宏基因組二代測(cè)序與傳統(tǒng)病原檢測(cè)在中性粒細(xì)胞減少伴發(fā)熱白血病患兒中的對(duì)比研究

康 磊 郭 芳 白新鳳 徐梅先

河北省兒童醫(yī)院1.重癥監(jiān)護(hù)科，2.感染科（河北石家莊 050031）

白血病是兒童最常見(jiàn)的惡性疾病，占所有兒童期惡性病的29.0%[1]，且在兒童中的患病率仍呈逐年上升趨勢(shì)[2]。中性粒細(xì)胞減少伴發(fā)熱（febrile neutropenic，F(xiàn)N）不僅是白血病患兒最常見(jiàn)的合癥，還是其發(fā)生膿毒性休克和死亡的主要原因[3]。FN兒童常因傳統(tǒng)病原檢測(cè)（traditional pathogen detection，TPD）不能識(shí)別病原體而給予經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療[4]，而經(jīng)驗(yàn)用藥容易導(dǎo)致抗生素濫用、誘發(fā)病原耐藥，并增加抗微生物相關(guān)不良事件發(fā)生率。有研究表明，不適當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)性治療與死亡率增加有關(guān)[5]。因此，對(duì)于白血病化療后骨髓抑制期的FN 兒童，早期識(shí)別病原并給予針對(duì)性抗感染，是降低其死亡風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵所在。

TPD 如培養(yǎng)法等，耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低，而核酸擴(kuò)增需使用特定的引物，不能很好地滿足臨床需求。相比之下，宏基因組二代測(cè)序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）耗時(shí)短、靈敏度高，對(duì)TPD 難以檢出的病原菌微生物及多種病原混合感染更有優(yōu)勢(shì)[6-7]。最新的共識(shí)推薦將mNGS 用于嚴(yán)重感染性疾病，尤其是免疫受損的患者[8]。已有研究表明mNGS 在原發(fā)性免疫缺陷患者的病原診斷，尤其是條件致病菌和混合感染方面，具有明顯優(yōu)勢(shì)[9]。但是，尚無(wú)mNGS 在白血病合并FN 患兒中的應(yīng)用。本研究通過(guò)分析白血病兒童合并FN 的病原檢測(cè)結(jié)果，對(duì)mNGS與TPD的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行對(duì)比研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018年1 月1 日至2021年7 月1 日河北省兒童醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房收治的白血病化療后合并FN 患兒資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18 歲；②經(jīng)骨髓穿刺等確診白血病，已接受化學(xué)治療；③符合FN 標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)2次體溫＞38.0 ℃且持續(xù)超過(guò)1 h，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＜500/mm3[10]；④初始抗感染治療失敗而轉(zhuǎn)入PICU。排除標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性免疫缺陷；②除血流感染及肺部感染外其他部位感染者。

本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)（No.2018013）。

所有研究對(duì)象在病原未明時(shí)按照指南建議[11]的方案進(jìn)行抗感染治療。白血病分為急性淋巴細(xì)胞性白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）組和急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）組。不同感染灶的常見(jiàn)致病原不盡相同，因此根據(jù)感染灶分成兩組，A組（血流感染）和B組（肺部感染）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 包括性別，年齡，并發(fā)癥包括膿毒癥性休克、肺出血、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），存活情況，序貫器官衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）評(píng)分，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果包括中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（ANC）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT），mNGS延遲天數(shù)。

1.2.2 mNGS 送檢標(biāo)本均符合華大基因要求，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000 平臺(tái)，對(duì)樣本中微生物核酸序列進(jìn)行分析，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有微生物的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。檢測(cè)過(guò)程包括：核酸提取、RNA 逆轉(zhuǎn)錄、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序、信息分析、報(bào)告解讀。

1.2.3 TPD ①培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)：血液細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，出現(xiàn)呼吸道癥狀的患兒同時(shí)留取肺泡灌洗液行細(xì)菌及真菌培養(yǎng)，并進(jìn)行涂片、抗酸染色、墨汁染色；②血清學(xué)：肺炎支原體、衣原體、腺病毒、流感病毒血清抗體檢測(cè)，流感病毒、腺病毒、博卡病毒、偏肺病毒和冠狀病毒免疫熒光檢測(cè)，G 試驗(yàn)、GM 試驗(yàn)；③聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：采用多重PCR 擴(kuò)增技術(shù)對(duì)肺泡灌洗液行肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 mNGS陽(yáng)性病原結(jié)果判定 mNGS結(jié)果陽(yáng)性，并符合下述條件之一，則認(rèn)為是致病原。①mNGS 病原體結(jié)果與至少一種TPD 鑒定的結(jié)果一致，是導(dǎo)致FN 的原因。②mNGS 檢驗(yàn)與TPD 結(jié)果不一致，根據(jù)臨床，放射學(xué)或?qū)嶒?yàn)室的發(fā)現(xiàn)，mNGS 病原體結(jié)果是FN 常見(jiàn)致病原之一。③mNGS 檢驗(yàn)結(jié)果與TPD 不一致，且不是常見(jiàn)的病原，基于病史、體格檢查、非微生物檢測(cè)（臨床經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)告等），mNGS結(jié)果與發(fā)生的嚴(yán)重感染表現(xiàn)相符，而且沒(méi)有其他微生物感染的證據(jù)。④診斷性治療有效，對(duì)mNGS檢測(cè)的病原結(jié)果，采取針對(duì)性治療有效，病情恢復(fù)后復(fù)測(cè)mNGS轉(zhuǎn)陰。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)范圍（P25～P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確法檢驗(yàn)。mNGS與傳統(tǒng)病原檢測(cè)結(jié)果的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)（McNemar 檢驗(yàn)），兩種診斷結(jié)果的一致性采用Kappa檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共有56例白血病化療后合并FN 的患兒符合標(biāo)準(zhǔn)納入研究，男27例、女29例，中位年齡4.0（2.0～7.8）歲。A 組39例，ALL 28例、AML 11例。B 組17例，ALL 10例、AML 7例。無(wú)論A 組，還是B 組，ALL和AML 之間年齡、性別、并發(fā)癥發(fā)生率、存活率、SOFA 評(píng)分、ANC、CRP、PCT、mNGS 延遲天數(shù)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。死亡病例11例，6例（54.5%）死于侵襲性肺曲霉菌?。╥nvasive pulmonary aspergillosis，IPA），3例死于細(xì)菌感染引起的膿毒性休克，1例死于肺孢子菌引起的ARDS，1例死于肺出血。

2.2 病原檢測(cè)結(jié)果

綜合mNGS與TPD結(jié)果，A組患兒最常見(jiàn)的真菌為曲霉菌（n=15，38.5%）和念珠菌（n=12，30.8%），最常見(jiàn)的細(xì)菌為鮑曼不動(dòng)桿菌（n=12，30.8%）和肺炎克雷伯菌（n=7，17.9%）。B 組患兒最常見(jiàn)的真菌同樣為曲霉菌（n=7，41.2%）與念珠菌（n=4，23.5%），最常見(jiàn)的細(xì)菌為鮑曼不動(dòng)桿菌（n=5，29.4%），其次為肺炎鏈球菌（n=3，17.6%）和屎腸球菌（n=3，17.6%）。此外A 組罹患ALL 的患兒病毒陽(yáng)性率高，最常見(jiàn)的病毒為EBV。見(jiàn)表2。

2.3 mNGS與TPD診斷陽(yáng)性率的比較

mNGS與TPD檢測(cè)陽(yáng)性率的一致性較差（Kappa=0.039）；經(jīng)McNemar 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mNGS 檢測(cè)陽(yáng)性者（80.4%）明顯高于TPD（58.9%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023）。見(jiàn)表3。

表1 基線資料

表2 A組和B組病原檢測(cè)結(jié)果[n (%)]

兩種檢測(cè)方法對(duì)常見(jiàn)病原的檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表4。A 組mNGS 對(duì)曲霉菌（14/39，35.9%對(duì)5/39，12.8%）、念珠菌（11/39，28.2%對(duì)4/39，10.3%）和鮑曼不動(dòng)桿菌（11/39，28.2%對(duì)3/39，7.7%）的檢測(cè)陽(yáng)性率均高于TPD，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B 組mNGS 對(duì)曲霉菌（8/17，47.1%對(duì)1/17，5.9%）的檢測(cè)陽(yáng)性率均高于TPD，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B 組mNGS 對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌（2/17，11.8%對(duì)4/17，23.5%）的檢測(cè)陽(yáng)性率低于TPD，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩種方法對(duì)上述病原的診斷結(jié)果一致性較差（Kappa＜0.4）。此外，特殊病原如肺孢子菌（n=3，5.4%），毛霉菌（n=3，5.4%）及毛孢子菌（n=1，1.8%）均由mNGS 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TPD結(jié)果為陰性。

表3 mNGS與TPD檢測(cè)結(jié)果比較

表4 常見(jiàn)病原mNGS與TPD檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 mNGS 與TPD 對(duì)多種病原混合感染檢出率比較

45例mNGS 結(jié)果為陽(yáng)性，其中16例檢出一種致病原，29例檢出≥2 種致病原。33例TPD 結(jié)果為陽(yáng)性，其中21例檢出一種致病原，12例檢出≥2 種致病原。mNGS 檢出≥2 種病原混合感染的比例顯著高于TPD，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 兩種方法不同病原檢出種類分布[n (%)]

3 討論

本研究中mNGS 對(duì)于致病性微生物的檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于TPD（80.4%對(duì)58.9%），這與以往的研究結(jié)果一致[12]。但是，McNemar 檢驗(yàn)結(jié)果顯示mNGS 與TPD 檢測(cè)一致性較差，表明兩種方法互為補(bǔ)充，而不能互相替代。

初始抗感染治療失敗的白血病合并FN 患兒最容易繼發(fā)真菌感染，無(wú)論血流感染還是肺部感染，曲霉菌已取代念珠菌成為FN兒童最常見(jiàn)的真菌感染，IPA 也是最常見(jiàn)的引起FN 兒童死亡的原因，這與國(guó)外報(bào)道一致[13]。究其原因：中性粒細(xì)胞作為天然免疫系統(tǒng)的主要吞噬細(xì)胞，可以抑制真菌發(fā)芽或殺死分生孢子[14]；中性粒細(xì)胞表達(dá)C型凝集素受體，產(chǎn)生活性氧并促進(jìn)宿主防御[15]，故FN 患兒對(duì)真菌易感性增加。曲霉菌培養(yǎng)陽(yáng)性率極低，血清學(xué)檢測(cè)（GM試驗(yàn)）僅能提示可能存在曲霉菌感染，且抗真菌藥物的預(yù)防使用亦大大增加了FN 患兒中GM 的假陰性率[16]。而mNGS 針對(duì)的是病原體的核酸序列，受到抗感染藥物影響小，因此，對(duì)曲霉菌的檢出率顯著高于TPD。

細(xì)菌性致病微生物中鮑曼不動(dòng)桿菌最常見(jiàn)，這與國(guó)外的一項(xiàng)針對(duì)兒童的研究[17]不一致，可能與研究對(duì)象不同有關(guān)。本研究的對(duì)象為初始抗感染治療失敗的白血病合并FN 患兒，多處于嚴(yán)重粒細(xì)胞缺乏階段（ANC＜0.1×109/L），而中性粒細(xì)胞是抵御鮑曼不動(dòng)桿菌感染最主要的屏障之一[18]，中性粒細(xì)胞減少會(huì)損害病原體清除和防御屏障的功能，此階段更容易繼發(fā)鮑曼不動(dòng)桿菌感染。本研究中血流感染組mNGS 對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)陽(yáng)性率顯著高于TPD；而肺部感染組mNGS 陽(yáng)性率低于TPD，但差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺部感染組mNGS 對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的檢測(cè)陽(yáng)性率低于TPD，分析原因：①肺部感染組留取了肺泡灌洗液標(biāo)本，對(duì)標(biāo)本培養(yǎng)的同時(shí)還進(jìn)行了多重PCR 檢測(cè)，一定程度上增加了TPD 檢測(cè)陽(yáng)性率；②肺泡灌洗液標(biāo)本的TPD 檢測(cè)時(shí)機(jī)早，抗生素應(yīng)用帶來(lái)的病原菌破壞對(duì)病原檢出率的影響小；③行mNGS 檢測(cè)的時(shí)間為FN 后2 周左右，延遲采集的標(biāo)本中病原菌的核酸序列減少，而mNGS 技術(shù)中對(duì)核酸序列讀取長(zhǎng)度較短，在50bp至300bp之間[19]，且含量低的序列可能不會(huì)被擴(kuò)增，進(jìn)而導(dǎo)致某些信息的丟失，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

本研究通過(guò)mNGS 技術(shù)，在血流感染組檢測(cè)出包括EBV 和CMV 在內(nèi)的病毒感染，均為與細(xì)菌或者真菌的混合感染。接受化療及免疫抑制治療的白血病患兒免疫機(jī)制受到嚴(yán)重破壞，是多種病原混合感染的高危人群[20]。本研究發(fā)現(xiàn)mNGS 對(duì)混合感染的檢出率明顯高于TPD，這與以往的研究結(jié)果一致[21]。雖然對(duì)混合感染的抗感染治療有效緩解了癥狀，但很難區(qū)分具體病原體種類。對(duì)此可能的解釋是，混合感染患兒的免疫特征因人而異，病原體在不同患兒之間的毒性可能不同，因此，臨床醫(yī)師需要準(zhǔn)確把握不同病原體的致病機(jī)制，才能作出恰當(dāng)?shù)呐R床診斷和合理用藥。

與TPD 相比，mNGS 對(duì)罕見(jiàn)病原的診斷效能更為突出。本研究通過(guò)mNGS 檢出3例肺孢子菌、3例毛霉菌和1例毛孢子菌，上述3種病原引起的侵襲性真菌病可引起組織破壞、進(jìn)展迅速、全因死亡率高，臨床確診十分困難。因此，對(duì)白血病FN 患兒早期行mNGS檢測(cè)顯得尤為必要。

本研究存在一定局限性，首先本研究為回顧性，樣本量有限，研究對(duì)象化療藥物使用情況不同，因此需要多中心、大樣本量、前瞻性的研究，以進(jìn)一步證實(shí)相關(guān)結(jié)論。其次，mNGS 對(duì)病原體的診斷目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，mNGS 檢測(cè)結(jié)果必須在臨床背景下進(jìn)行解釋[22]，判定結(jié)果可能帶有一定的主觀性。再者，各種病原檢出的例數(shù)較少，因此，本研究未對(duì)mNGS 檢測(cè)的序列數(shù)進(jìn)行相關(guān)研究，需對(duì)單一病原進(jìn)行大樣本量的研究，以進(jìn)一步探討mNGS 序列數(shù)對(duì)各種病原的臨床意義。最后，mNGS 目前無(wú)法提供藥敏/耐藥譜，限制了其在臨床實(shí)踐中的常規(guī)使用。

總之，對(duì)于初始抗感染治療失敗的白血病合并FN 患兒，最常見(jiàn)的致病原為曲霉菌、念珠菌和鮑曼不動(dòng)桿菌。與TPD 相比，mNGS 對(duì)常見(jiàn)病原檢測(cè)陽(yáng)性率更高，對(duì)混合感染和TPD 難以確診的罕見(jiàn)病原檢測(cè)效能突出。而延遲進(jìn)行mNGS 檢測(cè)可能會(huì)降低其陽(yáng)性率。因此，建議對(duì)白血病化療后FN 的患兒盡早行mNGS 檢測(cè)，作為T(mén)PD 的補(bǔ)充，以期早期明確病原并針對(duì)性抗感染，進(jìn)而改善預(yù)后。