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    膽汁混合蒸制前后鉤吻成分差異及急性毒性研究

    2022-07-05 03:37:42陳倪濟(jì)世檀興慧盧淑珍王文義李德森吳水生
    福建中醫(yī)藥 2022年6期
    關(guān)鍵詞:蔓藤水煎液生品

    陳倪濟(jì)世,檀興慧,盧淑珍,王文義,李德森,吳水生

    (福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

    鉤吻[Gelsemium elegans(Gardn.et Champ.)Benth.(GE)],為馬錢科胡蔓藤屬植物,性溫,味辛、苦,有大毒,全草可入藥,具有祛風(fēng)散瘀、消腫止痛、攻毒殺蟲的功效。《神農(nóng)本草經(jīng)》謂之:“主金創(chuàng)乳痓,中惡風(fēng),咳逆上氣,水腫,殺鬼疰蠱毒?!薄秴瞧毡静荨贩Q其:“有毒,殺人。”生物堿既是活性成分,也是毒性成分,主要包括鉤吻素子、鉤吻素甲、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙、鉤吻素己等[1]?,F(xiàn)代藥理、毒理學(xué)研究表明鉤吻具有良好的抗感染、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、散瞳、影響免疫功能等多種藥理功能,更是具有“止痛不成癮”的特點[2-5]。因鉤吻復(fù)雜的毒、效關(guān)系,近年來學(xué)者提出諸多減毒存效方案,主要包括砂炒減毒[6]、配伍玉葉金花減毒[7]、雙向固體發(fā)酵減毒[8]、“方證相關(guān)”減毒[9]。鉤吻減毒物質(zhì)基礎(chǔ)可能與鉤吻生物堿中的鉤吻素己的含量顯著被降低有關(guān)[10]。但目前鉤吻減毒方案尚未能確保鉤吻臨床應(yīng)用安全性和有效性。

    膽汁炮制自古有之,發(fā)展至今可分為膽汁炙炒、膽汁扮曬、膽汁拌潤發(fā)酵、膽汁混合蒸制法、膽汁混合發(fā)酵后蒸制法等,采用膽汁炮制的代表性藥物有天南星、黃連、化風(fēng)丹藥等[11-13]?,F(xiàn)代膽汁炮制機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)膽汁炮制可轉(zhuǎn)變藥性、降低毒性,通過其中膽汁酸與中藥成分尤其是生物堿類成分發(fā)生相互作用,可發(fā)揮減毒增效作用[14]。鉤吻主要物質(zhì)為生物堿類成分,其性溫,膽汁性涼,溫涼互制,課題組前期研究表明動物膽汁對鉤吻生物堿成分及毒性具有重要影響。

    中藥指紋圖譜可從化學(xué)成分角度對不同批次藥材進(jìn)行相似度評價,結(jié)合化學(xué)模式識別,可以較為全面地反映中藥質(zhì)量,被廣泛用于評價不同產(chǎn)地/批次/炮制等多種樣品質(zhì)量及篩選差異標(biāo)志物[15-17],為中醫(yī)藥多成分的復(fù)雜模式研究提供基礎(chǔ)。故本研究通過膽汁對鉤吻進(jìn)行混合蒸制得到鉤吻膽汁混合蒸制品(下稱膽鉤吻),建立HPLC 指紋圖譜結(jié)合多元化統(tǒng)計分析評價鉤吻生品與膽鉤吻HPLC 指紋圖譜差異,篩選二者成分差異,并進(jìn)一步通過小鼠急性毒性實驗觀察鉤吻生品與膽鉤吻的急性毒性死亡率差異,旨在提出鉤吻新的炮制減毒方案,闡明膽汁炮制鉤吻減毒內(nèi)在機(jī)制,為鉤吻臨床安全、合理應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

    1 實驗材料

    1.1 儀器 2695 型高效液相色譜儀、2996 型檢測器均購自美國Waters 公司;GT-2120QTS 型智能超聲波清洗機(jī)(廣東固特超聲股份有限公司);EC21-21T01 型多功能電磁爐(廣東美的生活電器制造有限公司);TDL-40B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);AR223CN 型千分之一電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司];R-1001VN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);ME204E 型萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

    1.2 藥材 鉤吻藥材分別采自福建永泰、福建晉安、福建泉州、福建廈門、福建漳州、廣西河池、廣東肇慶、云南文山,編號為S1~S7、S10,S1 老莖、嫩莖編號為S8、S9,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪教授鑒定為馬錢科胡蔓藤屬植物鉤吻[Gelsemium ele?gans(Gardn.et Champ.)Benth.]的根、莖;豬膽粉(批號:2021030)購自福建省泉州市永春縣東平鎮(zhèn)。

    1.3 試劑 鉤吻素甲對照品(批號:MUST-15071312,純度≥98%)、鉤吻素子對照品(批號:MUST-15062614,純度≥99%)、鉤吻素己對照品(批號:MUST-14100901,純度≥96%)均購自成都曼思特生物科技有限公司;胡蔓藤堿丙對照品(批號:BBP02553,純度≥97.5%)、胡蔓藤堿乙對照品(批號:BBP02653,純度≥95%)均購自云南西力生物技術(shù)股份有限公司;鉤吻綠堿對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號:P15A10S85857,純度≥95%);常綠鉤吻堿對照品(武漢天植生物技術(shù)有限公司,批號:CFS201902,純度≥98%);水為超純水,甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,其他試劑均為分析純。

    1.4 動物 清潔級6~8 周齡ICR 小鼠,體質(zhì)量18~22 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,許可證號:SCXK(滬)2017-0005,飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物實驗室,許可證號:SCXK(閩)2019-0007,(24±2)℃屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,自由飲食。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 膽鉤吻的制備 取S1~S10 共10 批鉤吻藥材,粉碎,過60 目篩,取粉末適量,參照吳真等報道[18],采用混合蒸制法炮制工藝:加入4 倍量豬膽粉,加水充分潤濕,拌勻,置于蒸鍋中隔水蒸制60 min,于烘箱60 ℃干燥,即得膽鉤吻,編號分別為PS1~PS10。鉤吻生品為棕黃色粉末,豬膽粉為灰黃色粉末,二者混合物為淡棕色。蒸制過程中,膽鉤吻顏色逐漸由淡棕色變?yōu)楹稚?、淺褐色,烘干后顏色為棕褐色;炮制前豬膽粉有明顯腥味,蒸制后腥臭味變淡。鉤吻生品與膽鉤吻炮制前后性狀比較(以S10、PS10 為例),見圖1。

    圖1 鉤吻生品與膽鉤吻性狀比較

    2.2 鉤吻生品與膽鉤吻HPLC 指紋圖譜的建立

    2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Bonus-RP Analytical 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-0.1%甲酸水(B),梯度洗脫,0~25 min,2%~10%A;25~40 min,10%~20%A;40~45 min,20%~32%A;45~55 min,32%~40%A;55~68 min,40%~20%A;68~70 min,20%~2%A;70~75 min,2%~2%A;檢測波長:254 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

    2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱定鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻素甲、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙、常綠鉤吻堿對照品適量,分別置于10 mL 容量瓶,加甲醇定容,超聲輔助溶解,配置成質(zhì)量濃度分別為156.00、142.00、149.00、68.00、100.00、110.00、146.00 μg/mL,于4 ℃條件下保存,備用。

    2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定鉤吻生品(過60 目篩)0.200 g、膽鉤吻各樣品粉末適量(相當(dāng)于鉤吻生品0.200 g),置于具塞錐形瓶中,精密加入配制的含0.1%甲酸的50%甲醇溶液25 mL,密塞,稱重,超聲提取30 min,放冷;再次稱重,用含0.1%甲酸的50%甲醇溶液補(bǔ)足失量,充分搖勻,3 500 r/min離心10 min,0.22 μm 微孔 濾 膜 濾過,取續(xù)濾 液即得。

    2.2.4 方法學(xué)考察 按“2.2.3”項下方法分別制備鉤吻生品與膽鉤吻10 批藥材供試品,進(jìn)行液相檢測,建立鉤吻生品及膽鉤吻藥材HPLC 分析方法,并以S10、PS10 供試品溶液進(jìn)行方法學(xué)考察,以常綠鉤吻堿色譜峰為參照峰,計算主要共有峰的相對保留時間與相對峰面積。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性結(jié)果均表明鉤吻生品、膽鉤吻各成分峰相對保留時間和相對峰面積RSD 值均<5.00%,表明建立的方法適用于鉤吻生品及膽鉤吻成分分析,鉤吻7 種生物堿成分混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 分析圖見圖2。

    圖2 鉤吻7 種生物堿成分混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 分析圖

    2.3 鉤吻生品與膽鉤吻共有峰的標(biāo)定 按“2.2.3”項下方法分別制備10 個批次鉤吻生品與膽鉤吻供試品,進(jìn)行HPLC 分析,得到10 個批次鉤吻生品與膽鉤吻樣品HPLC 色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012 版)”進(jìn)行色譜峰匹配,樣品S10 和PS10 圖譜分別作為參照圖譜,選擇中位數(shù)法生成對照指紋圖譜,采用多點校正法建立指紋圖譜,得到鉤吻生品與膽鉤吻10 個批次藥材HPLC 指紋圖譜,其中R 為對照指紋圖譜,見圖3A、圖3B。鉤吻生品共標(biāo)定15 個共有峰,膽鉤吻共標(biāo)定17 個共有峰;膽鉤吻色譜峰6、7、8、9、10、11、16、17 面積降低(P均<0.05),色峰峰2、13 面積均升高(P均<0.05),色譜峰4、15 差異無統(tǒng)計學(xué)意義。S 樣品中色譜峰峰18、19、20 未被標(biāo)記為膽鉤吻共有峰,可能是因為成分含量較低無法識別。PS 樣品中色譜峰1、3、5、12、14 未能與S 樣品共有,可能是炮制后形成的新成分。通過對照品指認(rèn),6、7、8、9、10、11、16 號色譜峰依次為胡蔓藤堿丙、鉤吻素甲、鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、常綠鉤吻堿。根據(jù)指紋圖譜計算每批樣品指紋圖譜相似度,S1~S10 與其對照指紋圖譜相似度分別為0.931 、0.863 、0.858、0.979、0.787、0.854、0.826、0.975、0.744、0.894,PS1~PS10 與其對照指紋圖譜相似度分 別 為0.999、0.999、0.999、0.998、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、0.999,表明不同批次鉤吻質(zhì)量存在一定差異,膽鉤吻質(zhì)量一致性較好。

    圖3 10 批鉤吻生品與膽鉤吻HPLC 指紋圖譜

    2.4 鉤吻生品與膽鉤吻指紋圖譜多元化統(tǒng)計分析

    2.4.1 層次聚類分析(hierarchical clustering analysis,HCA) 將S1~S10 批次鉤吻生品與PS1~PS10批次膽鉤吻共有峰的峰面積數(shù)據(jù)輸入悟空平臺(https://www.omicsolution.org/wkomics/main),進(jìn) 行HCA 分析,數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,結(jié)果見圖4。由圖4可見鉤吻生品與膽鉤吻可明顯聚為2類,其組成差異通過熱圖直觀體現(xiàn),鉤吻生品中色譜峰6、7、8、9、10、11、16、17 峰面積明顯高于膽鉤吻,而色譜峰2、4、13、15峰面積在膽鉤吻中峰面積相對較高。

    圖4 鉤吻生品與膽鉤吻樣品聚類圖

    2.4.2 主成分分析(principal component analysis,PCA) 將10 個批次鉤吻生品與膽鉤吻中共有峰的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析,從12 個共有峰中提取出2 個貢獻(xiàn)率最大的主成分,對原始數(shù)據(jù)差異的貢獻(xiàn)率為68.9%,以此2 個主成分對樣品進(jìn)行分析,鉤吻生品與膽鉤吻明顯分為2 類,PCA 得分見圖5。

    圖5 鉤吻生品與膽鉤吻PCA 得分圖

    2.4.3 基于正交信號校正的偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA) 對鉤吻生品與膽鉤吻指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析。建立OPLS-DA模型,該模型解釋和預(yù)測能力較好(模型參數(shù):R2X=0.924,R2Y=0.991,Q2=0.928),見圖6A、圖6B。通過圖6A OPLS-DA得分圖發(fā)現(xiàn):鉤吻生品與膽鉤吻明顯分布在2 個象限,表明其化學(xué)成分具有顯著差異。進(jìn)一步以差異變量(variable influence on projection,VIP)>1 作為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選出鉤吻生品與膽鉤吻主要差異色譜峰,見圖6B。圖6B 顯示:色譜峰2、8(鉤吻素子)、9(鉤吻素己)、11(胡蔓藤堿乙)為其主要指標(biāo)性差異成分,其中色譜峰8(鉤吻素子)、峰9(鉤吻素己)、色譜峰11(胡蔓藤堿乙)峰面積高于膽鉤吻,色譜峰2 峰面積低于膽鉤吻。

    圖6 鉤吻生品與膽鉤吻OPLS-DA 及VIP 得分圖

    2.5 鉤吻生品與膽鉤吻毒性比較

    2.5.1 藥物制備 取鉤吻生品(S10)、蒸制鉤吻(不加膽汁混合蒸制)、蒸制豬膽粉(不加鉤吻混合蒸制)及與鉤吻生品等質(zhì)量膽鉤吻(PS10)粉末,加10 倍水浸泡30 min,煎煮60 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至濃度為0.2 g/mL,分別為鉤吻水煎液、蒸制鉤吻水煎液、蒸制豬膽粉水煎液、膽鉤吻水煎液,臨用前稀釋成要求的濃度。

    2.5.2 鉤吻生品與膽鉤吻急性毒性實驗

    2.5.2.1 鉤吻完全致死量篩選 取清潔級ICR 小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量為18~22 g,隨機(jī)分組。每組4只,給藥前禁食12~6 h,自由飲水后按照10 mL/kg體質(zhì)量分別灌服0.010 0、0.012 5、0.020 0、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 g/mL 鉤吻水煎液(對應(yīng)劑量分別為:0.100 0、0.125 0、0.200 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 g/kg),觀察小鼠死亡率,結(jié)果見圖7。圖7 顯示:當(dāng)鉤吻水煎液劑量≥0.200 0 g/kg 時,小鼠死亡率為100%,存活時間多在0.4 h 內(nèi),確定S10鉤吻水煎液的完全致死量為0.200 0 g/kg。

    圖7 鉤吻生品不同劑量生存曲線

    2.5.2.2 急性毒性實驗 取清潔級ICR 小鼠80 只,雌雄各半,體質(zhì)量為18~22 g,隨機(jī)分為空白對照組、鉤吻水煎液組、蒸制鉤吻水煎液組、蒸制豬膽粉水煎液組、膽鉤吻水煎液組,每組8 只,雌雄各半,給藥前禁食12~16 h,自由飲水。按0.01 mL/g 體質(zhì)量灌胃,觀察14 d 內(nèi)小鼠死亡情況,見表1。在同等劑量下,鉤吻水煎液組小鼠約在10~30 min 出現(xiàn)中毒癥狀繼而呼吸衰竭而亡,死亡率100%,膽鉤吻水煎液組14 d 內(nèi)死亡率為0%。膽鉤吻水煎液組劑量提高到4.00 g/kg(按鉤吻生藥量計)時,14 d 內(nèi)死亡率仍為0%,與鉤吻水煎液組比較,安全范圍約提高20 倍。

    表1 鉤吻與膽鉤吻急性毒性比較

    3 討 論

    鉤吻具有抗腫瘤、抗感染等功效,但毒性亦備受爭議。前期研究指出高溫炮制過程鉤吻吲哚生物堿發(fā)生氧化降解或轉(zhuǎn)化,促使生物堿含量降低而達(dá)到減毒效果[16]。故本研究通過以豬膽汁對鉤吻進(jìn)行炮制,對比鉤吻生品,可明顯發(fā)現(xiàn)膽鉤吻外觀性狀發(fā)生顯著變化,其顏色由黃棕色變?yōu)楹诤稚?,略帶腥味,?yīng)是加入膽汁炮制產(chǎn)生系列化學(xué)變化所致。

    通過對10 批鉤吻生品及膽鉤吻的指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn):膽汁炮制前后,鉤吻生品及膽鉤吻保留有大部分共有峰,但亦有部分峰消失,或是新的峰出現(xiàn),指紋圖譜可實現(xiàn)二者區(qū)分;膽汁炮制后識別的7 種鉤吻生物堿成分峰面積均大幅度降低,包括毒性最強(qiáng)的鉤吻素己,同時伴隨新的峰生成。這可能與膽汁中某種/類物質(zhì)與鉤吻生物堿相互作用發(fā)生物理、化學(xué)變化,促使二者發(fā)生結(jié)合/轉(zhuǎn)化,進(jìn)而降低生物堿含量。結(jié)合HCA、PCA、OPLS-DA 等多元統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)鉤吻素子、鉤吻素己、胡蔓藤堿乙3個成分可作為膽鉤吻炮制的差異標(biāo)志物。故本研究建立的指紋圖譜的對照圖譜可作為后續(xù)鉤吻生品與膽鉤吻樣品區(qū)分及質(zhì)量一致性評價的參照。且通過指紋圖譜與多元化統(tǒng)計分析相結(jié)合的方法,篩選得到的鉤吻生品與膽鉤吻差異性標(biāo)志物可為膽鉤吻的炮制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

    膽鉤吻急性毒性研究發(fā)現(xiàn)鉤吻水煎液毒性強(qiáng)烈,劑量在0.20 g/kg 時,受試小鼠全部死亡;而膽鉤吻水煎液組以鉤吻水煎液完全致死量(0.20 g/kg)及完全致死量的20 倍(4.00 g/kg)灌服時,均未見受試小鼠死亡。膽鉤吻水煎液組小鼠中毒后沒有出現(xiàn)明顯的痙攣、驚厥、跳躍等中毒表現(xiàn),僅表現(xiàn)出安靜、瞇眼等反應(yīng),這一現(xiàn)象或與鉤吻鎮(zhèn)靜催眠作用有關(guān),提示膽汁混合蒸制能顯著降低鉤吻毒性,且可能保留有鉤吻良好的藥效。但本研究尚未深入進(jìn)行探討,后續(xù)將進(jìn)一步展開研究。

    本研究結(jié)果表明鉤吻生品與膽鉤吻指紋圖譜差異顯著,毒性生物堿成分含量降低,其毒性大大降低。本研究中膽汁用量為鉤吻4 倍,受限于研究技術(shù),并未對膽汁成分進(jìn)行深入研究,這亦是目前膽汁炮制類中藥研究不足之處。但根據(jù)本研究所建立HPLC 方法對膽汁提取物進(jìn)行分析,色譜峰信息較少,對鉤吻成分不產(chǎn)生干擾。此外,本研究亦尚未對膽鉤吻其他方面的毒性及藥效進(jìn)行研究,后續(xù)將進(jìn)一步深入研究。本研究重點突出鉤吻生品與膽鉤吻指紋圖譜變化及毒性的變化,初步揭示膽汁混合蒸制使鉤吻成分發(fā)生變化/轉(zhuǎn)化是膽鉤吻減毒的作用機(jī)制,為探索鉤吻減毒存效策略提供新的方向,促進(jìn)鉤吻臨床安全應(yīng)用,也進(jìn)一步豐富中藥膽汁炮制理論內(nèi)容。

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