健骨膠囊對成骨樣細胞MC3T3-E1增殖及分化作用機制

賈玉巖 周振薇 王旭凱 楊宇安 劉茜 幺寶金* 冷向陽*

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130117

2.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117

3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，吉林 長春 130021

4.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院繼續(xù)教育學(xué)院，吉林 長春 130117

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種慢性骨病，其特征是骨骼的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致骨質(zhì)減少和脆弱骨折的風(fēng)險增加[1]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率隨著年齡的增長而逐漸增加，人口老齡化現(xiàn)象將導(dǎo)致世界人口骨質(zhì)疏松癥的比例增加[2]。

祖國醫(yī)學(xué)將骨質(zhì)疏松癥歸屬為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，根據(jù)中醫(yī)“腎主骨生髓”理論，總結(jié)得出本病病因病機主要由于腎精虧虛[3]。大量研究表明，中醫(yī)藥在防治骨質(zhì)疏松癥中有其獨特的優(yōu)勢和療效，有效地改善骨密度及臨床癥狀[4]。

國醫(yī)大師劉柏齡教授擅長治療脊柱疾病、關(guān)節(jié)炎等骨科常見病癥[5]。20世紀50年代初，劉柏齡教授依據(jù)“腎為先天之本”，創(chuàng)立“治腎亦治骨”的學(xué)術(shù)思想，這是近現(xiàn)代最早記載的“腎主骨”相關(guān)文獻[6]。基于這一學(xué)術(shù)思想，創(chuàng)立補腎健骨治則，研發(fā)院內(nèi)制劑“健骨膠囊”，在長期的臨床實踐和治療中，具有很好的療效且安全性高。

本研究以MC3T3-E1細胞為對象，觀察健骨膠囊提取物對成骨細胞的增殖、遷移和分化的影響，從分子生物學(xué)水平上探討健骨膠囊防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞：MC3T3-E1細胞株(美國ATCC)。

1.1.2實驗藥物：健骨膠囊組成：熟地黃67.5 g(河北萬修藥業(yè)有限公司，批號：210101CP102)；淫羊藿67.5 g(河北萬修藥業(yè)有限公司，批號：200801CP614)；骨碎補45 g(河北仁心藥業(yè)有限公司，批號：23620010)；肉蓯蓉45 g(安國市譽林藥業(yè)有限公司，批號：191201)；鹿角霜45 g(河北萬修藥業(yè)有限公司，批號：201201CP497)；牡蠣67.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：200801CP614)；龜甲45 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201201)；黃芪45 g(河北仁心藥業(yè)有限公司，批號：28121032)；當(dāng)歸31.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201206)；鹿銜草31.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：200801)；雞血藤31.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201401)；杜仲31.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201202)；陳皮22.5 g(安國市安興中藥飲片有限公司，批號：201302)；三七22.5 g(酒泉市塔豐中藥村生態(tài)種植加工有限公司，批號：201201)；萊服子22.5 g(河北仁心藥業(yè)有限公司，批號：24920013)。

1.1.3試劑：NEST細胞培養(yǎng)板；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國 HyClone公司，批號：AG29642090)；胎牛血清(以色列Biological Idustries公司，批號：2053264)；胰蛋白酶(美國MRC公司，批號：T210118)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國Med Chem EW xpress公司，批號：98259)；茜素紅染料(Alizarin red)(北京索萊寶科技有限公司，批號：919G0033)；CCK8試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：BA03175388)；熒光定量PCR試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，批號：AKE1146A]。

1.1.4儀器：Heto Power Dry LL3000型冷凍干燥機(美國LABCONCO 公司，型號：CORPORATION KANSAS CITY，MISSOURI 64132)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；熒光定量PCR儀(美國 Bio-Rad公司，型號：CFX ConnectTM Optics Modulie)；大屏幕數(shù)碼倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Infnite 200 PRO型酶標儀(瑞士TECAN公司，型號：INFINITE 200 PRO)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；高速離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1健骨膠囊提取物的制備：本實驗所使用的健骨膠囊方由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院國醫(yī)大師劉柏齡提供，組方共含有15種中藥，包括熟地黃、淫羊藿、骨碎補、肉蓯蓉、鹿角霜、牡蠣、黃芪、龜甲、當(dāng)歸、鹿銜草、雞血藤、杜仲、陳皮、三七、萊服子。健骨膠囊提取物制備方法如下：(1)上述藥物按固定計量混合后浸泡2 h；(2)浸泡后的藥物置于砂鍋中100 ℃沸水中煎煮30 min后，用紗布過濾收集藥液，重復(fù)上述操作2次；(3)將3次濾得的藥液使用冷藏離心機離心。收集上清液通過中空纖維膜濾柱過濾進一步澄清，并在-80 ℃儲存過夜，隔日使用冷凍干燥機凍干。

1.2.2細胞培養(yǎng)：MC3T3-E1細胞每3 d傳代1次，培養(yǎng)基組成(DMEM培養(yǎng)基加入胎牛血清10 %及青霉素-鏈霉素溶液1 %)，取對數(shù)生長期細胞用于本實驗。

1.2.3CCK-8細胞增殖實驗：將消化重懸后的細胞接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為3 000個，共設(shè)置7個不同濃度的含健骨膠囊提取物溶液分別為0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，分別向每孔加入10 μL CCK8工作液，培養(yǎng)箱中37 ℃條件下孵育1 h，檢測450 nm波長處的吸收值。

1.2.4細胞劃痕實驗：進行細胞劃痕損傷實驗，以評估細胞遷移能力。將消化重懸后的細胞接種于6孔板，每孔細胞數(shù)密度為1×105/mL，用培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞融合度為100 %，后用槍頭刮擦，PBS清洗后，細胞分別用1.6 mg/mL的DMEM及健骨膠囊溶液處理，對細胞初始劃痕狀態(tài)要拍照留存，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8、16和24 h后，鏡下觀察，并記錄拍照，以觀察細胞的遷移情況。

1.2.5茜素紅染色及定量：將MC3T3-E1細胞接種24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔20 000個細胞。實驗組細胞用基于細胞增殖測定結(jié)果的最佳濃度的健骨膠囊提取物處理，對照組用普通培養(yǎng)基處理，并在含有5 % CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育7 d，隔天換液。7 d后取出所有培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次。加入95%乙醇在室溫下進行細胞固定15 min。用ddH2O洗滌3次后，將固定細胞在室溫下置于搖床上，用1 %茜素紅S染色液染色0.5 h，用ddH2O洗搖5 min，洗搖操作重復(fù)4次。染色后用體式顯微鏡及大屏幕數(shù)碼倒置顯微鏡4倍和10倍鏡下拍攝。通過在室溫下用10 %乙酸溶解染色的細胞0.5 h并輕輕搖動進行定量分析，隨后渦旋30 s、加入200 μL液體石蠟，85 ℃水浴10 min，12 000 rcf離心5 min，取下清液用10 %氨水中和pH至4.1，使用酶標儀在405 nm的光密度下進行定量分析。

1.2.6QRT-PCR檢測成骨相關(guān)mRNA的表達在藥物干預(yù)的第24小時進行Real-time PCR檢測：6孔細胞培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)密度為5×105cells/mL，實驗組和對照組加藥培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次后每孔加入Buffer RZ 1 mL，裂解5 min后吹洗，并將轉(zhuǎn)移入1.5 mL離心管中，按照TIANGEN總RNA提取試劑盒操作方法提取RNA，測濃度定量。將制備好的健骨膠囊組和空白組的MC3T3-E1細胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄步驟得到cDNA；使用SYBR熒光染料進行qRT-PCR實驗，具體實驗反應(yīng)體系配置見表1。按預(yù)設(shè)程序，將反應(yīng)液放置于熒光定量PCR儀中反應(yīng)。階段1(1次循環(huán))：95 ℃ 3 min；階段2(40次循環(huán))：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s。數(shù)據(jù)處理：擴增完畢后，得到目的基因及內(nèi)參基因表達的CT值，采用2-ΔΔCT法進行相對定量分析[7]。Gapdh、Runx2，Col1a1、Ocn、Opn、Bcl2、Alp，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

表1 qRT-PCR實驗反應(yīng)體系Table 1 qRT-PCR experimental reaction system

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)：6孔細胞培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)密度為5×105cells/mL，實驗組和對照組加藥培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次后每孔加入蛋白裂解液，裂解30 min后吹洗。收集蛋白后上樣于10 % SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜，隔日更換二抗，室溫孵育2 h，顯色、分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 健骨膠囊提取物對MC3T3-E1細胞增殖的影響

本研究以空白培養(yǎng)基為實驗對照，實驗組加入不同濃度的健骨膠囊提取物溶液干預(yù)MC3T3-E1細胞，結(jié)果表明(圖1)，與對照組比健骨膠囊提取物能明顯促進MC3T3-E1細胞的增殖(**P<0.01)，且在濃度為1.6 mg/mL時，細胞增殖效果最好，后續(xù)實驗也采取該濃度進行。

2.2 對MC3T3-E1遷移的影響

檢測健骨膠囊方含藥血清對MC3T3-E1細胞遷移能力的影響，進行細胞平板劃痕實驗，并在劃痕后0、8、16、24 h進行拍照、分析。如圖3所示，在第8小時加藥組與空白組無明顯差異，在第16小時可以明顯發(fā)現(xiàn)加藥組具有更好的向空白區(qū)域遷移的能力；在第24小時可以發(fā)現(xiàn)加藥組已經(jīng)完全將空白區(qū)覆蓋，然而空白組仍存在部分區(qū)域空白區(qū)。因此可以發(fā)現(xiàn)在健骨膠囊含藥血清的干預(yù)下MC3T3-E1遷移能力明顯增強。見圖2。

2.3 健骨膠囊提取物對MC3T3-E1細胞成骨礦化的影響

藥物干預(yù)7 d后，茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)健骨膠囊提取物組優(yōu)于空白組，茜素紅染色定量顯示實驗組對細胞成骨礦化能力明顯優(yōu)于對照組(**P<0.01)，見圖3。

2.4 對MC3T3-E1成骨相關(guān)mRNA表達的影響

MC3T3-E1細胞經(jīng)健骨膠囊膠囊提取物干預(yù)24 h后，與空白組比較，Runx2、Ocn、Col1a1、Alp、Opn的 mRNA表達顯著升高(**P<0.01)，Bcl2的mRNA表達升高(*P<0.05)，與成骨細胞相關(guān)mRNA上調(diào)趨勢相同，且結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

2.5 對MC3T3-E1成骨相關(guān)蛋白表達的影響

MC3T3-E1細胞經(jīng)健骨膠囊提取物干預(yù)24 h后，與空白組比較，Col1、Bcl2的蛋白表達升高。見圖5。

3 討論

目前西醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥主要通過雌激素以及雙膦酸鹽類藥物為主[8]，雖然治療效果明顯，但也會引起一些肝腎及骨骼方面的不良影響。而中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥，在療效顯著的同時具有不良反應(yīng)小、成本低的特點。

健骨膠囊是國醫(yī)大師劉柏齡教授從醫(yī)60余載總結(jié)歸納出的經(jīng)驗方，具有補腎健骨，養(yǎng)血舒筋，通絡(luò)止痛的功效[9-10]。本方君藥熟地黃，甘溫味厚，質(zhì)地柔潤，入腎補腎，滋腎水，益腎陰，為補腎陰之要藥；臣藥為淫羊藿、骨碎補、肉蓯蓉、鹿角霜、龜甲、杜仲均有補腎健骨，填精生髓的功效；佐藥牡蠣、黃芪、當(dāng)歸、三七、雞血藤滋陰潛陽，活血生新，以壯腎髓；使藥為陳皮、萊菔子，調(diào)和諸藥，促進脾胃運化。

基于本研究實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)健骨膠囊能促進成骨細胞MC3T3-E1的增殖及細胞遷移能力，并通過上調(diào)成骨細胞特定基因及蛋白的表達，提高MC3T3-E1細胞的成骨能力。這對中藥治療骨質(zhì)疏松癥的實驗室研究和臨證診療提供良好的理論基礎(chǔ)，由于中藥治療疾病具有多靶點多途徑的特性，對于進一步探究其治療其他骨科疾病的作用效果及分子機制做鋪墊，同時為國醫(yī)大師劉柏齡“腎主骨”理論臨床診療的探尋提供一種思路。

由于臨床上中藥復(fù)方制劑常用給藥途徑為口服給藥，因此本研究采用健骨膠囊提取物凍干粉直接干預(yù)MC3T3-E1細胞的方法存在一定的局限性。由于不同藥物生物利用度差異，凍干粉與藥物服用后的入血成分可能會存在不同，因此在今后的研究中將進一步采用動物實驗對健骨膠囊的分子機制做更加系統(tǒng)和深入的研究。鑒于本課題組在前期研究中，針對中藥復(fù)方及中藥材提取物進行了一系列的體內(nèi)外活性及生物學(xué)機制研究，發(fā)現(xiàn)這些中藥制劑在細胞水平與動物水平上的藥效活性基本一致，因此，本研究基于細胞水平的研究將對后續(xù)更加深入的動物水平研究具有一定的指導(dǎo)作用[11-13]。