慈蓮膠囊對增生乳腺組織凋亡通路的影響

劉彥恒 代志堅 張萌 李峰 夏瑤賓

【關(guān)鍵詞】乳腺增生;慈蓮膠囊;凋亡通路;修復(fù)

中醫(yī)學(xué)將乳腺增生病多稱為“乳癖”，多因情志不暢，肝氣郁結(jié)，氣滯不舒，氣血周流失度，氣滯血疲挾痰，導(dǎo)致乳絡(luò)經(jīng)脈阻塞不通，結(jié)聚乳中為腫塊則引起乳房疼等癥候[1]。內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，觀察臨床發(fā)病率發(fā)現(xiàn)氣滯痰凝型居多，故在原經(jīng)驗方“慈蓮?fù)琛钡幕A(chǔ)上加味調(diào)整，擬定并制備了中藥慈蓮膠囊，其以氣滯血疲痰凝為本，治療上重在疏肝行氣、化痰祛疲、散結(jié)止痛，同時佐以補腎調(diào)攝沖任，方中柴胡、青皮、丹參疏肝行氣、活血化疲為君，山慈菇、半枝蓮化痰軟堅散結(jié)為臣，鹿角霜補肝腎、調(diào)攝沖任，諸藥合用共奏行氣活血、化痰散結(jié)。經(jīng)臨床驗證，該基本方具有疏肝行氣、活血祛疲、化痰散結(jié)之功效[1]。臨床及藥理試驗研究提示其參與性腺軸、激雌激素信號通路及免疫失衡調(diào)節(jié)[2] ，HE染色乳腺組織形態(tài)表明，與模型組比較其對過度增生有明顯的抑制作用，推測其可能參與增生細胞凋亡環(huán)節(jié)，促進其凋亡，抑制組織過度增生并修復(fù)乳腺組織結(jié)構(gòu)。為闡明其療效機制，本文通過建立大鼠乳腺增生模型，來觀察慈蓮膠囊對凋亡途徑的影響。

細胞程序性死亡可分為外源性與內(nèi)源性，外源性細胞凋亡，可由Fas和TNF受體等死亡受體介導(dǎo)，如Fas的配基（Fast）與Fas結(jié)合后，能夠激活凋亡因子caspase-8，次第激活caspase-3，終致細胞程序性死亡。內(nèi)源性細胞凋亡，線粒體膜的通透性受外界刺激而改變，即而釋放出的細胞色素c招募其他凋亡因子形成凋亡體，從而激活caspase-9，次第激活caspase-3，終致細胞凋亡[3]。

fas廣泛分布于活化T.B細胞及單核細胞表面，廣泛表達于正常組織及腫瘤細胞上。fasl即fas配體是腫瘤壞死因子家族的細胞表面分子，僅表達于活化T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞以及免疫豁免部位及其他上皮。caspa家族是細胞啟動凋亡程序的關(guān)鍵，屬于半耽氨酸蛋白酶（caspa、家族）的caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。Fasl、fas和caspase3參與細胞程序性死亡。fas是靶細胞膜上的重要的死亡受體，免疫細胞上fasl與fas結(jié)合，活化并向靶細胞傳導(dǎo)死亡信號[3]，在靶膜內(nèi)部caspase3接受到從fas傳到的死亡信號，開始執(zhí)行外源性細胞凋亡程序。而乳腺組織周圍有著豐富的淋巴網(wǎng)和毛細血管網(wǎng)，T淋巴細胞可以通過淋巴網(wǎng)和毛細血管網(wǎng)到達乳腺組織附近觸發(fā)內(nèi)外源性凋亡機制使增生的乳腺細胞發(fā)生凋亡反應(yīng)，而起到保護和修復(fù)作用。

1 材料

藥品慈蓮膠囊（內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供，批號180307，內(nèi)藥制字Z16010006）;獸用苯甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠生產(chǎn)，批號20180420）;黃體酮注射液（寧波第二激素廠生產(chǎn)，批號180225）;夏枯草膠囊（規(guī)格32 克/瓶，有效期36 個月，聚協(xié)昌北京藥業(yè)有限公司，20180101 生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字210207747）;他莫昔芬片（四川迪菲特藥業(yè)有限公司，批號1706020）。動物SPF級雌性wistar未孕大鼠，9 周齡，購于內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)院，合格證號SCXK（內(nèi)）2018-0090。

2 研究方法

2.1 造模

雌性大鼠肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1，1 次/d，連續(xù)25 d，其后用黃體酮肌注4 mg·kg-1，1 次/d，連續(xù)5 d。造模后光鏡下觀察大鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)，根據(jù)乳腺增生大鼠模型病理診斷標(biāo)準(zhǔn) ，造模成功依據(jù)為乳腺小葉增生和導(dǎo)管擴張。

2.2 分組及給藥

造模成功后，將大鼠隨機分為7 組，即西藥對照三苯氧胺組、中藥對照夏枯草組、慈蓮膠囊高，中、低劑量組，正常組、模型組。慈蓮膠囊的臨床應(yīng)用劑量按成人60 kg 人每日4 g，相當(dāng)于生藥0.95 g，大鼠每日給藥量分別為低（A組）0.063，中（B組）0.316，高（C組）0.632 g·kg-1·d-1;夏枯草組（E組）0.023 g·kg-1·d-1;三苯氧胺組（D組）0.018 g·kg-1·d-1。正常組（G組）、模型組（F組）（以等量水灌胃）：各組每日灌胃1 次，連續(xù)28 d。大鼠末次給藥后禁食不禁水12 h， 腹腔內(nèi)注射20% 烏拉坦麻醉大鼠。

2.3 乳腺標(biāo)本取材與觀察指標(biāo)

楔形取下大鼠第2對雙側(cè)乳房，用免疫組化技術(shù)檢測各組大鼠乳腺組織中 凋亡蛋白（Fas）和凋亡蛋白配體（Fasl）、抗凋亡基因（survivin）與促凋亡基因（caspase-8）的表達。

2.4 免疫組化法

取材、固定，將固定后的組織用水沖洗，去除殘留的液及雜質(zhì)。不同濃度的乙醇每級2 h，50%、70%、85%、95%、無水乙醇逐級脫水。純乙醇和二甲苯的等體積混合液中置入組織塊2 h，浸入純二甲苯2 h×2次;置恒溫箱中，先將組織塊浸入熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液，浸漬1～2 h，再先后2 次浸漬于熔化的石蠟液約3 h×2次。包埋后切片，約為4～7 μm。烤片、脫蠟、水化，置于0.01 M 檸檬酸鈉緩沖溶液中，高壓修復(fù)15 min，室溫冷卻后，以0.02 M PBS 洗3 min×3 次。消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，將玻片置于3% H2O2中，于濕盒孵育10 min，以0.02 M PBS 沖洗3 min×3次。一抗孵育：滴加一抗，濕盒孵育，室溫下放置1 h。0.02 M PBS沖洗3 min×3次。加入HRP，標(biāo)記廣譜二抗，濕盒孵育，室溫下放置20 min～30 min。以0.02 M PBS沖洗3 min×3次。DAB染色后，以蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察控制染色程度。水沖洗10 min，放入65℃烘箱中烘干。將玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性樹膠封片，置65℃烘箱中15 min烘干。在顯微鏡下觀察樣本并采集，計算陽性面積。

3 結(jié)果

凋亡因子在乳房組織的表達（見表1，圖1～圖6）。Fas陽性分布值A(chǔ)組明顯高于F、G、E組，與D組相似;FasL陽性分布值A(chǔ)組明顯低于F、E，與G、D組相似;caspase-8陽性分布值A(chǔ)組明顯高于F組、E組、G組、D組;survivin陽性分布值A(chǔ)組明顯低于F組、E組，G組于、D組相似。

4 討論

本研究提示慈蓮膠囊治療乳腺增生癥與激活免疫細胞與增生乳腺細胞之間的fas、fasL和caspase-8介導(dǎo)信號通路有關(guān)，在此干預(yù)的過程中上調(diào)fas、caspase-8的表達，并下調(diào)了Fasl蛋白的表達，使其表達量接近或低于正常的乳腺組織，具有活性的caspase-8可引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細胞凋亡、可激活線粒體途徑凋亡通路和參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。survivin獨特性表現(xiàn)為在有絲分裂時呈細胞周期依賴性表達，通過抑制caspase-3 和caspase-7來抑制多種凋亡觸發(fā)因子誘導(dǎo)的細胞凋亡，以確保細胞周期G2/M期正常分裂促進細胞周期進展[5]。在XIAP BIR域存在的情況下，survivin與所有胱天蛋白酶caspase-3，caspase-7和caspase-9強烈相互作用[6]。慈蓮方下調(diào)了Survivin的表達，進而促進了細胞凋亡發(fā)生。提示慈蓮膠囊通過參與多個凋亡通路環(huán)節(jié)抑制了乳腺增生的發(fā)展，促進了過度增生細胞凋亡的過程，發(fā)揮抗增生和修復(fù)作用。