水中葉綠素a 測(cè)定方法的比較研究

張 婧

（北京市朝陽(yáng)區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，北京 100125）

葉綠素是植物光合作用中的重要光合色素。通過(guò)測(cè)定浮游植物葉綠素，可掌握水體的初級(jí)生產(chǎn)力情況。在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，可將葉綠素a 含量作為湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的指標(biāo)之一[1]。近30年來(lái)，由于我國(guó)水環(huán)境的惡化，特別是水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題，使得浮游植物葉綠素a 的測(cè)定被廣泛地應(yīng)用[2]。

目前本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定葉綠素a 的方法為環(huán)境保護(hù)部發(fā)布的HJ 897—2017《水質(zhì) 葉綠素a 的測(cè)定 分光光度法》[3]。該法使用90%丙酮作為提取試劑，丙酮試劑對(duì)人體危害較大且易揮發(fā)，在人工研磨過(guò)程中存在少量飛濺現(xiàn)象，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員健康影響存在隱患，在反復(fù)研磨過(guò)程中葉綠素a 容易發(fā)生光降解[4-6]直接影響葉綠素a的測(cè)定結(jié)果；另一方面，不同材質(zhì)濾膜的提取效率對(duì)葉綠素a 測(cè)定結(jié)果有直接影響。因此，本文通過(guò)手工研磨與儀器研磨方式、乙酸纖維濾膜與玻璃纖維濾膜進(jìn)行了對(duì)比，經(jīng)檢驗(yàn)本文改進(jìn)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)要求，在一定程度上提高了葉綠素a 的檢出效率。

1 方法與材料

1.1 方法標(biāo)準(zhǔn)及原理

目前測(cè)定地表水中葉綠素a 含量的標(biāo)準(zhǔn)方法是環(huán)境保護(hù)部于2017年12月21日發(fā)布的HJ 897—2017《水質(zhì) 葉綠素a 的測(cè)定 分光光度法》[3]。標(biāo)準(zhǔn)方法原理是將一定量樣品用濾膜過(guò)濾截留藻類，研磨破碎藻類細(xì)胞，再用丙酮溶液提取水中浮游植物的葉綠素，離心分離后分別于750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定提取液吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算水中葉綠素a的濃度。

1.2 材料與試劑

分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭瑢?shí)驗(yàn)用水為新制備的超純水，使用試劑及溶劑情況登記表見(jiàn)表1。

表1 使用試劑及溶劑情況登記表

材料及試劑配制如下。

（1）丙酮溶液：9+1

在900 mL 丙酮中加入100 mL 實(shí)驗(yàn)用水。

（2）碳酸鎂懸濁液

稱取1.0 g 碳酸鎂加入100 mL 實(shí)驗(yàn)用水，攪拌成懸濁液（使用前充分搖勻）。

（3）玻璃纖維濾膜：孔徑0.45～0.7 μm。

（4）乙酸纖維濾膜：孔徑為0.45 μm。

1.3 儀器和設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（配10 mm 石英比色皿）、離心機(jī)（相對(duì)離心力1000×g，轉(zhuǎn)速3 000 ～4 000 r/min）、組織研磨器、玻璃研磨器、配真空泵不銹鋼溶液過(guò)濾器、0.45 μm 有機(jī)相針式過(guò)濾器等均符合方法要求，且儀器已檢定/校準(zhǔn)合格，并在有效期內(nèi)，儀器使用情況見(jiàn)表2。

表2 使用儀器情況登記表

2 樣品采集與保存

為保證研究方法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與全面性，根據(jù)本轄區(qū)（朝陽(yáng)區(qū)）近幾年水質(zhì)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，特選取葉綠素a 濃度處于中營(yíng)養(yǎng)、輕富營(yíng)養(yǎng)、中富營(yíng)養(yǎng)不同特征的紅領(lǐng)巾湖、朝陽(yáng)公園湖、鎮(zhèn)海寺公園湖3個(gè)地表水點(diǎn)位進(jìn)行方法研究與對(duì)比。依據(jù)文獻(xiàn)[3]進(jìn)行保存與運(yùn)輸。

3 實(shí)驗(yàn)方法分析步驟

3.1 樣品過(guò)濾

在過(guò)濾裝置上裝好濾膜，根據(jù)水體營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)確定取樣體積。雖然都屬于中營(yíng)養(yǎng)化水平，但紅領(lǐng)巾湖程度偏輕，用量筒量取200 mL 的混勻樣品，朝陽(yáng)公園湖和鎮(zhèn)海寺公園湖程度偏重，分別量取100 mL 的混勻樣品進(jìn)行過(guò)濾，最后用少量蒸餾水沖洗濾器壁。過(guò)濾時(shí)負(fù)壓不超過(guò)50 kPa，在樣品剛剛完全通過(guò)濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷子將濾膜取出，將有樣品的一面對(duì)折，用濾紙吸干濾膜水分。

3.2 研磨

玻璃研磨器：手工研磨將樣品濾膜放置于研磨裝置中，加入3～4 ml 丙酮溶液，研磨至糊狀。補(bǔ)加3～4 mL丙酮溶液，繼續(xù)研磨，并重復(fù)1～2 次，保證充分研磨5 min 以上。將完全破碎后的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管中，定容至10 mL。

組織研磨器：本文選用珠磨式研磨儀，通過(guò)劇烈晃動(dòng)裝有待測(cè)濾膜、玻璃珠（直徑0.5 mm）和提取液的微離心管，使數(shù)百顆玻璃珠豎直運(yùn)動(dòng)的同時(shí)高速撞擊濾膜，研磨5 min 后將完全破碎后的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管中，定容至10 mL。

3.3 浸泡提取、離心、測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)[3]進(jìn)行浸泡提取、離心、測(cè)定。

3.4 計(jì)算

葉綠素a（μg/L）=［11.85×（D664－D750）－1.54×（D647－D750）－0.08×（D630－D750）］×V1/V2·δ，式中V1為提取定容后的體積（mL），V2為樣品體積（L），D 為吸光度值，δ 為比色皿光程（cm）。

4 測(cè)定葉綠素a 方法研究

4.1 濾膜的比對(duì)

4.1.1 空白試驗(yàn)測(cè)試

為確定改進(jìn)方法的濾膜類型，研究不同類型濾膜對(duì)水樣葉綠素a 測(cè)定結(jié)果的影響，文獻(xiàn)[1]采用的是乙酸纖維濾膜，文獻(xiàn)[3]采用的是玻璃纖維濾膜過(guò)濾水樣。

首先比較不同濾膜的吸光度。將空白水樣作為樣品，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)7個(gè)平行，抽濾體積為500 mL，與實(shí)際水樣按相同步驟操作，以丙酮溶液為參比，于波長(zhǎng)750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 處測(cè)量吸光度。

結(jié)果表明乙酸纖維濾膜和玻璃纖維濾膜在750 nm 處吸光度小于0.005，見(jiàn)表3，兩種濾膜都符合開(kāi)展監(jiān)測(cè)葉綠素a 濃度的條件。

表3 空白試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

4.1.2 檢出限、測(cè)定下限的測(cè)試

由于空白試驗(yàn)無(wú)法檢測(cè)到目標(biāo)測(cè)試物，按照HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》[7]的指導(dǎo)規(guī)范，選擇方法檢出限值3~5 倍的樣品（紅領(lǐng)巾湖）進(jìn)行7 次平行測(cè)定，計(jì)算公式：MDL=t×S，其中S 為7 次重復(fù)樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，t 是當(dāng)自由度為n-1，置信度為99%時(shí)，單邊t 檢驗(yàn)情況下的標(biāo)準(zhǔn)偏差，查表可得t=3.143，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 紅領(lǐng)巾湖方法檢出限、測(cè)定下限測(cè)試結(jié)果 單位:μg/L

玻璃纖維濾膜7 次平行測(cè)定計(jì)算得到檢出限為1.49 μg/L，測(cè)定下限為5.96 μg/L，乙酸纖維濾膜7 次平行測(cè)定計(jì)算得到檢出限為1.54 μg/L，測(cè)定下限為6.16 μg/L，兩種濾膜均低于標(biāo)準(zhǔn)HJ 897—2017[3]中規(guī)定檢出限2 μg/L、測(cè)定下限8 μg/L 的要求。但通過(guò)數(shù)據(jù)可以看出，玻璃纖維濾膜的測(cè)試結(jié)果更優(yōu)于乙酸纖維濾膜。

4.1.3 濾膜精密度測(cè)試

再研究玻璃纖維濾膜與乙酸纖維濾膜對(duì)實(shí)際水樣中葉綠素a 測(cè)定結(jié)果的影響，本文選取本轄區(qū)內(nèi)處于中營(yíng)養(yǎng)、輕富營(yíng)養(yǎng)、中富營(yíng)養(yǎng)不同特征的紅領(lǐng)巾湖、朝陽(yáng)公園湖、鎮(zhèn)海寺公園湖作為樣品，同時(shí)為減少實(shí)驗(yàn)人為誤差，研磨方式統(tǒng)一選用本文3.2 中的珠磨式研磨儀。對(duì)比兩種濾膜在相同實(shí)驗(yàn)條件下，不同濾膜對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 濾膜精密度測(cè)試結(jié)果 單位：μg/L

測(cè)定實(shí)際水樣的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，玻璃纖維濾膜呈化學(xué)惰性，不含粘合劑，不發(fā)生溶解，玻璃纖維濾膜在研磨過(guò)程中較難研磨，需要的機(jī)械力比較大，但對(duì)于藻類細(xì)胞的破碎比較完全。乙酸纖維濾膜抽濾速度較慢，抽濾同一樣品的時(shí)間約是玻璃纖維濾膜的2～3 倍；同時(shí)，乙酸纖維濾膜部分溶于丙酮，遇丙酮融化成糊狀，不容易完全轉(zhuǎn)移，而且不容易判斷研磨是否充分。

4.1.4 方法比對(duì)t 檢驗(yàn)

對(duì)于改進(jìn)方法中玻璃纖維濾膜與原方法乙酸纖維濾膜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，對(duì)三種濃度的實(shí)際樣品進(jìn)行7次平行測(cè)定，同時(shí)對(duì)每個(gè)濃度樣品使用改進(jìn)方法與原方法均分別進(jìn)行平行雙樣測(cè)定，平行雙樣測(cè)定的平均值分別記做改進(jìn)方法的測(cè)定值（A）和原方法測(cè)定值（B）。通過(guò)t 檢驗(yàn)對(duì)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表6，t 檢驗(yàn)計(jì)算公式為

表6 方法比對(duì)t 檢驗(yàn)結(jié)果表 單位：μg/L

經(jīng)過(guò)計(jì)算得出低、中、高三種不同濃度下t 值分別為1.641、1.889、1.110，給定α=0.05，查t 值表：t0.05（12）=2.179，三種濃度下的t 值均小于t0.05（12），所以兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，比對(duì)測(cè)試結(jié)果滿意。

4.2 研磨方式

4.2.1 研磨方式精密度測(cè)試

本文通過(guò)人工研磨與珠磨式研磨儀對(duì)比，測(cè)試不同研磨方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 研磨方式精密度測(cè)試結(jié)果 單位：μg/L

通過(guò)實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，珠磨式研磨儀操作簡(jiǎn)單，研磨過(guò)程中研磨管帶有螺紋研磨蓋，大幅度減少光照對(duì)葉綠素a 測(cè)定的影響，同時(shí)減少丙酮的揮發(fā)與飛濺；另一方面，研磨較為充分，樣品濾膜經(jīng)過(guò)浸泡離心后，比較容易沉入離心管底部，方便上清液的提取。

4.2.2 準(zhǔn)確度測(cè)試

為進(jìn)一步論證珠磨式研磨儀的準(zhǔn)確度，特加入人員比對(duì)測(cè)試，參與比對(duì)測(cè)試人員均持有《水質(zhì) 葉綠素a 測(cè)定 分光光度法》的測(cè)定證書(shū)，采集三種不同濃度水樣，通過(guò)相同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)同一水樣進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 人員比對(duì)測(cè)試結(jié)果 單位：μg/L

比對(duì)結(jié)果表明三種濃度樣品不同人員測(cè)定的相對(duì)偏差分別為2.5%、1.8%、1.1%，符合平行樣的相對(duì)偏差值<20%的要求。

5 結(jié)論

5.1 濾膜比較優(yōu)勢(shì)

玻璃纖維濾膜較乙酸纖維濾膜的優(yōu)勢(shì)在于：

（1）玻璃纖維濾膜呈化學(xué)惰性，不含粘合劑，不發(fā)生溶解，對(duì)于藻類細(xì)胞的破碎比較完全，減少誤差；

（2）玻璃纖維濾膜表面截留的藻類含量高、研磨率高，對(duì)葉綠素的提取效率較好；

（3）測(cè)定結(jié)果表明玻璃纖維濾膜所測(cè)得葉綠素a的濃度值更準(zhǔn)確。

5.2 研磨方式比較的優(yōu)勢(shì)

組織研磨較人工研磨的優(yōu)勢(shì)在于：

（1）珠磨式研磨儀操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間，研磨過(guò)程中研磨管帶有螺紋研磨蓋，較大程度減少丙酮的揮發(fā)與飛濺及光照條件對(duì)葉綠素a 測(cè)定的影響；

（2）在測(cè)定葉綠素a 的研磨過(guò)程中需要加入90%丙酮作為提取試劑，運(yùn)用珠磨式研磨儀減少對(duì)實(shí)驗(yàn)人員與丙酮試劑的接觸，較大程度減少影響實(shí)驗(yàn)人員健康存在的隱患；

（3）珠磨式研磨儀研磨較為充分，減少實(shí)驗(yàn)人員判定誤差，同時(shí)，樣品濾膜經(jīng)過(guò)浸泡離心后，比較容易沉入離心管底部，方便上清液的提取。

5.3 改進(jìn)方法滿足標(biāo)準(zhǔn)要求

由以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較結(jié)果，可以得出結(jié)論：選擇玻璃纖維濾膜和組織研磨方式在空白實(shí)驗(yàn)、檢出限、精密度和準(zhǔn)確度方面都滿足HJ 897—2017《水質(zhì) 葉綠素a 的測(cè)定 分光光度法》的要求，可以選用改進(jìn)方法。