褪黑素介導抗炎、抗氧化、抗骨質疏松作用在椎間盤退變修復中的研究進展

竇新雨 馬云龍 劉曉光*

1. 北京大學第三醫(yī)院骨科,北京 100191

2. 骨與關節(jié)精準醫(yī)學工程研究中心,北京 100191

3. 脊柱疾病研究北京市重點實驗室,北京 100191

4. 北京大學第三醫(yī)院疼痛醫(yī)學中心，北京 100191

1 椎間盤退變及炎癥對椎間盤退變的影響

1.1 椎間盤退變簡介

IVD是維系脊柱正常生理活動的重要組織結構，主要包括纖維環(huán)(annulus fibrosus，AF)、髓核(nucleus pulposus，NP)和軟骨終板(cartilage endplate，CEP)等重要結構。組織學上，IVD細胞及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)代謝平衡共同維持著IVD微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，遺傳、衰老、持續(xù)性壓力負荷等因素會破壞這種平衡并誘發(fā)IDD[1]，后者也是引起下腰痛(low back pain，LBP)的重要影響因素。組織學上，IDD特征表現(xiàn)包括固有細胞數(shù)目減少、ECM降解、炎癥因子浸潤、血管與神經(jīng)長入等。根據(jù)退變情況可將IDD分為早期和晚期，早期IDD無明顯臨床癥狀，但IVD內(nèi)蛋白多糖(proteoglycan，PG)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)及II型膠原蛋白等ECM合成基質減少，I型膠原蛋白及IVD降解相關蛋白酶明顯增加，這些分子的變化常與IDD的嚴重程度呈正相關[2]。隨著病程進展與加重，IDD晚期表現(xiàn)為ECM退化嚴重、NP儲水能力丟失及IVD抗應力與拉伸強度降低，隨之引發(fā)AF破裂和NP疝出，并壓迫神經(jīng)產(chǎn)生癥狀。

1.2 IDD的病理生理過程

IVD內(nèi)ECM的過度破壞，尤其是其中II型膠原蛋白、蛋白聚糖的丟失，導致了IDD的發(fā)生發(fā)展，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin，ADAMTS)為參與ECM降解和IDD的主要的蛋白水解酶，在退行性IVD組織和細胞中高表達(如MMP-1、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5、ADAMTS-7等)。

炎癥介質過度產(chǎn)生及炎癥相關信號通路活化是IDD發(fā)生與進展重要特征之一。IDD組織中常可觀察到大量衰老、凋亡的細胞以及多種趨化因子和細胞因子如干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素(interleukin，IL)如IL-1、2、4、6、8、17等過度產(chǎn)生，使得更多的免疫細胞被募集在IVD內(nèi)并增強炎癥反應，進而觸發(fā)組織退化的級聯(lián)反應并逐漸加劇IDD[3]。退化IVD因結構完整性喪失為神經(jīng)支配和血管形成創(chuàng)造了有利條件，而炎癥又是加速神經(jīng)及血管向IVD內(nèi)生長的促進因素，并可引起LBP[4]。

IL-1β和TNF-α被認為是誘發(fā)IDD過程中最重要的炎癥因子。研究[5]表明，IL-1β在IDD中表達顯著增加，并與IDD嚴重程度呈正相關。IL-1β不僅能直接抑制ECM合成，還可刺激其他炎癥介質的釋放和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的合成，導致ECM分解代謝增強。TNF-α可誘導IVD產(chǎn)生多種促炎因子，放大IVD中的炎癥反應，如通過使P物質水平增加，進而誘導IL-1β、IL-6、IL-8的表達，或刺激AF細胞產(chǎn)生IL-17[6]。此外，當機械負荷增加時，IVD中TNF-α表達增加，在動態(tài)負荷下可穿透健康椎間盤，刺激其它促炎因子的產(chǎn)生，加速IVD的退變[7]。核因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)是炎癥反應調節(jié)中的關鍵信號通路，作為Rel蛋白家族的重要成員和一種快速誘導轉錄因子，在IDD炎癥反應中發(fā)揮重要作用。炎癥因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α等)刺激時，NF-κB迅速轉移到細胞核中并調節(jié)靶基因的轉錄激活炎癥級聯(lián)反應。研究[8]發(fā)現(xiàn)，靶向敲除NF-κB可顯著降低脂多糖誘導的NP細胞凋亡和促炎因子IL-1β與TNF-α的表達；此外，去乙?；窼IRT1能夠通過抑制NF-κB通路降低IL-1β誘導的炎癥反應，并減少IVD細胞凋亡和抑制ECM降解[9]。

氧化應激反應是IDD中的另一病生理過程，隨著退變程度的增加，髓核組織中的活性氧(ROS)增加，部分線粒體功能發(fā)生障礙。Bai等[10]研究發(fā)現(xiàn)ROS可通過焦亡相關蛋白NLRP3/ PYCARD途徑誘導NPCs的焦亡，同時促進轉錄因子核因子(transcription factor nuclear factor, erythroid 2 like 2, Nrf2)和NP細胞的自噬來減弱細胞的焦亡，建立負調控。Tang等[11]也證實過度氧化應激可導致自噬上調，自噬可視為由自噬相關蛋白(autophagy-related proteins，ATG)與Keap1-Nrf2-p62反饋環(huán)路激活的抗氧化反應。

而在IDD的過程中，NP細胞內(nèi)Nrf2的表達進行性下降，在自噬缺陷細胞中，氧化應激反應的有害影響增加[11]。越來越多的研究表明，修復受損的自噬流可以緩解氧化應激的損傷，從而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，如Kang等[12]通過使用自噬激活劑姜黃素來恢復自噬通量增強自噬，抑制了過量ROS的產(chǎn)生，修復了線粒體功能障礙，從而減少了NP細胞的凋亡、衰老和ECM的降解。Kang團隊[13]利用一種靶向線粒體的抗氧化劑Mitoquinone (MitoQ)，通過PINK1/ Parkin通路來調節(jié)NP細胞中線粒體動力學、線粒體自噬通量和Nrf2信號，緩解了線粒體功能障礙和氧化應激，抑制了NP細胞的凋亡，改善IDD。此外，該團隊還研究了IDD中的CEP細胞，證明通過上調Parkin和Nrf2可以增強CEP細胞抵御線粒體功能障礙、氧化應激和凋亡的能力，保護退變的IVD[14]。

此外，IVD發(fā)生血管長入也是IDD的特點之一，隨著IDD的進展，IVD內(nèi)血管化程度加重，CEP和AF內(nèi)層的血管長入通常與組織受損或破壞有關[15]。

2 褪黑素簡介

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色氨酸)是色氨酸代謝產(chǎn)生的一類吲哚類激素，具有親脂和親水性，可穿越血腦屏障，其廣泛存在于動植物和微生物中。人類褪黑素主要由松果體產(chǎn)生并分泌入體液(血液為主、唾液等)，其他含線粒體的細胞如胃腸道細胞、生殖細胞、成纖維細胞、星形膠質細胞和免疫細胞等)也可合成。血液中90 %的褪黑素通過肝臟代謝，也可在視網(wǎng)膜、胃腸道、皮膚等的外周器官中快速代謝[16-17]，主要代謝產(chǎn)物為6-羥基褪黑素硫酸鹽(6-hMS)，其經(jīng)尿液排泄，完全清除需1～2 h。生理條件下，褪黑素分泌受光照及晝夜節(jié)律的影響，460～480 nm波長的藍光能夠顯著抑制其分泌，而分泌高峰在凌晨2～4時[18]。此外，褪黑素的分泌還受藥物的影響，非甾體類抗炎藥物(布洛芬、吲哚美辛)、抗抑郁藥物(氟伏沙明)及高劑量苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥等長期使用均可抑制褪黑素分泌。褪黑素功能廣泛，具有顯著抗炎及抗氧化作用，在睡眠與晝夜節(jié)律調節(jié)、神經(jīng)心血管與免疫系統(tǒng)保護、組織缺血再灌注損傷與細胞衰老以及抗腫瘤等生理和病理學方面的作用均有報道[19]。

3 褪黑素的抗炎和抗氧化作用

褪黑素被認為是免疫細胞功能的調節(jié)劑，其抗炎特性及在免疫感受性細胞中調節(jié)細胞因子產(chǎn)生已被廣泛報道，這表明褪黑素可以改善炎癥相關性疾病的臨床病程。褪黑素的抗炎和抗氧化作用對于多種退行性疾病具有潛在治療價值。褪黑素能夠誘導Th2淋巴細胞活化并產(chǎn)生IL-4和IL-10等抗炎因子，后者又可抑制Th1淋巴細胞的促炎功能，糾正炎癥狀態(tài)下Th1/Th2的失衡狀態(tài)從而降低促炎因子水平[20]。褪黑素能夠通過上調SIRT-1表達，結合并抑制NF-kB信號通路，減少炎癥介質的產(chǎn)生，阻止其向細胞核轉移，抑制細胞因子、環(huán)氧化酶、誘導型一氧化氮合酶和粘附分子的合成[21]。褪黑素的自分泌作用能夠使巨噬細胞轉變以抗炎功能為主的M2樣表型。

褪黑素是一種天然有效的抗氧化劑，富含電子的芳香系統(tǒng)及由氧甲基和氮乙?；鶜埢a(chǎn)生的化合物兩親性被認為是其抗氧化功能的分子基礎[22]。褪黑素可通過激活多種抗氧化酶活性(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶)和直接中和活性氧自由基來降低氧化應激，抑制具有過氧化作用的多不飽和脂肪酸并穩(wěn)定生物膜。研究[23]發(fā)現(xiàn)，褪黑素還能刺激其他抗氧化劑合成的能力，褪黑素能夠誘導γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表達，后者是谷胱甘肽合成的限速酶。褪黑素還可以提高線粒體電子傳遞效率，減少自由基的產(chǎn)生；在嚴重氧化應激下，其通過酶降解或自由基相互作用，產(chǎn)生許多具有抗氧化作用的代謝物并觸發(fā)自由基清除級聯(lián)反應，因此，其在小劑量下也非常有效[22]。

4 褪黑素的抗骨質疏松作用

OP是由多種原因導致的骨密度(bone mineral density, BMD)和骨質量下降，骨微結構破壞，造成骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨病。Lou等[24]通過對比絕經(jīng)與IDD的關系，表明絕經(jīng)后女性因體內(nèi)雌激素水平大幅下降，從而導致BMD 迅速下降，同時比同齡男性患有更為嚴重的IDD。徐浩偉等[25]對OP與LDD相關性的研究進展進行總結，指出BMD與LDD的關系尚不明確，研究其相關性時可能受到許多潛在因素的影響，猜想BMD與LDD在特殊人群中存在相互關系，在臨床治療DDD時，不應忽視OP與IDD可能存在的相互作用。褪黑素可以影響骨代謝，對治療OP有一定的效果，已有多項研究表明，褪黑素具有促進成骨細胞分化增殖、抑制破骨細胞產(chǎn)生活化的作用，如褪黑素通過增加骨鈣素( osteocalcin，OCN) 的表達來促進骨生成[26]，通過抑制NF-κB信號通路從而抑制破骨細胞生成[27]。前文提到的IDD中重要的炎癥因子TNF-α通過促進骨質吸收、抑制新骨形成而加速OP進程，因此，褪黑素的抗炎作用也有利于治療OP。有動物實驗[27]表明，用添加褪黑素飲用水喂養(yǎng)雌性小鼠一年后，小鼠血清中的pErk1 /2、pErk5、Runx2和OPG以及RANKL水平增加，提示褪黑素能發(fā)揮骨增強作用。王旭東等[28]總結了褪黑素防治OP的研究現(xiàn)狀，表明褪黑素在細胞及動物實驗層面，具有防治OP的應用潛能。由此可以猜想，褪黑素也可能通過對OP的治療作用來改善IDD。

5 褪黑素對IVD的保護作用

有關褪黑素在IDD中的調節(jié)作用最初由Turgut等[29]于2003年報道，發(fā)現(xiàn)褪黑素在體內(nèi)能夠影響退變IVD軟骨終板的骨生長和血管分布。該團隊后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，對3天齡Hybro Broiler雞行手術切除松果體建立褪黑素缺乏模型，養(yǎng)殖至8周齡評估IVD退變情況，結果顯示IVD在核磁上呈現(xiàn)典型的退變表現(xiàn)，而且組織學上與IVD退變密切相關的羥基脯氨酸(hydroxyproline，HP)含量也出現(xiàn)明顯升高[30]。臨床上發(fā)現(xiàn)[31]，不同年齡段椎間盤突出患者血清中褪黑素水平與IDD密切相關，IDD發(fā)生率呈年齡依賴性增加，而且年齡與褪黑素水平呈負相關、與HP含量呈正相關。該團隊[32]進一步在IDD動物模型中觀察到外源性褪黑素應用能夠引起原本退變間盤相鄰椎體骨小梁寬度減小及多核軟骨細胞中轉化生長因子1表達增高的情況發(fā)生逆轉，且用藥后IVD大體形態(tài)也趨于正常。Li等[33]首次報道人類IVD組織和NP細胞中存在褪黑素膜受體MT1和MT2的表達，從2例腰椎間盤突出患者采集的IVD組織及NP細胞中檢測到MT1和MT2表達的存在；體外觀察發(fā)現(xiàn)，褪黑素治療能夠呈劑量依賴性地增強退變IVD中NP細胞的增殖能力，下調細胞周期蛋白D1、增殖細胞核抗原、MMP-3和MMP-9的表達，上調II型膠原α1鏈和蛋白聚糖水平，且這些作用能被非特異性褪黑素受體拮抗劑Luzindole逆轉；進一步研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素的前述作用是通過與細胞膜受體MT1和MT2結合，降低磷脂酰肌醇3激酶p85調節(jié)亞基、磷脂酰肌醇依賴性激酶1和蘇氨酸激酶(Akt)的磷酸化實現(xiàn)。

既往研究顯示，氧化應激反應、線粒體功能障礙、細胞凋亡與自噬等病生理過程在IDD發(fā)展中具有重要作用。He等[34]報道，氧化應激狀態(tài)下褪黑素能夠在體外增強NP細胞的細胞活力，降低氧化分子活性氧自由基和丙二醛的水平，并增強還原分子還原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶活性，這表明褪黑素可能通過改善IDD中的氧化應激狀態(tài)來恢復內(nèi)環(huán)境平衡，從而發(fā)揮IVD修復作用。筆者前期研究[35]發(fā)現(xiàn)，體外應用褪黑素能夠誘導AF細胞的自噬過程，促進細胞增殖及抑制細胞凋亡；其潛在分子機制是通過抑制miR-106a-5p的表達，降低其與ATG7的3’UTR結合，解除miR-106a-5p對ATG7的抑制，從而增強ATG7的翻譯和轉錄過程。Zhang等[36]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以提高II型膠原蛋白及PG的表達水平，同時下調MMP-3水平來抑制由IL-1β誘導的NP細胞及ECM重塑；對IDD動物模型進行腹腔注射褪黑素后還可觀察到IVD結構完整性得以保護、組織內(nèi)炎癥程度明顯減輕。Shen等[37]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠誘導NP細胞中ECM相關分子表達并抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的管形成和細胞遷移，可能通過抑制IDD發(fā)生過程中的血管長入過程。Zhang等[38]探索了褪黑素對軟骨終板細胞凋亡和鈣化的影響，結果發(fā)現(xiàn)褪黑素以劑量依賴方式降低了細胞凋亡并抑制軟骨終板細胞鈣化，這可能通過上調SIRT1表達和活性，促進細胞自噬有關。Chen等[39]研究也證實褪黑素一方面能夠降低由叔丁基過氧化氫所致NP細胞凋亡的總凋亡率，以劑量依賴性和時間依賴性的激活線粒體自噬及其上游調節(jié)因子Parkin的表達，且該過程能被線粒體自噬抑制劑環(huán)孢素A部分消除，提示褪黑素對退變IVD細胞保護作用為線粒體自噬依賴性；另一方面，褪黑素還可上調細胞外基質中基質合成分子II型膠原、PG和Sox-9的表達，并抑制基質降解分子MMP-13和ADAMTS-5的表達。Tian等[40]進行的病例對照研究表明，IDD患者血漿褪黑素濃度明顯降低，較低的血漿褪黑激素水平與較長的疾病持續(xù)時間、較高的疾病嚴重程度和較高的炎癥細胞因子水平相關，血漿褪黑素可作為IDD的診斷標志物。

6 總結與展望

綜上所述，IDD是IVD的持續(xù)、復雜的退變過程，炎癥因子及相關信號通路在該過程中發(fā)揮了重要作用，骨質疏松也可能加速此過程。褪黑素具有明確的抗炎及抗氧化作用，可改善炎癥病程，清除自由基、降低氧化應激反應，應用于多種疾病的治療。多項研究表明褪黑素對IVD具有保護作用，對抗骨質疏松也有一定作用。筆者認為，褪黑素在椎間盤退變修復領域的研究空間仍較大，針對褪黑素最佳劑量選擇、安全性驗證及其參與介導的炎癥相關分子機制等方面仍需展開進一步的探索，這可能為IDD的早期藥物干預與修復治療提供新的思路。