59種農(nóng)藥表面活性劑對(duì)5種環(huán)境非靶標(biāo)有益生物的急性毒性

袁善奎，張小軍，宋偉華，劉 瓊，陳紅英，葛兆悅，單煒力*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125；2. 中農(nóng)立華生物科技股份有限公司，北京 100052)

農(nóng)藥助劑是指任何被有意地添加到農(nóng)藥產(chǎn)品中的，能夠提高、改善，或者有助于提高、改善該產(chǎn)品的物理、化學(xué)性質(zhì)的化合物或者物質(zhì)[1-2]。幾乎所有的農(nóng)藥原藥都不能直接使用，需要添加各種助劑將其加工成具有實(shí)際使用價(jià)值的農(nóng)藥制劑。雖然農(nóng)藥助劑本身不具備對(duì)靶標(biāo)生物的滅殺毒性，但并不表明其對(duì)人類健康和環(huán)境是安全的。據(jù)世界農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)顯示，每年全球使用農(nóng)藥制劑進(jìn)入環(huán)境中的助劑超過100萬噸，農(nóng)藥助劑的品種多，在農(nóng)藥制劑中的含量可高達(dá)99.99%[3]，我國(guó)每年僅用于配制乳油所使用的甲苯、二甲苯等有機(jī)溶劑約40萬噸，其中二甲苯使用量約為25萬噸[1]。這些助(溶)劑經(jīng)噴施或者雨水沖刷直接進(jìn)入土壤和水體，嚴(yán)重污染農(nóng)田、地表水和地下水，可揮發(fā)性助劑還會(huì)在農(nóng)藥噴施尤其無人機(jī)廣泛應(yīng)用過程中造成空氣中VOCs增加[4]。大部分助劑屬于持久性有機(jī)物污染，如N-甲基-2-吡咯烷酮在花粉中濃度高達(dá)69.3mg/L，可持續(xù)7d[5]，其對(duì)蜜蜂的繁殖和發(fā)育會(huì)產(chǎn)生不利影響。由于助劑在農(nóng)藥制劑中占比較大，食物中的助劑殘留是否通過生物富集直接或間接危害到人體健康近年來也逐漸受到關(guān)注。為了控制農(nóng)藥助劑對(duì)人畜健康和環(huán)境的危害，美國(guó)等國(guó)家都制定了禁限用農(nóng)藥助劑清單，2015年農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所起草并發(fā)布了《農(nóng)藥助劑禁限用名單》(征求意見稿)，包含了乙二醇甲醚、壬基酚等9種禁用助劑和苯、甲醇等75種限用助劑，標(biāo)志著我國(guó)開始關(guān)注農(nóng)藥助劑的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

在農(nóng)藥助劑中，表面活性劑是應(yīng)用最廣、使用量最大的一類。本研究選取了3類表面活性劑：非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑和陰離子型表面活性劑，測(cè)定其對(duì)環(huán)境非靶標(biāo)有益生物蜜蜂、家蠶、大型溞、斑馬魚、綠藻的急性毒性，從而為了解常用農(nóng)藥表面活性劑的毒性，以及環(huán)境友好型農(nóng)藥制劑研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試表面活性劑 59種農(nóng)藥表面活性劑(表1)，均由中農(nóng)立華生物科技股份有限公司提供，其中包括31種非離子表面活性劑、5種陽離子表面活性劑和23種陰離子表面活性劑，試驗(yàn)過程中所有表面活性劑樣品的含量均按100%計(jì)。

表1 供試農(nóng)藥表面活性劑的品種

1.2 供試非靶標(biāo)有益生物 意大利成年工蜂(Apismellifera)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院蜜蜂研究所；家蠶(Bombyxmori)，蠶卵購(gòu)自山東廣通蠶種集團(tuán)有限公司，品種為菁松×皓月；斑馬魚(Brachydaniorerio)，購(gòu)自北京宏大高峰水族用品經(jīng)營(yíng)部；大型溞(DaphniamagnaStraus)和羊角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蜜蜂急性毒性試驗(yàn) 對(duì)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)采用飼喂法[6]，用50%的蔗糖水將供試表面活性劑配制成不同濃度藥液，裝入飼喂器中，管口向下置于試驗(yàn)籠上，將供試蜜蜂引入網(wǎng)籠中攝食；對(duì)蜜蜂接觸毒性試驗(yàn)采用點(diǎn)滴法[6]，將供試表面活性劑點(diǎn)滴在蜜蜂的前胸背板。試驗(yàn)溫度(25±2)°C，相對(duì)濕度50%～70%，黑暗條件培養(yǎng)，分別于24和48h時(shí)觀察、記錄蜜蜂的中毒癥狀及死亡數(shù)。

1.3.2 家蠶急性毒性試驗(yàn) 將家蠶卵在人工氣候箱內(nèi)孵化飼養(yǎng)至2齡起蠶供試，飼養(yǎng)及試驗(yàn)溫度均為(25±1)°C，相對(duì)濕度70%～80%，光周期L∶D=16h∶8h。采用浸葉法[7]，分別于24、48、72和96h時(shí)觀察、記錄家蠶的中毒癥狀及死亡數(shù)。

1.3.3 魚類急性毒性試驗(yàn) 將斑馬魚在室內(nèi)馴養(yǎng)一個(gè)月以上，飼養(yǎng)及試驗(yàn)水溫均為(23±2)°C，光周期L∶D=16h∶8h。試驗(yàn)采用靜態(tài)法[8]，分別于24、48、72和96h時(shí)觀察、記錄斑馬魚的中毒癥狀及死亡數(shù)。

1.3.4 溞類急性毒性 大型溞經(jīng)室內(nèi)飼養(yǎng)一年以上，繁殖超過30代，飼養(yǎng)水溫(20±2)°C，自然光照。采用靜態(tài)法[9]，置于溫度為(20±1)°C、光周期L∶D=16h∶8h的人工氣候箱中，分別于24和48h時(shí)觀察、記錄試驗(yàn)溞中毒癥狀及活動(dòng)受抑制溞數(shù)。

1.3.5 藻類急性毒性試驗(yàn) 采用BG11號(hào)培養(yǎng)基在智能人工氣候箱中人工培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)(22±1)°C、光周期L∶D=16h∶8h下培養(yǎng)增殖，并參照藻類生長(zhǎng)抑制法[10]，分別于0、24、48和72h時(shí)采用用分光光度法測(cè)定各處理液在650nm處的吸光度值，計(jì)算每處理的藻細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算供試表面活性劑對(duì)各生物試材的半數(shù)致死濃度(LC50)、半數(shù)致死劑量(LD50)或半數(shù)抑制濃度(EC50)，以及其95%置信區(qū)間。依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》(GB/T 31270)中的標(biāo)準(zhǔn)，判斷不同表面活性劑對(duì)上述5種非靶標(biāo)有益生物的毒性等級(jí)[6-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 非離子表面活性劑的急性毒性 31種非離子表面活性劑對(duì)5種生物的急性毒性測(cè)定結(jié)果(表2)。從表中可以看出，所有非離子表面活性劑對(duì)蜜蜂和家蠶急性毒性全部為低毒；除脂肪醇聚氧乙烯醚類表面活性劑AEO-9對(duì)綠藻表現(xiàn)出中等毒性外，其他30種非離子表面活性劑對(duì)綠藻均為低毒；CEREWIN T30、CEREWIN T90、Soprophor TS/10、AEO-9、NP-4等5種非離子表面活性劑對(duì)魚和溞都表現(xiàn)出中等毒性，沒有高毒及以上的品種，司盤-20、司盤-80對(duì)大型溞為中等毒性，NP-10對(duì)斑馬魚為中等毒性。盡管有的非離子表面活性劑品種對(duì)部分非靶標(biāo)生物為低毒，但仍表現(xiàn)出一定的毒性水平，如EH-4、EH-9、CEREWIN T30、CEREWIN T90、Emulsogen TS200、AEO-09對(duì)蜜蜂的急性經(jīng)口或接觸48h-LD50均<100μg /bee；Lutensol XL-70、Lutensol XL-100、JFC、AO-08、農(nóng)乳聚甘油油酸酯601、33#、NP-10對(duì)大型溞的48h-EC50均<100mg /L；EH-4、Lutensol XL-70、Lutensol XL-100、JFC、農(nóng)乳聚甘油油酸酯601對(duì)斑馬魚96h-LC50均<100mg /L；CEREWIN T30、司盤-20、司盤-80、JFC、農(nóng)乳聚甘油油酸酯601、33#、NP-4、NP-10對(duì)羊角月牙藻的72h-EyC50或72h-ErC50均<100mg /L?？傮w來說，非離子表面活性劑主要表現(xiàn)為對(duì)水生生物的毒性，其中在供試品種中，CEREWIN T30、CEREWIN T90、Soprophor TS/10、AEO-9、NP-4、NP-10等6種非離子表面活性劑對(duì)水生物毒性相對(duì)較高。

2.2 陽離子表面活性劑的急性毒性 5種陽離子表面活性劑對(duì)蜜蜂和家蠶全部為低毒(表3)。相比于陸生生物，5種陽離子表面活性劑對(duì)水生生物的毒性相對(duì)較高，其中十二烷基二甲基芐基氯化銨1227-80G對(duì)大型溞48h-EC50為0.04mg/L，毒性等級(jí)為劇毒；對(duì)斑馬魚96h-LC50為0.998mg/L，毒性等級(jí)為高毒。十六烷基三甲基氯化銨大型溞48h-EC50為0.440 mg/L，斑馬魚96h-LC50為0.750mg/L，毒性均達(dá)到了高毒等級(jí)。與非離子表面活性劑對(duì)綠藻的普遍較低毒性不同，陽離子表面活性劑中大多數(shù)對(duì)綠藻具有較高毒性，其中1227-80G、1631-30L、4130A、CH7013對(duì)綠藻均表現(xiàn)出了中高毒性，僅有1種為低毒。由此可見陽離子型農(nóng)藥助劑對(duì)水生生物的影響都很大，對(duì)陸生生物影響較小。

2.3 陰離子表面活性劑的急性毒性 23種陰離子表面活性劑對(duì)5種生物的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果(表4)，從表中可以看出所有供試陰離子表面活性劑對(duì)蜜蜂、家蠶和藻類的毒性均為低毒；PICD-EP60P對(duì)大型溞為中等毒性，Phehylsulyohat CAL、Dowfax 2A1、zephrym 3300B、凈洗劑LS、 K12、SK-31sx等對(duì)大型溞和斑馬魚均表現(xiàn)為中等毒性及以上，其中凈洗劑LS對(duì)斑馬魚為高毒。盡管有的大部分陰離子表面活性劑品種對(duì)非靶標(biāo)生物為低毒，但有的仍表現(xiàn)出一定的毒性水平，如PICD-EP60P、Phehylsulyohat CAL、zephrym 3300B、SK-31sx等對(duì)蜜蜂的急性經(jīng)口或接觸48h-LD50均<100μg/bee；Soprophor FD、Rhodapex co-436、Soprophor Flk、Soprophor SC、CEREWIN SVS27、Tamol DN對(duì)大型溞的48h-EC50均<100mg/L；PICD-EP60P、Rhodapex co-436、CEREWIN SVS27、擴(kuò)散劑BX、Morwet D-425對(duì)斑馬魚96h-LC50均<100mg/L；Soprophor FD、Rhodapex co-436、zephrym 3300B、Dispersol PSR-19、K12、SK-31sx對(duì)羊角月牙藻的72h-EyC50或72h-ErC50均<100mg/L?？傮w來說，供試陰離子表面活性劑中，PICD-EP60P、Phehylsulyohat CAL、Dowfax 2A1、zephrym 3300B、凈洗劑LS、 K12、SK-31sx等7個(gè)品種對(duì)大型溞和斑馬魚具有一定毒性，但對(duì)蜜蜂、家蠶和藻類生物毒性較低。

3 結(jié)論與討論

有關(guān)農(nóng)藥助劑對(duì)水生生物的毒性研究較多，本文的研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[11-12]，但對(duì)蜜蜂、家蠶等陸生生物的毒性研究報(bào)道較少。本文測(cè)試了59種常見農(nóng)藥表面活性劑對(duì)2種陸生生物和3種水生生物的急性毒性，總體上看，所有供試表面活性劑對(duì)陸生生物蜜蜂和家蠶，以及大多數(shù)品種對(duì)對(duì)魚類、溞類、藻類等水生生物的毒性較低，共有18種表面活性劑對(duì)一種或多種水生生物表現(xiàn)中等毒性及以上，少數(shù)為劇毒。此外，陽離子表面活性劑對(duì)水生生物的毒性均較高，非離子型和陰離子表面活性劑對(duì)水生生物的毒性相對(duì)較低。在實(shí)際農(nóng)藥制劑研發(fā)中，尤其是開發(fā)水稻田使用藥劑，建議重點(diǎn)關(guān)注助劑對(duì)水生生物的毒性，避免因助劑選擇不合理造成產(chǎn)品對(duì)水生生物的風(fēng)險(xiǎn)不可接受。

本研究主要測(cè)試了表面活性劑對(duì)環(huán)境非靶標(biāo)有益生物的急性毒性，一些低毒的表面活性劑在實(shí)際情況下可能會(huì)對(duì)生物造成不同程度的慢行毒性影響。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，殺蟲劑中有機(jī)硅表面活性劑對(duì)蜜蜂具有較大影響，包括急性毒性和嗅覺障礙等；昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中經(jīng)常使用的N-甲基-2-吡咯烷酮會(huì)對(duì)蜜蜂的繁殖和發(fā)育產(chǎn)生不利影響[4]。在對(duì)家蠶的急性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于助劑覆蓋在葉片表面，造成葉片萎蔫有異味，導(dǎo)致家蠶出現(xiàn)拒食現(xiàn)象。雖然這些助劑對(duì)家蠶無急性致死作用，但是做為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，我們還要充分考慮其在亞致死劑量下對(duì)家蠶的經(jīng)濟(jì)學(xué)指標(biāo)包括結(jié)繭率、全繭重、繭層重、繭層率等的影響[14]。由于農(nóng)藥助劑經(jīng)噴施進(jìn)入環(huán)境，可能會(huì)影響周圍植物的生長(zhǎng)，對(duì)桑蠶經(jīng)濟(jì)是否會(huì)造成損失還有待于進(jìn)一步研究。

對(duì)水生生物的急性毒性結(jié)果顯示，一部分非離子和陰離子等普遍被認(rèn)為對(duì)環(huán)境和人體健康無害的添加劑，對(duì)水生動(dòng)物特別是大型溞具有中毒或高等毒性。其中陽離子型表面活性劑對(duì)水生生物整體毒性較高，部分種類能達(dá)到高毒甚至劇毒級(jí)別。表面活性劑的危害表現(xiàn)除了自身的生物活性外，還表現(xiàn)在其生物降解產(chǎn)物方面。如在農(nóng)藥生產(chǎn)中常用的壬基酚聚氧乙烯醚，在環(huán)境中分解為壬基酚NP，胡雪雷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，NP10EO及其代謝產(chǎn)物NP均可對(duì)多刺裸腹溞的生長(zhǎng)繁殖過程產(chǎn)生毒害效應(yīng)，導(dǎo)致其首次生殖時(shí)間出現(xiàn)延后，母體體長(zhǎng)減小，出生幼體體長(zhǎng)減小，首次生殖幼溞數(shù)量降低。壬基酚化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有雌激素內(nèi)分泌干擾作用，三致效應(yīng)，環(huán)境危害較大。除了急性毒性表現(xiàn)外，表面活性劑在亞致死劑量下對(duì)水生生物的生長(zhǎng)發(fā)育毒性影響也不容忽視。針對(duì)十二烷基硫酸鈉對(duì)斑馬魚的研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚發(fā)育具有明顯的抑制作用，導(dǎo)致個(gè)體生長(zhǎng)緩慢，體長(zhǎng)體重增長(zhǎng)率明顯降低[16]。由于目前人們對(duì)于助劑中各類表面活性劑與生物長(zhǎng)期低濃度共存的慢性影響研究并不透徹，因此不能忽視這些溶劑類助劑的慢性風(fēng)險(xiǎn)。

農(nóng)藥助劑對(duì)環(huán)境的危害性不僅僅體現(xiàn)在對(duì)個(gè)體生物的毒害作用上，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中隨著農(nóng)藥的施用，大量表面活性劑類助劑產(chǎn)品必然會(huì)進(jìn)入水體環(huán)境。當(dāng)表面活性劑在天然水體中積累濃度過高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量持久性的泡沫，在水面形成一層與空氣隔絕層，可能會(huì)導(dǎo)致水體缺氧發(fā)臭，嚴(yán)重危害水生生物的生存。袁平夫等[17]研究發(fā)現(xiàn)水體中殘留的表面活性劑使水體表面張力降至5.0×10-4mN/m以下時(shí)，影響魚鰓呼吸，導(dǎo)致魚類大量死亡，對(duì)整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生災(zāi)難性影響。

鑒于農(nóng)藥助劑對(duì)環(huán)境生物尤其是水生生物的危害，建議建立適合農(nóng)藥助劑的試驗(yàn)方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，逐步建立并完善農(nóng)藥助劑的環(huán)境毒性、發(fā)育毒性、遺傳毒性、不良生殖影響、潛在致癌性、生物積累等一系列數(shù)據(jù)信息，為我國(guó)農(nóng)藥助劑的安全性管理提供科學(xué)有效的理論支持。