基于臨床及腫瘤生物學(xué)特征的兒童髓母細(xì)胞瘤預(yù)后列線圖構(gòu)建及驗證

張再禹 梁 平

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)外科 國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 兒科學(xué)重慶市重點實驗室（重慶 400014）

髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma，MB）是0～14歲兒童中最常見的惡性顱內(nèi)腫瘤[1]。當(dāng)前MB 治療共識是最大程度地安全切除腫瘤，然后根據(jù)風(fēng)險分層進(jìn)行多模式治療。此外，風(fēng)險分層也實現(xiàn)了臨床試驗中治療強度的可控降級。在半個世紀(jì)的臨床實踐中最常用的分層系統(tǒng)是只包含了臨床特征的Chang分期[2]，然而長期觀察發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)在預(yù)測遠(yuǎn)期預(yù)后方面不令人滿意，因為同組內(nèi)患者的結(jié)局仍具有高度異質(zhì)性。隨著對MB 生物異質(zhì)性認(rèn)識的加深，一種更全面的、包含患兒臨床特征和腫瘤生物學(xué)特性的風(fēng)險分期方法呼之欲出。目前在病理診斷方面，只有組織學(xué)分型得到了廣泛應(yīng)用[3]，仍有許多蛋白標(biāo)志物的預(yù)后預(yù)測潛力未被開發(fā)。雖然目前共識已經(jīng)強調(diào)分子診斷的重要性[4]，但并非所有的患者都完成了昂貴的基因測試。為探討是否可以關(guān)注某些蛋白質(zhì)的表達(dá)，并結(jié)合患者臨床特點構(gòu)建一個新的長期病程預(yù)測模型，本研究收集行手術(shù)切除MB 患兒的臨床資料，利用logistic及COX回歸模型構(gòu)建預(yù)后預(yù)測模型，并以列線圖直觀展示，使用C 指數(shù)、校準(zhǔn)曲線及決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）評價預(yù)測模型的預(yù)測效能，為MB 患兒術(shù)后管理提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2011年1 月1 日至2020年8 月1 日在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院診斷的158例MB 患兒的臨床資料。患兒的臨床和生物學(xué)信息常規(guī)記錄在兒童醫(yī)療大數(shù)據(jù)智能應(yīng)用重慶市高校工程研究中心。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18 歲，男女不限；②在本院完成MB 切除手術(shù)；③手術(shù)前未接受任何放、化療；④截止至2021年8 月31 日，患兒隨訪情況可以明確，術(shù)后情況可通過影像學(xué)結(jié)果確定并有知情同意過程。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重缺失研究相關(guān)資料；②未完成手術(shù)，包括術(shù)前放棄治療、要求自動出院者。

本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：（2021）年倫審（研）第（406）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 包括患兒年齡、性別、磁共振成像（MRI）圖像及報告、病理報告、手術(shù)記錄、住院病程、治療方式、門診病歷及生存情況等資料。

1.2.2 影像學(xué)資料 本院神經(jīng)外科醫(yī)師通過術(shù)前最后一次MRI確定腫瘤最大徑、位置和轉(zhuǎn)移及浸潤，并通過手術(shù)記錄印證。腫瘤位置分為小腦蚓部、四腦室內(nèi)、小腦半球或橋小腦角。轉(zhuǎn)移及浸潤是指小腦和/或大腦的蛛網(wǎng)膜下腔和/或側(cè)腦室或第三腦室肉眼結(jié)節(jié)狀種植，脊髓蛛網(wǎng)膜下腔肉眼結(jié)節(jié)狀種植，顱外轉(zhuǎn)移。

1.2.3 病理資料 本院神經(jīng)病理科醫(yī)師遵循WHO 2007年和2016年指南出具病理報告[5-6]，從病理報告中獲取病理資料。腫瘤組織學(xué)分型包括經(jīng)典型、促結(jié)締組織增生/結(jié)節(jié)型（desmoplastic/nodular，DN）、廣泛結(jié)節(jié)型（MB with extensive nodularity，MBEN）、大細(xì)胞型/間變型（anaplastic/large cell，LC/A）或非定型（not otherwise specified，NOS）。通過在多個高倍視野中觀察有絲分裂活動程度定性評估核分裂像增加；通過免疫組化確定MYC、p 53 和Ki 67 蛋白表達(dá)情況。p 53 蛋白以染色50%為標(biāo)準(zhǔn)分為陽性或陰性[7]。當(dāng)腫瘤標(biāo)本中＞50%的細(xì)胞顯示C-MYC或N-MYC 蛋白在核和/或細(xì)胞質(zhì)表達(dá)時，MYC 記為陽性[8]。

1.2.4 結(jié)局 短期結(jié)局（short-term outcomes，STO）：術(shù)后1 個月內(nèi)的第一次MRI 掃描發(fā)現(xiàn)殘留病灶＞1.5 cm2。長期結(jié)局（long-term outcomes，LTO）：下列任一情況首先發(fā)生，包括腫瘤復(fù)發(fā)、再次手術(shù)和死亡。腫瘤復(fù)發(fā)：術(shù)后1 個月內(nèi)MRI 未發(fā)現(xiàn)殘留，但之后原發(fā)部位或遠(yuǎn)處再次出現(xiàn)腫瘤，或殘留病灶明顯增大。再次手術(shù)：從術(shù)后第2個月開始的長期MRI隨訪中，因為殘余腫瘤存在手術(shù)指征或腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)而考慮手術(shù)。通過門診病歷結(jié)合電話隨訪確定患兒生存情況，并未明確所有患兒死因。無LTO 生存期（LTO-free survival，LOFS）：指從患兒初次術(shù)后開始至第一次出現(xiàn)LTO的時間。

1.2.5 分組 當(dāng)前手術(shù)技術(shù)無法處理微小殘留、轉(zhuǎn)移和浸潤病灶，基于臨床經(jīng)驗及文獻(xiàn)，若術(shù)后殘留病灶＞1.5 cm2或影像學(xué)發(fā)現(xiàn)有浸潤及轉(zhuǎn)移，患兒長期預(yù)后可能不佳[9-10]，所以為反映患兒術(shù)后腫瘤細(xì)胞殘留情況對LTO 的影響，根據(jù)患兒是否發(fā)生STO 或浸潤及轉(zhuǎn)移將其分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用X-tile軟件確定最佳界值（version 3.6.1；Yale University，New Haven，CT，USA）[11]：患兒年齡為3歲，腫瘤直徑為5.0 cm，Ki67指數(shù)為60.0%。采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的以M（P25～P75）表示。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。采用Akaike信息準(zhǔn)則估計模型的擬合度[12]。使用后退法構(gòu)建多因素logistic回歸模型1（model 1，M 1）預(yù)測STO，并采用Hosmer-Lemeshow 檢驗確定其最佳擬合度，采用靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測值和ROC 曲線下面積（AUC）評價模型的預(yù)測效果。使用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗計算LOFS。使用單因素Cox回歸分析剔除P＞0.1的無意義變量，保留可能有意義的變量（0.05＜P＜0.1），并計算風(fēng)險比（hazard ratios，HR），使用向后選擇變量構(gòu)建多因素COX 回歸模型。通過R 語言的rms 包（4.1.0）使其以列線圖的形式展示，并使用C 指數(shù)、校準(zhǔn)曲線評價模型。采用R 語言的ggDCA 包進(jìn)行DCA 進(jìn)而評估其臨床效用[13]。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線特征、病理資料和結(jié)局

根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，158例患兒中111例MB患兒被納入研究，男67例、女44例；中位年齡7.0（4.0～9.0）歲，≤3歲25例。99例患兒在術(shù)后接受了系統(tǒng)化療，其中53例同時接受放射治療；11例因病情進(jìn)展加重?zé)o法進(jìn)行術(shù)后放化療；1例因經(jīng)濟原因放棄術(shù)后后續(xù)治療。中位隨訪時間17.0（10.0～29.0）月。27例腫瘤直徑＞5 cm。腫瘤位置主要位于小腦蚓部及四腦室內(nèi)（占88.3%），其余10.8%的腫瘤位置在小腦半球，僅1例發(fā)現(xiàn)于橋小腦角。35例患兒在診斷時已發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤。20例患兒發(fā)生STO；39例在長期隨訪中出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，有6例再次手術(shù)，13例死亡。見表1。本隊列中3年及5年生存率分別為（88.1±3.4）%及（82.6±6.2）%。

表1 111例MB患兒臨床及腫瘤生物學(xué)特征

2.2 STO及LTO預(yù)測模型

首先使用后退法構(gòu)建多因素logistic回歸模型預(yù)測STO，自變量為年齡、性別、腫瘤直徑、位置、影像學(xué)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類別、核分裂像、Ki 67 指數(shù)、MYC和p 53 陽性。其中腫瘤直徑＞5.0 cm（OR=8.07，95%CI：2.62～24.89，P＜0.001）和MYC 陽性（OR=4.03，95%CI：1.29～12.63，P=0.017）被納入M 1（Hosmer-Lemeshow 檢驗計算得χ2＜0.001，P=1.000），其余自變量則被移出模型。M 1 預(yù)測STO 的特異度為95.6%，靈敏度40.0%，陽性及陰性預(yù)測值分別為66.7%和87.9%，AUC為0.81（95%CI：0.69～0.92，P＜0.001）。其校準(zhǔn)圖見圖1。

圖1 M1 的校準(zhǔn)曲線

50例MB 患兒歸入高風(fēng)險組，12 個月LOFS 為（46.0±7.0）%；低風(fēng)險組61例，12 個月LOFS 為（80.3±5.1）%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=2.77，95%CI：1.53～5.01，P＜0.001）。按臨床和生物學(xué)參數(shù)對LTO 進(jìn)行單因素COX 回歸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險組、年齡≤3 歲和腫瘤直徑＞5.0 cm 與不良LTO明顯相關(guān)（P＜0.05），在蛋白質(zhì)表達(dá)和增殖標(biāo)志物中，MYC 陽性是較差LTO 強有力的獨立預(yù)測因素（P＜0.05），見圖2。

結(jié)合基線參數(shù)及風(fēng)險分組進(jìn)行多因素COX 回歸建模預(yù)測LTO，并以列線圖展示（圖3 A），最終納入年齡（≤3歲對＞3歲）、腫瘤直徑（＞5.0 cm對≤5.0 cm）、MYC蛋白（陽性對陰性）和風(fēng)險分組（高風(fēng)險對低風(fēng)險）。該模型的C 指數(shù)為0.715，預(yù)測12和18個月的LOFS時校正曲線均貼近于理想曲線（對角線），列線圖預(yù)測概率同實測值基本一致（圖3 B、3 C），且由DCA 曲線可知，列線圖模型的預(yù)測概率閾值在較大范圍內(nèi)時其凈收益均較高（圖3D、3E）。

3 討論

圖2 影響LOFS 的單因素COX 回歸分析結(jié)果

圖3 預(yù)測MB 患兒LTO 風(fēng)險的列線圖及預(yù)測不同時間LOFS 的校準(zhǔn)曲線和DCA 曲線

本項單中心、回顧性隊列研究開發(fā)并驗證了一種腫瘤生物學(xué)特征結(jié)合患兒臨床特征的新型預(yù)后預(yù)測工具，因為MB 復(fù)發(fā)的中位時間主要在診斷后兩年內(nèi)[14-15]，所以預(yù)測了12 和18 個月的LOFS，C-指數(shù)及校準(zhǔn)曲線均顯示模型具有不錯的預(yù)測效果，并且列線圖在DCA 中展現(xiàn)出良好的臨床效能。本研究發(fā)現(xiàn)，高和低風(fēng)險組患兒的LOFS 明顯不同，在單因素及多因素COX 回歸中風(fēng)險分組均與LTO 顯著相關(guān)。殘余腫瘤細(xì)胞會增加復(fù)發(fā)、進(jìn)展甚至死亡的概率[9-10]。Chang等[2]的第一個風(fēng)險分級系統(tǒng)就已經(jīng)考慮到轉(zhuǎn)移對患者預(yù)后的影響[2]。20世紀(jì)末Zeltzer等[16]在Chang等[2]的基礎(chǔ)上納入了術(shù)后殘余這一指標(biāo)。在1990年以前，有殘余腫瘤灶和轉(zhuǎn)移的MB 患兒無事件生存率一直低于50.0%[16-18]。當(dāng)前包括大劑量化療、全腦脊髓放療在內(nèi)的術(shù)后規(guī)范綜合治療已經(jīng)改善了這一困境，并且5年生存率也已超過70.0%[19-21]。

針對模型中確定的變量并結(jié)合以往的經(jīng)驗，我們的觀點是：第一，針對病灶殘余，對于手術(shù)實現(xiàn)了全切但腫瘤體積較大和MYC 陽性患兒、接受次全切除手術(shù)患兒、術(shù)中直視下未見殘留但術(shù)后MRI 提示殘留的患兒以及存在手術(shù)無法處理的浸潤和轉(zhuǎn)移的患兒，均需要更積極的治療以延長生存期。歷史上腫瘤直徑被納入了首個MB 分期系統(tǒng)[2]，結(jié)合M1和列線圖我們提出第二個關(guān)于腫瘤直徑的觀點。較大的腫瘤通常難以全切，腫瘤殘留會導(dǎo)致預(yù)后較差，但隨著手術(shù)技術(shù)發(fā)展，腫瘤的位置、構(gòu)造和鄰近結(jié)構(gòu)似乎比大小更有意義，但上述分析和現(xiàn)有的分期系統(tǒng)中沒有系統(tǒng)地考慮這方面，例如手術(shù)對下蚓部、小腦頂核和小腦傳出通路的損傷會導(dǎo)致小腦緘默綜合征和小腦認(rèn)知-情感綜合征[22-24]。第三，根據(jù)以往的觀點，≤3 歲MB 患兒的預(yù)后明顯更差，但年齡作為風(fēng)險分層變量值得商榷。考慮到治療毒性，年幼和年長兒童的治療方法不同，這一差異可能會造成預(yù)后的差異。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不使用全腦脊髓放療而單獨接受大劑量化療的低齡患兒療效很差，他們可能需要額外的治療，如減量放療、腦室內(nèi)/瑪雅囊內(nèi)注藥化療或鞏固治療后的周期性生物治療[21]。隨著對MB 患兒預(yù)后的臨床危險因素更深層次的理解，簡明的生物標(biāo)記物已成為目前及未來的探索重點。自從相關(guān)研究強調(diào)對MYC擴增的MB 患兒應(yīng)考慮強化治療策略[25]以來，許多關(guān)于MYC基因水平的研究都證實其與不良預(yù)后有關(guān)[26]，并發(fā)現(xiàn)MYC在Mad/Max 信號軸的下游發(fā)揮作用，最終調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡活性和細(xì)胞分化[27]，這也解釋了為什么MYC 蛋白表達(dá)可預(yù)測腫瘤殘留和預(yù)后情況。然而，在蛋白質(zhì)水平上，這種相關(guān)性仍未被證實[28-29]。原因可能是在本研究中，當(dāng)＞50%的腫瘤細(xì)胞被染色時該切片即被評為陽性，而不管蛋白是在細(xì)胞核還是在細(xì)胞質(zhì)中定位，這種方法與相關(guān)研究一致，同樣，他們也證實MYC蛋白表達(dá)是預(yù)后不良的標(biāo)志[8]。最后一個觀點遂得出，MYC基因擴增或蛋白高表達(dá)的患兒需要在管理策略上予以重點關(guān)注。

本研究構(gòu)建了列線圖來預(yù)測MB 患兒發(fā)生LTO的風(fēng)險，盡管該模型與既往的危險分層有重合部分，如Chang 的M 分期和年齡，但該列線圖首先將患兒分為能夠反映術(shù)后腫瘤殘留情況的高、低風(fēng)險組，新穎地納入了反映腫瘤在蛋白水平上生物異質(zhì)性的MYC 蛋白表達(dá)情況，并且其臨床效能在所有的內(nèi)部驗證方法中都得到了驗證。此基于臨床-生物學(xué)的列線圖可能為臨床工作中預(yù)測MB 患兒預(yù)后提供了一個簡單而準(zhǔn)確的方法。

本研究有幾個局限性。首先模型的建立基于回顧性、單中心資料，并且由于樣本量不足，也無法對該模型進(jìn)行外部驗證；隨訪的中位數(shù)不足兩年，可能對MB 患兒來說隨訪時間不足；本研究僅將病理報告中含有MYC 蛋白信息的患兒納入隊列，這造成了樣本量減少和選擇偏倚。最后，MYC 在DNA、RNA 及蛋白水平上的差異原因仍是未知的，是否在DNA 及RNA 水平上的異常是由于其他相關(guān)通路表達(dá)上調(diào)的替代標(biāo)記，也許是由相同轉(zhuǎn)錄元件控制的，這一點可能需要由未來基礎(chǔ)研究通過比較MYC DNA、mRNA和蛋白水平差異來澄清。