西藍(lán)花種子EMS 誘變條件篩選

李慧慧，丁強(qiáng)強(qiáng)，張 書，張曉慧

（1.阜陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 安徽阜陽(yáng) 236065； 2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 合肥 230041）

西藍(lán)花（var.）又稱綠花菜、青花菜等，屬十字花科甘藍(lán)的一個(gè)變種，其口感佳，且富含蘿卜硫苷、蛋白質(zhì)、維生素C 等物質(zhì)，因而有“蔬菜皇冠”之稱。西藍(lán)花起源于地中海，近年來(lái)在中國(guó)的栽培面積快速增長(zhǎng)。目前，西藍(lán)花種植產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一，其面積約占全球的30%。但在栽培過(guò)程中存在一個(gè)較為突出的問(wèn)題，即我國(guó)所使用的95%以上的西藍(lán)花種子主要從日本、荷蘭等國(guó)家進(jìn)口。這個(gè)問(wèn)題產(chǎn)生的主要原因之一是，我國(guó)掌握的西藍(lán)花種質(zhì)材料較少，且這些材料間遺傳多樣性較低，難以育成有突破性的品種。因此，創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)成為解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

誘變是植物獲得新基因和新性狀的手段之一，不僅比自然變異頻率大、突變類型多，還可避免轉(zhuǎn)基因帶來(lái)的安全隱患問(wèn)題。甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）是一種不會(huì)造成染色體畸變，又可以誘導(dǎo)點(diǎn)突變的化學(xué)誘變劑。目前，EMS已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于蘿卜、玉米、馬鈴薯、大豆、小麥和水稻等作物的誘變育種。迄今，關(guān)于西藍(lán)花的研究多是在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、栽培技術(shù)和采后貯藏等方面，關(guān)于EMS 誘變西藍(lán)花種子的研究還未見報(bào)道。因此，筆者利用不同EMS 含量（，后同）與誘變時(shí)長(zhǎng)組合處理西藍(lán)花種子，并統(tǒng)計(jì)分析種子發(fā)芽情況與M1 的表型變化情況，以此探究西藍(lán)花種子EMS 誘變的適宜條件，為后續(xù)利用EMS 誘變技術(shù)創(chuàng)制西藍(lán)花種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所使用的材料為耐寒優(yōu)秀西藍(lán)花雜交一代種子，來(lái)自日本坂田公司（SAKATA）。

1.2 方法

1.2.1 種子處理與發(fā)芽試驗(yàn) 發(fā)芽試驗(yàn)于2020 年8月下旬在阜陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技園區(qū)連棟溫室中進(jìn)行，期間日均氣溫為28 ℃，土壤相對(duì)濕度保持在70%～80%。設(shè)置6 個(gè)EMS 含量梯度（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）與3 個(gè)誘變時(shí)長(zhǎng)（4、8、12 h）不同組合處理西藍(lán)花種子，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)50 粒。不同梯度的EMS 溶液使用含量0.1 mol·L、pH=7.0 的磷酸緩沖液作為溶劑進(jìn)行配制。處理的具體方法為：每個(gè)處理的種子（150 粒）分別放在濾袋中，在水中浸泡14 h 進(jìn)行預(yù)處理，使其吸水萌動(dòng)，然后吸去種子表面水分再進(jìn)行不同組合的EMS 處理。處理后的種子用流水沖洗2 h，取出輕微晾曬后播種在草炭土中。以后每3 d 觀察并記錄1 次西藍(lán)花種子發(fā)芽情況，且以0 梯度的EMS處理作為對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 觀察M1 植株表型變異情況 2020 年9 月27 日，苗齡30 d 左右時(shí)，以行距60 cm、株距40 cm定植于普通塑料大棚中。以梯度為0 的EMS 處理的表型為對(duì)照，主要觀察記錄M1 植株表型及花球表型變異情況，包括葉形、葉色、植株分枝、花球大小、花球顏色、蕾粒大小等。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)相關(guān)的指標(biāo) 發(fā)芽率/%=播后15 d 發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100；相對(duì)發(fā)芽率/%=處理組的發(fā)芽率/對(duì)照組的發(fā)芽率×100；相對(duì)致死率/%=（1-相對(duì)發(fā)芽率）×100；成苗率/%=成苗株數(shù)/種子總數(shù)×100；變異率/%= 變異株數(shù)/總成苗株數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和SPSS 22.0 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理分析，采用Excel 及Origin 7.5 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含量EMS處理對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽動(dòng)態(tài)的影響

由圖1 可以看出，與對(duì)照相似，低含量（0.2%和0.4%）的EMS 處理4、8、12 h 后，種子發(fā)芽基本在播后6 d 完成，且集中在播后3 d。處理時(shí)間4 h 時(shí)，當(dāng)EMS 含量為0.6%時(shí)，種子發(fā)芽在播后6 d 基本完成，集中在前3 d；EMS 含量為0.8%時(shí)，種子發(fā)芽在播后6 d 基本完成，但1～3 d 種子發(fā)芽量與4～6 d較為接近；EMS 含量為1.0%時(shí)，種子發(fā)芽在播后9 d基本完成，且4～6 d 種子發(fā)芽數(shù)最多。8、12 h 與0.6%、0.8%、1.0%EMS 的組合處理中，種子發(fā)芽在播后9 d 基本完成，除0.6%和0.8%處理8 h 的1～3 d種子發(fā)芽量與4～6 d 較為接近外，其他組合處理的種子發(fā)芽量集中在4～6 d。說(shuō)明較低含量的EMS溶液和較短的誘變時(shí)間對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽完成時(shí)間、發(fā)芽高峰期影響較小，較高含量（0.6%、0.8%和1.0%）的EMS 處理時(shí)間較長(zhǎng)（8 、12 h）會(huì)導(dǎo)致西藍(lán)花種子發(fā)芽完成時(shí)間、發(fā)芽高峰期明顯推遲。

圖1 不同含量EMS 處理后西藍(lán)花種子的發(fā)芽動(dòng)態(tài)

2.2 不同含量EMS處理對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽率的影響

由圖2 可以看出，除0.4%EMS+12 h 處理組合以外，較低含量的EMS（0.2%和0.4%）處理4 h、8 h和12 h 種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率均與對(duì)照差異不顯著，各處理組合之間差異也不顯著，發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率均在90%以上。使用0.6%的EMS 時(shí)，種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)致死率在處理4 h時(shí)與對(duì)照差異不顯著，但在處理8 h、12 h 時(shí)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率顯著下降，不同的處理時(shí)間之間差異顯著。使用更高含量的EMS（0.8%和1.0%）時(shí)，處理4 h、8 h 和12 h 均與對(duì)照差異顯著，而且同含量下不同時(shí)間處理也差異顯著，均表現(xiàn)為隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)種子發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率顯著下降，相對(duì)致死率顯著上升。從圖2 也可以看出，EMS 含量越高或處理時(shí)間越長(zhǎng)，西藍(lán)花種子發(fā)芽數(shù)就越少，1.0%EMS 處理12 h 后的種子發(fā)芽極少。綜上可知，隨著EMS 含量及處理時(shí)間的增加會(huì)導(dǎo)致西藍(lán)花種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率下降，相對(duì)致死率上升。

圖2 不同含量EMS 處理對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)致死率的影響

由表1 可知，EMS 處理的含量和時(shí)間對(duì)西藍(lán)花種子的發(fā)芽率影響均極顯著，兩者皆為影響西藍(lán)花種子發(fā)芽的主要因素，同時(shí)EMS 含量和處理時(shí)間的交互作用對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽的影響也極顯著。因此，在使用EMS 對(duì)西藍(lán)花種子進(jìn)行誘變時(shí)，應(yīng)綜合考慮EMS 誘變含量和誘變時(shí)間。

表1 不同EMS 含量和誘變時(shí)間處理的西藍(lán)花種子發(fā)芽率的方差分析

2.3 不同含量EMS處理西藍(lán)花種子對(duì)田間性狀的影響

由圖3 可知，誘變處理的西藍(lán)花M1 植株整體長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于對(duì)照，且表現(xiàn)出整株變異、某一器官變異和某器官的一部分變異。西藍(lán)花M1 表型變異主要集中在葉片和花球上，如葉片變圓、葉片皺縮卷曲、葉片部分（或邊緣）黃化或白化或黃綠化、花球顏色嵌合體、花球鵝黃色、花蕾變細(xì)小、花球小葉皺縮、花球變小、花莖黃化、花朵顏色變淺等，還有少數(shù)的植株變異，如分枝性變強(qiáng)、生長(zhǎng)點(diǎn)畸變等。

圖3 不同含量EMS 處理后西藍(lán)花M1 植株田間表現(xiàn)

由表2 可知，隨EMS 處理含量的增加或者處理時(shí)間的延長(zhǎng)，總表型變異率呈增加趨勢(shì)，成苗率呈下降趨勢(shì)。1.0%EMS+12 h 處理下表型變異率高達(dá)80.00%，但成苗率僅有6.67%，且主要是畸變。EMS 處理時(shí)間為8 h 的組合，得到的表型變異類型較多，包括花蕾細(xì)小、花球顏色變異、葉片顏色變異等。花球是西藍(lán)花最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，花球的誘變結(jié)果尤為重要。0.4%+8 h、0.6%+8 h、0.8%+8 h 和0.4%+12 h EMS 組合處理出現(xiàn)花蕾細(xì)小變異株分別為1、1、2、1 棵。0.4%+8 h、0.6%+8 h、0.8%+8 h、0.6%+12 h、0.6%+4 h 和0.8%+4 h EMS 組合處理出現(xiàn)花球顏色嵌合體變異株分別為1、4、1、2、3、3 棵，0.2%+8 h 處理組合誘導(dǎo)1 株西藍(lán)花整個(gè)花球變?yōu)轾Z黃色。總體上，0.6%+8 h、0.8%+8 h 兩個(gè)EMS 處理得到的植株中花蕾細(xì)小、花球顏色變異比例較高，畸變比例中等。

表2 不同含量EMS 處理后西藍(lán)花表型變異分析

3 討論與結(jié)論

EMS 處理是一種常用的誘變手段，不同作物或同種作物的不同器官對(duì)EMS 誘變劑的敏感性存在一定的差異，因此相應(yīng)的適宜誘變條件也不同。在進(jìn)行EMS 誘變時(shí)，大白菜種子的適宜條件為0.4%～0.6%EMS 處理4 h，而大白菜花粉的適宜條件則為0.15%EMS 處理45～60 min。與楊楠等、李林章等及薛紅霞的研究結(jié)果一致，隨著EMS 含量的增加及誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，西藍(lán)花種子的發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的浸泡阻礙了種子的正常呼吸代謝過(guò)程，而高含量的誘變劑則產(chǎn)生毒害作用，從而抑制了種子萌發(fā)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，EMS 含量、誘變時(shí)間以及兩者的交互作用均對(duì)西藍(lán)花種子發(fā)芽率產(chǎn)生極顯著的影響。因此，在對(duì)西藍(lán)花種子進(jìn)行EMS 誘變時(shí)應(yīng)綜合考慮EMS 誘變含量和誘變時(shí)間。

適宜的誘變條件應(yīng)同時(shí)滿足較低的生理?yè)p傷和較高的突變頻率，一般以造成半致死率的條件作為適宜誘變條件。前人報(bào)道中分別將發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、花粉活力、相對(duì)成苗率等指標(biāo)的半致死劑量作為最佳條件。在本試驗(yàn)中，EMS 含量為1.0%時(shí)，處理8 h 和12 h 的成苗率都非常低，且M1畸變株占比大。這可能是EMS 含量較高，造成種子內(nèi)部生理性損傷較大，導(dǎo)致發(fā)芽率和成苗率低，不宜作為EMS 誘導(dǎo)西藍(lán)花種子的適宜條件。其他誘變條件，如0.2%+8 h 處理出現(xiàn)鵝黃色花球，0.4%+8 h、0.6%+8 h、0.8%+8 h 處理出現(xiàn)花球顏色嵌合體和花蕾變細(xì)小，在以后的相關(guān)研究中可被利用，但這些組合中EMS 含量較低或處理時(shí)間較短，種子損傷較小，發(fā)芽率和成苗率較高，在M1 篩選過(guò)程中工作量較大。0.8%EMS 處理12 h，西藍(lán)花種子的相對(duì)致死率為59.78%，但成苗率僅為30%，且突變體中主要是畸變株（占比96.88%），也不是最佳的EMS 誘變條件。值得注意的是，0.6%+12 h 組合處理的西藍(lán)花種子成苗率為50%，得到的M1 表型包含多種變異，包括花球嵌合體、葉色及葉形變異等。據(jù)徐美隆報(bào)道，EMS 誘導(dǎo)麗格海棠的變異株系中35%～45%變異株系為嵌合體，且其中一些嵌合體變異性狀可以穩(wěn)定遺傳。因此，0.6%+12 h 組合處理西藍(lán)花獲得的變異性狀也有可能穩(wěn)定遺傳，具有利用價(jià)值。

綜上所述，根據(jù)西藍(lán)花M1 變異率和成活率綜合考慮，以50%成苗率作為半致死劑量，0.6%+12 h的EMS 處理組合可初步作為西藍(lán)花種子的適宜誘變條件。本試驗(yàn)結(jié)果可為開展西藍(lán)花EMS 誘變育種相關(guān)研究工作提供理論參考。