基于網(wǎng)絡藥理學的黨參抗胰腺癌機制研究

徐曉青，余亞萍，王炳淑，范永豪，揭 偉，2，鄭少江，2

（1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤研究所，?？?571199；2.海南醫(yī)學院急救與創(chuàng)傷研究教育部重點實驗室，?？?571199）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，預后極差，患者5 年生存率低于9%，大多數(shù)患者在確診后已屬疾病晚期［1］。近年來，PC 發(fā)病率呈逐年上升趨勢。報道顯示，我國2006 年PC 的發(fā)病率達到12.17/10 萬，預計到2030 年死亡率上升為惡性腫瘤的第二位［2］。因此，有關PC 的防治逐漸成為腫瘤研究的重點之一，但目前臨床有關PC 特異性篩查和治療的標志物仍相對缺乏。

近年來發(fā)現(xiàn)包括黨參在內(nèi)的一些中藥對PC 的治療有一定作用。黨參（Codonopsis pilosula）為多年生草本植物，含有皂甙、多糖和甾醇等有成分，具有抗炎［3］、抗?jié)儯?］、調(diào)節(jié)免疫［5，6］和促進骨髓造血等功能［7］，同時，黨參抗癌作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)［8，9］。有報道顯示黨參可能對胃癌［10］、結直腸癌［11，12］、黑色素瘤［13］、骨肉瘤［14］等腫瘤有一定的治療效果。在PC方面，有少量報道顯示黨參可能通過促進細胞凋亡和抑制細胞增殖來抑制PC 的增殖［15］，但確切機制不明。

新近，網(wǎng)絡藥理學在預測藥物治療疾病的藥理機制方面得到較多的關注［16，17］。本研究應用網(wǎng)絡藥理學相關技術與平臺，預測黨參在PC 治療中的有效化合物及潛在的作用靶點及信號通路，為基于黨參治療PC 提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黨參有效化合物及其作用靶點的挖掘與篩選

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Tradition?al Chinese Medicine Systems Pharmacology Data?base and Analysis Platform，TCMSP；http：//lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php）可幫助研究人員實現(xiàn)中藥化合物的網(wǎng)絡藥理學分析和可視化，并確定中藥成分與疾病靶點之間的關系［18］。利用TCMSP 篩選黨參有效化合物（設置口服生物利用度（oral bioavail?ability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18），預測與相應有效化合物對應的靶基因。通過STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）將所有基因名轉化為“GENE SYMBOL”格式，搜索蛋白的互作關系。

1.2 篩選PC 相關疾病基因

GeneCards 是 包 含 有HUGO/GDB（Human Genome Organization/Genome Database）命名委員會認可的人類基因Web 智能檢索系統(tǒng)［19］，該數(shù)據(jù)庫綜合了包括所有已知和預期人類基因的基因組、轉錄組、蛋白質組、遺傳和功能信息［20］。應用Gene?Cards 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.genecards.org/）篩 選PC 相關基因，設定SCORE>1 為標準篩選出PC 的靶基因。

1.3 構建黨參“化合物-交互基因”網(wǎng)絡

通 過Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作黨參有效化合物靶基因和疾病靶基因Venn 圖，并通過Venn 圖尋找交互基因，通過Cytoscape 3.6.0（http：//manual.cyto?scape.org/en/3.6.0/）構建化合物-交互基因的網(wǎng)絡分析圖。Cytoscape 在Java 基礎上，是一個開放源代碼的網(wǎng)絡可視化軟件平臺，用于研究、探索和構建大型生物網(wǎng)絡。它可以描繪任何與網(wǎng)絡結構和層級有關系的內(nèi)容，如基因表達調(diào)控或蛋白質相互作用網(wǎng)絡［21］。

1.4 構建蛋白互作網(wǎng)絡

將交互基因輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫的“Multi?ple proteins”模塊，置信分數(shù)>0.4，檢索目標基因的蛋白互作網(wǎng)絡（protein protein interaction，PPI），用Cytoscape 軟件查看PPI 網(wǎng)絡，用cytoHubba 模塊分析，構建關鍵節(jié)點基因蛋白質相互作用網(wǎng)絡，按De?gree 數(shù)值大小選擇網(wǎng)絡中前10 位的靶基因作為黨參抗癌治療的關鍵節(jié)點基因。根據(jù)Degree 數(shù)值大小，網(wǎng)絡中節(jié)點從低到高，顏色由黃色變?yōu)榧t色。

1.5 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

DAVID（the Database for Annotation，Visualiza?tion and Integrated Discovery，https：//david.ncifcrf.gov/）是一種生物信息學數(shù)據(jù)庫，用于篩選基因和蛋白質集合以獲得生物學相關數(shù)據(jù)［22］。采用DA?VID 數(shù)據(jù)庫富集分析“化合物-交互基因”網(wǎng)絡中的靶基因，包括GO（gene ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。將GO 富集分析和KEGG 通路富集分析p 值從小到大排序，篩選出與PC 相關的前10 個GO 條目和前20個KEGG 通路。

1.6 統(tǒng)計學處理

各組數(shù)據(jù)均由其相應平臺軟件包處理。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黨參有效化合物基本信息

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對黨參有效化合物進行挖掘與篩選，按照設置的OB 和DL 值為標準，共篩選出21 種有效化合物，見表1。

表1 黨參21 種有效化合物信息Tab 1 Information on 21 effective compounds of Codonopsis pilosula

2.2 黨參有效化合物作用靶點與PC 靶基因維恩分析

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫預測黨參有效化合物作用靶基因，并利用STRING 數(shù)據(jù)庫將所有靶基因名轉化為“GENE SYMBOL”格式，共獲得98 個靶基因。通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫篩查PC 相關疾病靶基因，設置SCOR>1 為參數(shù)標準篩選出PC 的靶基因1 278個，進一步通過維恩分析獲得二者交互基因共54個，見圖1。

圖1 黨參有效化合物作用靶點與胰腺癌靶基因維恩分析Fig 1 Venny analysis of targets for Codonopsis pilosula ef?fective compounds and pancreatic cancer target genes

2.3 黨參“化合物-交互基因”網(wǎng)絡圖

通過Cytoscape 構建“化合物-交互基因”的網(wǎng)絡分析圖，在網(wǎng)絡中擁有最多交互基因的有效化合物成分有l(wèi)uteolin、spinasterol、glycitein 等，見圖2。這些與交互基因有相互作用關系的有效化合物可能為黨參發(fā)揮抗癌作用的重要物質基礎。

圖2 黨參“化合物?交互基因”網(wǎng)絡圖Fig 2 Network diagram of“Codonopsis pilosula compound-interactive gene”

2.4 黨參與胰腺癌靶點PPI 網(wǎng)絡

在STRING 數(shù)據(jù)庫的“Multiple proteins”模塊中輸入54 個交互基因，設置置信分數(shù)>0.4，交互基因的蛋白互作檢索后再使用Cytoscape 軟件顯示PPI 網(wǎng)絡，見圖3。

圖3 黨參與胰腺癌靶點之間的相互作用網(wǎng)絡Fig 3 The interaction network of Codonopsis pilosula and pancreatic cancer targets

使用cytoHubba 模塊分析，將結果構建成關鍵節(jié)點基因的PPI 網(wǎng)絡，共篩選出10 個 關鍵節(jié)點基因，分別為CASP3、TP53、MDM2、AKT1、ESR1、BCL2L1、MCL1、HSP90AA1、CASP9和CCND1，通過該網(wǎng)絡展現(xiàn)PPI 網(wǎng)絡中關鍵節(jié)點基因的關系及重要性，見圖4。

圖4 黨參與胰腺癌靶點關鍵蛋白的互作網(wǎng)絡Fig 4 The interaction network of Codonopsis pilosula and the key proteins of pancreatic cancer targets

2.5 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

將54 個交互基因輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫功能注釋工具進行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cel?lular component，CC）和分子功能（molecular func?tion，MF）三部分，結果見表2。GO：0007265～Ras protein signal transduction 是 最 顯 著 的BP，GO：0005654～nucleoplasm 是 最 顯 著 的CC，而GO：0019903～protein phosphatase binding 是最顯著的MF。 KEGG 通路富集結果如表3 所示，其中hsa04660： T cell receptor signaling pathway，hsa04668：TNF signaling pathway 和hsa04115：p53 signaling pathway 是排名靠前的通路，其中hsa05212：Pancreatic cancer 的詳細網(wǎng)絡結構圖如圖5 所示。

圖5 富集的hsa05212：Pancreatic cancer 通路Fig 5 Enriched hsa05212：Pancreatic cancer pathway

表2 GO 富集分析Tab 2 GO enrichment analysis

表3 TOP 20 KEGG 通路富集Tab 3 TOP 20 KEGG signaling pathways

3 討論

PC 是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其臨床診斷和治療都極具挑戰(zhàn)性［23］。晚期PC 的治療以化療為主要手段，近年來使用中醫(yī)藥輔助治療腫瘤得到了較多的關注。由于黨參對人體循環(huán)、免疫、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、運動、生殖等系統(tǒng)均具有一定的藥理作用，其在抗腫瘤方面也顯示了一定的效果。陸續(xù)有少量報道提示黨參具有抗突變，改善機體免疫功能，防止腫瘤形成，提高化療療效的作用［24-26］。但上述有限的報道均未能充分闡明黨參在抗腫瘤方面的復雜網(wǎng)絡調(diào)節(jié)機制。

本研究采用經(jīng)典的網(wǎng)絡藥理學的方法，首先篩選出21 種黨參的有效化合物，其中l(wèi)uteolin、spinas?terol、glycitein 等是最主要的成分，具有較理想的OB 和DL 參數(shù)。Luteolin 中文名為木犀草素，存于植物，如蔬菜、水果和中藥等，屬黃酮類化合物，可對抗人類惡性腫瘤，如結腸癌、肺癌和胰腺癌等。它激活細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞增殖，進而誘導細胞凋亡，在體外和體內(nèi)皆能阻止癌癥發(fā)展［27］；Spinasterol 中文名菠甾醇，是一種植物甾醇，其結構類似于維生素D。它可能存在于多種植物中。它是植物細胞的關鍵成分，也可以轉化為等效的波甾醇苷。從靈芝菌中分離出的菠甾醇以時間和劑量依賴的方式對乳腺癌和卵巢癌細胞系產(chǎn)生有效的抑制作用［28］；Glycitein 中文 名為甘氨酸，是一種異黃酮，通 過與ROS 相關的MAPK/STAT3/NF-κB 信號通路，激活G0/G1細胞周期阻滯并誘導AGS 細胞凋亡，從而達到治療人類胃癌的目的［29］。除外這3種主要成分外，尚有其他18 種黨參有效成分值得進一步關注。

隨 后，利 用STRING 和GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫，本研究篩選出98 個黨參作用靶基因，這提示黨參的多靶點藥理學特征可能有助于其發(fā)揮抗癌作用。同時還篩選出胰腺癌靶基因1 278 個，這提示了胰腺癌發(fā)病的復雜性。隨后通過分析得到54 個交互基因并繪制了Venn 圖和構建化合物-交互基因網(wǎng)絡圖，體現(xiàn)了黨參治療胰腺癌多靶點特性及多個靶點間具有協(xié)同作用。這一網(wǎng)絡中最關鍵的10 個靶點基 因 為ESR1、HSP90AA1、CASP9、CASP3、TP53、MDM2、AKT1、BCL2L1、MCL1和CCND1，為今后黨參治療胰腺癌提供了較為精準的靶點。

ER1 即雌激素受體1，是一種促進細胞存活和增殖的轉錄因子，在大約70%的乳腺癌中表達，可介導乳腺癌的耐藥性［30］。ER1 可能與不同的蛋白激酶相互作用，產(chǎn)生蛋白復合物，并在雌激素信號轉導過程中刺激下游分子如Akt 的激活［31］。ER 在胰腺腫瘤中的潛在作用已爭論多年，但最近有報道認為ER 的表達與胰腺癌的不良預后相關［32，33］。

HSP90AA1 編碼熱休克蛋白90α，通常稱為Hsp90α，它能夠與誘導致癌的蛋白質以及參與細胞外傷口愈合和炎癥反應的蛋白質相互作用。Hsp90α 在細胞中的過度表達與胰腺癌的不良預后有關。相關研究顯示，胰腺癌細胞胞質Hsp90α 的表達水平明顯高于正常胰腺組織，但Hsp90α 在胰腺癌細胞胞核中的表達水平較低，此外，胰腺癌細胞胞質中Hsp90α 的表達與周圍神經(jīng)侵犯顯著相關［34］。

TP53是一種腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)細胞生長、衰老和癌癥的作用，TP53基因檢測時常被有關人士認為是人體“基因組的守護者”。胰腺癌中存在TP53的突變［35］。相關研究確定了TP53/miR-34a 軸的一個關鍵靶點（SERPINE1），該靶點或可作為早期檢測胰腺癌的潛在生物標記物［36］。

MDM2癌基因的擴增與腫瘤轉移密切相關，MDM2癌基因的改變對于理解胰腺癌的病因和轉移機制至關重要。MDM2 的陽性表達率隨著胰腺癌組織中的高、中、低分化程度而逐漸增高，且差異具有顯著性，在胰腺癌組織中MDM2 的表達是顯著高于正常組織的［37］。

AKT1基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），由細胞外信號通路觸發(fā)。當Akt 激活時，它會移動到細胞核、細胞質和細胞的其他部分，使多種底物蛋白磷酸化，Akt 的異常活躍會引起腫瘤的發(fā)生。Akt 通路是人胰腺癌進展的主要調(diào)節(jié)因子，也是一個重要的藥理靶點，在臨床前模型中，Akt 和線粒體代謝的體內(nèi)藥理聯(lián)合抑制并有效地控制了胰腺癌的生長［38］。

Bcl-2基因可抑制細胞凋亡。在多種人類腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Bcl-2 的表達上調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療關系密切［39］。在胰腺癌中，Bcl-2 的上調(diào)表達在Rab14 介導的胰腺癌吉西他濱耐藥中發(fā)揮作用［40］。此外，某些中草藥成分處理PC 細胞后可以靶向Bcl-2 而誘導細胞凋亡，凸顯了Bcl-2 在PC 治療中的靶向價值［41］。

MCL-1為髓細胞白血病細胞分化蛋白-1（my?eloidcell lekemia-1），屬于Bcl-2 凋亡調(diào)控基因家族成員。應用RNAi 特異性靶向沉默人胰腺癌癌株PANC-1 中的Mcl-1基因，結果顯示能顯著誘導PANC-1 細胞凋亡，細胞增殖活力明顯下降，提示靶向Mcl-1 的RNAi 技術在胰腺癌的基因治療上具有潛在價值［42］。

細胞周期蛋白1（CCND1）在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)過表達［43］，它可以作用細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4 和CDK6 調(diào)節(jié)細胞周期從G1期向S 期的轉變，使細胞快速生長，導致腫瘤生長。相關實驗顯示CCND1是胰腺癌細胞miR-584 直接靶基因，此外，CCND1 的抑制作用與miR-584 過表達對胰腺癌細胞的抑制作用相似，CCND1 表達的恢復明顯消除了miR-584 過表達對胰腺癌細胞的抑制作用［44］。

Caspase 全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase），調(diào)控細胞的分化、生長與凋亡過程，并決定凋亡的形態(tài)改變和生物學變化［45］。在外來蛋白信號的作用下，Caspase-9 切割并激活Caspase-3，被激活的Caspase-3 可致細胞程序性死亡。龍輝等［46］發(fā)現(xiàn)，正常胰腺組織中Caspase-3 表達低于胰腺癌組織。杜緣等［47］的實驗提示，正常胰腺組織中Caspase-3 表達明顯高于胰腺癌組織。蒲競等［48］的報道提示，在胰腺癌中Caspase-3 陽性表達率隨腫瘤的分化程度降低而降低。以上提示，Caspase 家族成員在胰腺癌的臨床進展中發(fā)揮了重要作用，但有關成員的確切表達及作用尚有待進一步明確。

本文將54 個共有靶點基因進行GO 注釋和KEGG 富集分析。GO：0007265～Ras protein signal transduction 是最顯著的BP。文獻表明，Ras 突變與胰腺癌關系非常密切［49，50］。GO：0005654～nucleo?plasm 是最顯著的CC，提示黨參相關靶基因主要定位于核質，提示可能與下游信號的轉導有關。GO：0019903～protein phosphatase binding 是最顯著的MF，提示黨參相關性靶基因具有重要的蛋白修飾功能。更讓人興奮的是，KEGG 通路富集結果發(fā)現(xiàn)，黨參相關靶基因涉及的KEGG 通路主要有以下幾個方面，一是與炎癥和免疫調(diào)節(jié)有關，主要涉及的KEGG 包括hsa04620：Toll-like receptor signaling pathway、hsa04660：T cell receptor signaling path?way、hsa04668：TNF signaling pathway 和hsa04662：B cell receptor signaling pathway 等。其次是經(jīng)典的信號轉導通路，包括hsa04915：Estrogen signaling pathway、 hsa04012： ErbB signaling pathway、hsa04630： Jak-STAT signaling pathway 和hsa04010：MAPK signaling pathway。第三是細胞周期與凋亡調(diào)節(jié)信號，主要涉及hsa04115：p53 signal?ing pathway 和hsa04110：Cell cycle 通路。上述黨參相關基因的異常在hsa05212：Pancreatic cancer 通路中進一步得到了體現(xiàn)。KEGG 信號通路的復雜性提示黨參在治療胰腺癌中可能存在多網(wǎng)絡互作/協(xié)作的機制。

總之，本研究總結了黨參有效化合物類別，預測了這些有效化合物作用于胰腺癌中的靶基因，獲得關鍵節(jié)點基因并進行了相關GO 功能注釋和KEGG 信號富集，為應用黨參輔助胰腺癌的治療提供了參考依據(jù)。本研究利用網(wǎng)絡藥理學技術，將生物信息學與藥理學結合，為黨參的研發(fā)提供了一種基于大數(shù)據(jù)分析可行性策略，但相關研究結果還需要后續(xù)的實驗驗證。

作者貢獻度說明：

揭偉，鄭少江：論文設計；徐曉青，余亞萍，王炳淑，范永豪：文獻檢索；徐曉青，余亞萍，王炳淑，范永豪：數(shù)據(jù)統(tǒng)計；徐曉青，余亞萍，揭偉：圖表制作；徐曉青，余亞萍，揭偉：文稿撰寫；鄭少江：基金獲取。

所有作者無利益沖突。