(chǎn)生的3 種類(lèi)型的環(huán)脂肽（Cyclic lipopeptides，CLPs）對(duì)辣椒和番茄多種真菌病害有較好的抑制效果。不同類(lèi)型CLPs 的防治對(duì)象不盡相同，Iturin A 對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌活性比Fengycin 高73%～80%；Fengycin 對(duì)茄科尖孢鐮刀菌的抑菌活性則高于Iturin A。經(jīng)LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，菌株P(guān)PL培養(yǎng)濾液中抗枯萎病菌化合物主要是一系列的Fengycin 亞型，包括F1、F2 和F3。其中，F(xiàn)1 的抑菌活性強(qiáng)于另外2種亞型[37]。ZHAO 等[38]發(fā)現(xiàn)，含解淀粉芽孢桿菌JDF35 的生物有機(jī)肥處理后，辣椒根圍細(xì)菌群體多樣性比清水對(duì)照高，而真菌群體多樣性比清水對(duì)照低，菌株JDF35極大地降低了鐮刀菌的豐度，改變根圍微生物群落結(jié)構(gòu)，抑制尖孢鐮刀枯萎病菌的侵染，促進(jìn)辣椒的生長(zhǎng)。

1.2.2 假單胞桿菌 假單胞桿菌普遍存在于植物根際和果蔬表面，是根際促生菌（Plant growth promoting rhinoacteria，PGPR）的主要菌群，往往將其與其他根際細(xì)菌混合施用，對(duì)枯萎病、疫病等多種土傳病害起協(xié)同防治的作用。BASCO 等[39]在蚯蚓糞肥中添加假單胞桿菌（GenBank accession No.JN128891）、哈茨木霉（ATCC No.PTA3701）和枯草芽孢桿菌（GenBank accession No.JN099686）組成生物強(qiáng)化劑，體外試驗(yàn)表明，所選微生物均對(duì)尖孢鐮刀菌具有拮抗作用，各菌株單獨(dú)或聯(lián)合添加時(shí)，均能顯著提高辣椒和番茄各防御酶活性，促進(jìn)其生長(zhǎng)，降低枯萎病的發(fā)生率。該研究中基于假單胞桿菌生物防治辣椒枯萎病的最佳方法是聯(lián)合假單胞桿菌、哈茨木霉和枯草芽孢桿菌共同防治。SACHDEV 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞桿菌Tr20 對(duì)離體條件下茄科蔬菜枯萎病菌和赤霉病菌均表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，能夠產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶類(lèi)，如幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和纖維素酶等；在雙層瓊脂培養(yǎng)法中，揮發(fā)性代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)濾液對(duì)2 種病原菌的抑制率分別為67.85%、51.38%和41.74%、38.52%，揭示了Tr20不僅具有寄生和抗生作用，還具有促進(jìn)茄科作物生長(zhǎng)的活性，如產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）、鐵載體、氨和溶解磷酸鹽等。此外，熒光假單胞桿菌單獨(dú)或與其他生防制劑混合施用，既能有效抑制辣椒枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)，又能誘導(dǎo)辣椒產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[12，41]。

熒光假單胞桿菌是研究得最多的一類(lèi)假單胞桿菌。由于其可產(chǎn)生蛋白酶、嗜鐵素和赤霉素等具有抗生和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用的次生代謝物質(zhì)，對(duì)枯萎病等土傳病害具有較好的防治效果，具有開(kāi)發(fā)成生防制劑的潛力。在進(jìn)一步的研究中，可以通過(guò)遺傳修飾技術(shù)增加菌株中功能基因的數(shù)量，并且可以與發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高菌株產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)的能力[42]。隨著分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)研究的逐步深入，通過(guò)基因技術(shù)可以將人們期望的功能基因?qū)氩⒄系綗晒饧賳伟麠U菌的基因組中，創(chuàng)造出適合在多種環(huán)境中定殖的熒光假單胞桿菌工程菌，以防治辣椒枯萎病等植物土傳病害，這必將成為研究熱點(diǎn)。

1.2.3 其他拮抗細(xì)菌 自然環(huán)境中也有少量其他種屬，或者未被鑒定、只能根據(jù)其部分功能特性進(jìn)行區(qū)分的細(xì)菌，它們也能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，對(duì)辣椒枯萎病菌具有一定的抑制作用。該部分細(xì)菌主要為黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）[43]、洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）[44]、幾丁質(zhì)降解細(xì)菌（Chitinolytic bacterium）[45]和解磷細(xì)菌（Phosphorite‐dissolving bacterium）[46‐47]等。JBK9 是洋蔥伯克霍爾德氏菌的復(fù)合種，對(duì)辣椒疫霉菌、尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的抑制率分別為59.56%、51.92%和34.22%，產(chǎn)生抗菌化合物Pyrrolnitrin 是該菌的主要抑菌機(jī)制[44]。幾丁質(zhì)降解細(xì)菌主要是利用該類(lèi)細(xì)菌的活性酶、功能基因及其他代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長(zhǎng)。HERDYASTUTI 等[45]從印度尼西亞?wèn)|爪哇的蝦養(yǎng)殖場(chǎng)分離到多株幾丁質(zhì)降解菌，并進(jìn)行了抗真菌活性評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株LA21 對(duì)辣椒枯萎病菌和炭疽病菌的抑菌活性較好，在產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和抗真菌方面具有很大的潛力。解磷細(xì)菌ST03 是一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），該菌能夠產(chǎn)生吲哚乙酸，與根際放線菌sp10聯(lián)合作用可降低辣椒枯萎病的發(fā)病率，促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)[46]。此外，SAOUSSEN 等[47]發(fā)現(xiàn)，解磷細(xì)菌V26 能溶解無(wú)機(jī)磷酸鹽、固氮，產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體和多種水解酶，且對(duì)尖孢鐮刀菌具有較好的抑菌活性。

1.3 放線菌

放線菌是一類(lèi)呈菌絲狀生長(zhǎng)、以孢子進(jìn)行繁殖的原核生物，因其在固體培養(yǎng)基上呈輻射狀生長(zhǎng)而得名，是醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等人類(lèi)生活生產(chǎn)所需抗生素的重要來(lái)源。近年，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)鏈霉素（Streptomycin）、土霉素（Oxytertracyline）、灰黃霉素（Griseofulvin）等醫(yī)用抗生素可用來(lái)防治植物病害[48]，但很少被用于辣椒枯萎病的防治。農(nóng)用抗生素在辣椒枯萎病上的防治大多處于研發(fā)階段，具有廣闊的發(fā)展空間。菌株A217 是一株鏈霉菌（Streptomycessp.），該菌對(duì)尖孢鐮刀菌、辣椒疫霉菌、葡萄孢灰霉菌、核盤(pán)菌、丁香假單胞菌和野油菜黃單胞菌等多種植物病原真菌和細(xì)菌有較強(qiáng)的拮抗活性[49]。 LIOTTI 等[50]研究了灰色鏈霉菌（S.griseocarneus）R132 對(duì)辣椒的促生作用和對(duì)辣椒根部病原菌的防治效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其對(duì)辣椒尖孢鐮刀枯萎病菌的抑制率為46.70%，且其對(duì)辣椒植株生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，可使其莖干質(zhì)量增加42.00%；其提取物亦能有效控制辣椒炭疽病，使病斑面積減少30.00%。可見(jiàn)，菌株R132 可以作為辣椒采前、采后病原菌生物防治和促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)發(fā)育的功能菌。錢(qián)瑤等[51]從玉米根際土壤中分離到一株鏈霉菌IMS002，其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)疏螺旋體素（Borrelidin）對(duì)尖孢鐮刀菌具有良好的抑菌效果，這是首次有關(guān)疏螺旋體素對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑菌效果的報(bào)道，其抑菌的活性組分中是否還含有其他化合物仍需做進(jìn)一步研究。

2 辣椒枯萎病生物防治的植物來(lái)源

植物提取物或植物精油對(duì)大量的植物病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性[52]。植物中富含各種次生代謝產(chǎn)物，如單寧、萜類(lèi)、生物堿和類(lèi)黃酮苷等，研究表明，使用植物提取物防治植物病害具有廣泛的應(yīng)用前景[53]。在植物提取物防治辣椒枯萎病方面，近年也有許多成功的案例。SHAFIQUE 等[54]分析了一種桉樹(shù)的種子、樹(shù)皮和樹(shù)葉提取物對(duì)辣椒尖孢鐮刀枯萎病菌的抑菌活性，結(jié)果表明，桉樹(shù)葉提取物對(duì)辣椒枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率最強(qiáng)，達(dá)98.00%，而種子和樹(shù)皮提取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率僅為50.00%～60.00%。SINGH 等[55]研究發(fā)現(xiàn)，12 種植物提取物對(duì)辣椒枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有一定的抑制作用，其中，在質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)，印楝油和大蒜油完全抑制菌絲的生長(zhǎng)，其余依次為芥末（69.26%）、曼陀羅（46.67%）、南非醉茄（34.44%）、菊花（30.37%）、杜鵑（28.15%）、九重葛（26.30%）、小蒼蘭（24.44%）、銀膠菊（20.37%）、大麻（18.52%）和桉樹(shù)（16.30%）的葉片提取物；在質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，大蒜油對(duì)辣椒枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率仍為100%，而印楝油僅為59.63%。SUPRAPTA 等[56]研究了巴厘島14 種熱帶植物提取物對(duì)辣椒枯萎病菌的抑制作用，其對(duì)辣椒枯萎病菌菌株LS05、LS04、BS01和BS07均有明顯的抑制作用，最低抑制質(zhì)量濃度為2～13 mg/mL，其中，雨豆樹(shù)（Albizia saman）提取物表現(xiàn)出最低的抑制質(zhì)量濃度，為2 mg/mL，此時(shí)，對(duì)菌株LS05、LS04、BS01和BS07的抑制率分別為100%、95.83%、87.50%和95.83%。此外，印度苦楝樹(shù)提取物聯(lián)合哈茨木霉能顯著降低枯萎病菌的種群密度和辣椒枯萎病的嚴(yán)重程度，促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)，提高其產(chǎn)量[57]。

3 辣椒枯萎病的生物防治機(jī)制

隨著越來(lái)越多抗菌活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)和利用，辣椒枯萎病的生物防治機(jī)制研究也取得了很大的進(jìn)步。目前研究較多的作用機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面。

（1）改善土壤理化性質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)狀況，調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物健康水平，增強(qiáng)寄主植物的抗病能力。JAMA 等[58]研究了解淀粉芽孢桿菌菌株Y1 對(duì)土壤理化性質(zhì)、辣椒幼苗生長(zhǎng)、根際細(xì)菌區(qū)系和土壤酶活性的影響，結(jié)果顯示，Y1溶解無(wú)機(jī)磷酸鹽，產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，釋放鐵載體；施用Y1 可以提高辣椒葉片的葉綠素含量，同時(shí)顯著提高土壤全氮含量和可培養(yǎng)細(xì)菌、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌數(shù)量以及幾丁質(zhì)酶、脫氫酶的活性，從而促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)，提高抗病性和總產(chǎn)量。MAO 等[59]報(bào)道，鉤狀木霉（T. hamatum）MHT1134 在辣椒連作地塊施用1 a 和2 a 對(duì)辣椒枯萎病的防治效果分別為63.03%和70.21%，施用MHT1134 后，土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷和有效鉀的含量升高，土壤脲酶、脫氫酶、酸性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶和酸性蛋白酶的活性明顯增強(qiáng)，土壤中鐮刀菌和赤霉菌的相對(duì)豐度逐漸下降，木霉菌、毛殼菌和放線菌的相對(duì)豐度顯著增加?？梢?jiàn)，MHT1134能夠有效改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性狀，提高土壤酶活性。MA等[60]發(fā)現(xiàn)，連作土壤中加入沙雷氏菌能夠提高土壤細(xì)菌的種群密度和土壤酶活性，降低土壤中尖孢鐮刀菌和茄科青枯病菌的種群密度，促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，從而增強(qiáng)辣椒抗枯萎病、青枯病的能力。

（2）利用拮抗微生物的寄生、抗生作用及其與病原菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)抑制和消滅病原菌。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔡燕飛團(tuán)隊(duì)從廣州躍進(jìn)農(nóng)場(chǎng)馬鈴薯根際土壤中分離出高拮抗活性的芽孢桿菌菌株2 株（Bacillus velezensisY6 和F7），室內(nèi)生物測(cè)定和盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，Y6 和F7 對(duì)辣椒枯萎病菌和茄科青枯病菌均有較好的抑菌活性，經(jīng)提純鑒定，從中分離出3 種脂肽類(lèi)活性物質(zhì)：表面活性素、伊枯草菌素和泛革素；進(jìn)一步活性測(cè)定試驗(yàn)表明，伊枯草菌素對(duì)辣椒枯萎病菌有持續(xù)的抑菌活性[61]。郭珺等[62]等報(bào)道，芽孢桿菌pb-4 顯著抑制辣椒枯萎病菌孢子的萌發(fā)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)有致畸作用；活性跟蹤試驗(yàn)表明，從pb-4發(fā)酵液中提取的蛋白質(zhì)、酶、抗生素對(duì)辣椒枯萎病菌有很強(qiáng)的抑菌活性。LIANG等[63]等報(bào)道；放線菌酮（Cycloheximide）、5-乙酸環(huán)己基酰亞胺（5‐acetoxycycloheximide）對(duì)尖孢鐮刀菌、辣椒疫霉病菌、炭疽病菌、灰霉病菌等具有一定的抑制作用，并首次從金黃葡萄球菌中分離出上述2種活性物質(zhì)。DANIEL 等[64]評(píng)價(jià)了棘孢木霉（T.asperellum）代謝提取物對(duì)辣椒枯萎病的防治效果，結(jié)果表明，其代謝產(chǎn)物具有降低辣椒枯萎病菌生殖能力的作用，能夠減少孢子的產(chǎn)生，抑制分生孢子的萌發(fā)，對(duì)減少病原菌的二次侵染具有重要意義。此外，木霉菌[65]、叢枝菌根[66]等真菌以及枯草芽胞桿菌[67]、洋蔥伯克霍爾德氏菌[68]、熒光假單孢桿菌[69]等細(xì)菌的抑菌機(jī)制也與寄生、抗生以及營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)。

（3）誘導(dǎo)寄主植物對(duì)病原菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。WELLER 等[69]報(bào)道，4 種熒光假單孢桿菌Pf-5、Q2-87、Q8r1-96 和HT5-1 均能誘導(dǎo)擬南芥對(duì)番茄丁香假單胞桿菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，并誘導(dǎo)其合成抗生素2，4-二乙?；g苯三酚，該物質(zhì)對(duì)于多種作物的根莖腐病、枯萎病和猝倒病等土傳病害具有較強(qiáng)的防治效果。西班牙科學(xué)家HAFSAH 等[70]發(fā)現(xiàn)，辣椒根際細(xì)菌不但對(duì)辣椒尖孢鐮刀枯萎病菌具有直接的抗生作用，還能觸發(fā)辣椒產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。PHI 等[71]研究顯示，從辣椒根際土壤中分離出的多黏類(lèi)芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)辣椒對(duì)枯萎病和茄科青枯病產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。芽孢桿菌BSp.3/aM 分離自番茄根際土壤，能夠降低辣椒枯萎病和辣椒炭疽病等真菌病害的發(fā)生率，并能促進(jìn)辣椒健康生長(zhǎng)；在溫室條件下，能夠提高宿主PAL、PPO、氧化物酶（POX）和脂氧合酶（LOX）等防御酶活性和酚類(lèi)物質(zhì)的積累，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性[72]。

4 存在問(wèn)題與展望

4.1 辣椒枯萎病生物防治存在的問(wèn)題

辣椒枯萎病是一種頑固性土傳病害，病原菌為尖孢鐮刀菌，其以菌絲體和厚垣孢子在土壤和病殘?bào)w中越冬，成為來(lái)年的侵染源。由于土傳病害的隱蔽性，以及生防菌、微生物源次生代謝產(chǎn)物或植物提取物大田防效不穩(wěn)定且持久性較差等弱點(diǎn)，嚴(yán)重制約了辣椒枯萎病的生物防治效果和生物防治手段以及相關(guān)生防產(chǎn)品在辣椒枯萎病防治上的推廣應(yīng)用。近20 a 來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)辣椒枯萎病的生物防治做了大量研究，也取得了較大的進(jìn)展，但仍然存在許多問(wèn)題，具體表現(xiàn)如下：（1）自然環(huán)境中，生防微生物資源雖然豐富，但用于辣椒枯萎病防治的制劑或產(chǎn)品數(shù)量有限，無(wú)法滿足生產(chǎn)實(shí)際的需求。（2）自然環(huán)境中蘊(yùn)藏著大量微生物資源，但多數(shù)是不可純培養(yǎng)的，利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)手段挖掘辣椒枯萎病生防資源，往往會(huì)錯(cuò)失不可純培養(yǎng)生防微生物資源。（3）生防菌能否在特定的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中定殖，土著菌是否對(duì)外來(lái)生防菌的入侵產(chǎn)生較大的影響尚缺少研究，生防菌及其產(chǎn)品作用機(jī)制尚不明朗，導(dǎo)致室內(nèi)抑菌效果和田間防效差異較大。此外，土壤狀況、氣候條件等也會(huì)影響田間枯萎病的發(fā)生率和生防產(chǎn)品的防效。（4）田間長(zhǎng)期使用化肥和化學(xué)農(nóng)藥，在辣椒枯萎病菌生長(zhǎng)得到有效抑制的同時(shí)，使生防菌的繁殖和種群密度也受到較大程度影響。（5）生產(chǎn)實(shí)踐中，化學(xué)農(nóng)藥見(jiàn)效快，而生防制劑見(jiàn)效慢，短期內(nèi)不易被生產(chǎn)者接受。

4.2 辣椒枯萎病生物防治展望

面對(duì)上述問(wèn)題，在辣椒枯萎病生物防治研究和應(yīng)用過(guò)程中，今后應(yīng)從以下幾方面入手。

（1）擴(kuò)大篩選范圍，從紅樹(shù)林、海水、火山口、溫泉、堆肥、江河湖水、動(dòng)植物內(nèi)生或體表等環(huán)境樣品中篩選抗性更廣、效果更高、穩(wěn)定性更好、耐鹽耐旱、抗逆性強(qiáng)、在辣椒根際和土壤定殖能力強(qiáng)的生防菌株。在挖掘新的生防菌株的同時(shí)，將多種作用機(jī)制的生防菌株或生物菌肥結(jié)合起來(lái)，協(xié)同防病促生或誘導(dǎo)辣椒抗枯萎病能力。

（2）隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白組學(xué)和宏代謝組學(xué)技術(shù)先后被應(yīng)用到微生物資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。可通過(guò)克隆不可純培養(yǎng)微生物的功能基因并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中，構(gòu)建篩選辣椒枯萎病生防微生物工程菌；也可通過(guò)宏代謝組學(xué)途徑，分析代謝物的結(jié)構(gòu)、成分及其抗辣椒枯萎病的功能特性等，進(jìn)而人工合成代謝化合物及其組分，研制出防治辣椒枯萎病新型生物農(nóng)藥。

（3）針對(duì)化肥、農(nóng)藥影響生防菌繁殖的問(wèn)題，應(yīng)先施用對(duì)生防菌影響較小的農(nóng)藥或有機(jī)肥對(duì)辣椒枯萎病菌的種群密度進(jìn)行控制，后持續(xù)施用生防菌2次以上，為生防菌在田間穩(wěn)定定殖、大量繁殖和持續(xù)發(fā)揮防病潛力提供時(shí)間和空間保障。另外，研發(fā)生防菌的優(yōu)良載體或生存基質(zhì)，減少化肥、農(nóng)藥與生防菌的直接接觸，降低化肥、農(nóng)藥對(duì)生防菌繁殖和種群密度擴(kuò)大的潛在風(fēng)險(xiǎn)，提高生防菌在土壤環(huán)境中的生存競(jìng)爭(zhēng)和定殖能力。

（4）針對(duì)生防菌及其產(chǎn)品不易被生產(chǎn)者接受的問(wèn)題，一方面，應(yīng)結(jié)合多種措施、多種手段，提高其對(duì)辣椒枯萎病的防治效果。篩選最佳劑型（如納米銀）、施用時(shí)間、施用濃度和施用次數(shù)，以確保生防效果。同時(shí)，可以將多種作用機(jī)制不同的生防制劑或生防菌進(jìn)行混合施用，以達(dá)到協(xié)同防病促生，提高防效的目的。另一方面，從環(huán)境友好和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，通過(guò)宣傳、培訓(xùn)和示范推廣，提高生產(chǎn)者對(duì)生物農(nóng)藥和生防菌經(jīng)濟(jì)、安全、無(wú)殘留和持續(xù)防病等優(yōu)良特性的認(rèn)識(shí)。

此外，如何充分利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和育種技術(shù)將生防菌中抗辣椒枯萎病功能基因轉(zhuǎn)入辣椒植株并進(jìn)行有效的安全性評(píng)價(jià)，進(jìn)而提高辣椒的抗枯萎病能力，將是值得深入探討的內(nèi)容。