干露脅迫對毛蚶稚貝生理代謝相關(guān)酶活力的影響

張 揚，江天棋，姜亞洲，凌建忠，孫 鵬，唐保軍

（上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

生活在潮間帶的海水貝類易受干露、高溫、低氧等多種環(huán)境因素影響［1］，其中干露時間過長被視為潮間帶貝類最致命的威脅［2-3］。干露脅迫下，潮間帶貝類體內(nèi)水分逐漸喪失［4-5］，生長延緩甚至死亡［6-8］。研究發(fā)現(xiàn)，厚殼貽貝（Mytilus coruscus）稚貝在1～8℃下干露48 h后死亡率即達40%以上［9］，硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）稚貝干露48 h后死亡率達63.3%［6］，中國蛤蜊（Mactra chinensis Philippi）稚貝在干露20 h后死亡率即達40%以上［10］。同時，因無法獲得足夠氧氣，貝類代謝方式由有氧呼吸逐漸轉(zhuǎn)為無氧呼吸，其代謝產(chǎn)物會對貝類造成損傷［4，11-12］。干露脅迫顯著影響大竹蟶（Solen grandis）呼吸代謝酶的活力［13］，并導致魁蚶（Scapharca broughtonii）幼貝出現(xiàn)顯著的氨氮積累，顯著影響其再次入水后的耗氧率和排氨率［4］。此外，有研究報道，干露脅迫下貝類體內(nèi)非特異性免疫酶的活力，如酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶等，也會發(fā)生變化［14］。因此，研究干露脅迫下潮間帶貝類的生理代謝酶活力，有助于了解海水貝類的逆境適應(yīng)機制。

毛蚶屬于軟體動物門，瓣鰓綱，翼形亞綱，蚶目，蚶科，毛蚶屬，俗稱毛蛤、麻蚶、瓦楞子等，在我國北起鴨綠江、南至海南均有分布，萊州灣、渤海灣、遼東灣、海州灣、象山港等區(qū)域資源尤為豐富，是重要的經(jīng)濟貝類。毛蚶生活史可分為3個階段：浮游期、附著期、底棲期，當毛蚶殼長12～15 mm后開始底棲生活［15］。退潮后附著或底棲的毛蚶可能露出灘面暴露在空氣中，毛蚶苗種的運輸過程中也會遭受干露脅迫。本研究測定了干露脅迫下毛蚶稚貝的生理代謝相關(guān)酶活力，并以濾水率和耗氧率為指標評估干露脅迫后稚貝的恢復狀況，以期為毛蚶耐干露脅迫生理指標的篩選和生理響應(yīng)機制研究提供參考，并為毛蚶大規(guī)格苗種運輸和增養(yǎng)殖提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

毛蚶稚貝采自浙江寧波象山港海域灘涂，取回實驗室后挑選大小一致的個體［平均殼長（16.99±2.48）mm，平均體質(zhì)量（1.98±0.46）g］，清除表面附著物后放入2 000 L玻璃鋼桶暫養(yǎng)3 d。暫養(yǎng)期間，海水鹽度21.55±1.09，控制水溫（20.0±0.5）℃，每天換水一次，投喂2次亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis）。

1.2 失水率測定

將300只毛蚶稚貝平均分成3組，貝殼表面水分用吸水紙擦干，分別測定各組初始總質(zhì)量，直接暴露在室內(nèi)陰涼處空氣中進行干露，空調(diào)控制室內(nèi)溫度為20℃，相對濕度為50%，采用自然光照。測定干露后2、4、8、12、24、36、48、72 h的總質(zhì)量，用差減法計算單位個體干露失水率（如中間有死亡，記錄死亡個數(shù)，去除死亡個體，繼續(xù)稱重，以毛蚶貝殼張開、觸碰后無閉殼反應(yīng)為標準認定死亡狀態(tài)）［16］。

1.3 酶活測定

毛蚶稚貝干露48 h后死亡率超過33.3%，因此測定毛蚶干露前48 h的生理代謝相關(guān)酶活力。分別于干露2、6、12、24、48 h取稚貝，未干露稚貝設(shè)為對照組，在冰盤上迅速解剖取全組織，液氮冷凍后置-80℃冰箱保存。酶活力測定時，將組織和9倍體積的0.9%生理鹽水放入預冷的勻漿機中，制成組織勻漿，以2 500 r·min-1離心15 min，取上清液測定丙酮酸激酶（PK）、己糖激酶（HK）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和酸性磷酸酶（ACP）活力以及三磷酸腺苷（ATP）含量。

各酶活力均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定，具體測定方法按照試劑盒說明書。PK酶活力為1 min內(nèi)1 g組織蛋白1μmol的磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸為1個酶活力單位。HK酶活力定義為1 mg組織蛋白1 min生成1 nmol的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸定義為1個酶活力單位。SDH酶活力定義為1 mg蛋白1 min使反應(yīng)體系的吸光度降低0.01為1個比活力單位。SOD酶活力定義為1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個活力單位。ACP酶活力定義為30 min內(nèi)產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位。采用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白濃度。

1.4 耗氧率和濾水率測定

為研究干露脅迫后毛蚶稚貝呼吸代謝的恢復情況，取20℃下干露48 h的200只毛蚶稚貝放回水溫20℃的海水中，測定濾水率和耗氧率。

濾水率實驗在3 L廣口瓶中進行，每瓶加亞心形扁藻10 mL，使藻細胞濃度約為1.0×104個·mL-1，每個處理組設(shè)置3個平行，每瓶放10只稚貝，未干露的稚貝為對照組，另設(shè)不放貝的空白瓶，用來校正實驗瓶中藻濃度的變化。毛蚶貝殼張開后開始計時，每隔20 min取一次水樣，連續(xù)取樣3次，每次取水量為500 mL，以孔徑為0.45μm的混合纖維素酯濾膜抽濾水樣，測定葉綠素a（Chla）含量。實驗結(jié)束后用游標卡尺測量實驗貝生物學數(shù)據(jù)，解剖取軟體部于65℃烘干24 h，稱量組織干重。

濾水率按COUGHLAN［17］的方法計算，公式如下：

式（1）中，V為取樣時瓶內(nèi)海水體積（L），m為實驗用貝軟體部干重（g），C0和Ct分別為每兩次取樣間試驗組瓶內(nèi)Chla濃度（μg·L-1），t為取樣間隔時間。

耗氧率采用500 mL玻璃呼吸瓶測定，呼吸瓶內(nèi)放10只稚貝，每個時間點設(shè)3個平行，未做干露處理的毛蚶作為對照組，不放貝的呼吸瓶作為空白組。放入毛蚶5 min后開始計時，用溶解氧測定儀（雷磁JPBJ-609L）測定瓶內(nèi)溶解氧濃度，讀數(shù)間隔2 min，持續(xù)1 h。實驗結(jié)束后用游標卡尺測量稚貝殼長，解剖取軟體部于65℃烘干24 h，稱量組織干重。

根據(jù)下式計算耗氧率：

式（2）中，R為單位體質(zhì)量耗氧率，b為溶解氧濃度對時間線性回歸的斜率絕對值（扣除空白組溶解氧濃度變化），V為呼吸瓶體積（L），m為稚貝軟體部干重（g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差（mean±SD）表示。利用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理、繪圖，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 干露脅迫對毛蚶稚貝失水率的影響

毛蚶失水率與干露時間的關(guān)系滿足曲線方程y＝-0.002 7x2＋0.767 9x＋0.379 5，R2＝0.995 6（n＝300，P＜0.05）（圖1）。失水率隨著干露時間的延長而增大，干露12 h后毛蚶失水率達9.45%，48 h后失水率達32.38%。毛蚶稚貝在干露48 h后死亡率超過30%。

圖1 干露脅迫對毛蚶失水率的影響Fig.1 Effect of air exposure on water loss rate of S.kagoshimensis

2.2 干露脅迫對毛蚶稚貝生理代謝相關(guān)酶活力的影響

在干露條件下，毛蚶組織PK活力在干露2 h顯著上升，在6 h恢復到對照組水平，其后在12～24 h顯著高于對照組，后下降到對照組水平（表1）。干露脅迫后，組織HK活力下降，處理后6、12、48 h活力顯著低于對照組（P＜0.05），在12 h降至最小值，2 h和24 h的活力與對照組相比差異不顯著。毛蚶組織SDH活力先上升后下降。與對照組相比，處理后2～6 h SDH活力無顯著變化，至12 h SDH活力顯著升高（P＜0.05），達到最大值，其后SDH活力下降，恢復到對照組水平，干露48 h的SDH 活力顯著低于對照組（P＜0.05）。

毛蚶組織ATP含量先上升后下降（表1）。干露處理后2 h，組織ATP含量與對照組差異不顯著，6～12 h組織ATP含量顯著高于對照組（P＜0.05），在12 h達到最大值，其后開始下降，24～48 h恢復到對照組水平。

表1 干露脅迫對毛蚶代謝酶活力及ATP含量的影響Tab.1 Effect of air exposure on metabolic enzyme activity and ATP content of S.kagoshimensis

干露脅迫后，毛蚶組織SOD活力先下降后上升（表2）。干露處理后2 h，SOD活力與對照組相比無顯著差異；處理后6～24 h，SOD活力顯著低于對照組（P＜0.05），在12 h降至最小值；在48 h SOD活力恢復到對照組水平。組織ACP活力先上升后下降。與對照組相比，干露后2 h的ACP活力無顯著變化；處理后6～12 h，ACP活力顯著高于對照組（P＜0.05）；24～48 h，ACP活力持續(xù)下降，恢復至對照組水平。

表2 干露脅迫對毛蚶免疫相關(guān)酶活力的影響Tab.2 Effect of air exposure on immune enzyme activity of S.kagoshimensis

2.3 放回水中后毛蚶稚貝濾水率和耗氧率變化

毛蚶稚貝放回水中后6～24 h，濾水率升高，但與對照組相比無顯著變化，至48 h濾水率顯著升高（P＜0.05）（圖2）。毛蚶放回水中后，耗氧率先下降后上升，最小值與最大值分別出現(xiàn)在12 h和24 h，各個時間點的耗氧率均與對照組差異不顯著（圖3）。

圖2 干露48 h后放回水中毛蚶濾水率的變化Fig.2 Variation of filtration rates of S.kagoshimensis back to water after 48-hour air exposure

圖3 干露48 h后放回水中毛蚶耗氧率的變化Fig.3 Variation of oxygen consumption rates of S.kagoshimensis back to water after 48-hour air exposure

3 討論

3.1 失水率

水是生命活動的必須介質(zhì)，細胞內(nèi)的酶活反應(yīng)以及其他化學反應(yīng)都離不開水。毛蚶屬于雙殼貝類，在遭遇環(huán)境因子脅迫時會出現(xiàn)緊閉貝殼的現(xiàn)象［18］。本實驗中，干露過程中毛蚶雙殼關(guān)閉，通過這種方法來減少水分流失。不同種類貝類的閉合程度和厚薄不同，從而導致對干露的耐受能力不同［8］。本實驗中，隨著干露時間延長，毛蚶失水率逐漸增大，12 h的失水率為9.45%，24 h的失水率為17.88%，而干露24 h的文蛤（Meretrix meretrix）失水率僅為3%［16］；這可能因為文蛤貝殼邊緣光滑，閉合較緊，而毛蚶貝殼邊緣呈鋸齒狀，易于蒸發(fā)水分。不同規(guī)格的貝類耐干露能力也不同，如海灣扇貝（Argopecten irradians）［19］的成貝耐干露能力大于稚貝和幼貝。據(jù)報道，殼長0.7～20.0 mm的毛蚶苗在20℃下干露15 h死亡率超過50%［20］，殼長22.25～27.49 mm的毛蚶在18℃下干露3 d存活率仍接近100%［21］，本實驗中，平均殼長約17 mm的毛蚶稚貝在20℃下干露48 h死亡率超過30%，說明不同規(guī)格的毛蚶耐干露能力有差異，關(guān)于毛蚶成貝的耐干露能力需繼續(xù)開展研究。

3.2 生理代謝酶活力

丙酮酸激酶是糖酵解過程中的主要限速酶之一，己糖激酶是糖酵解途徑中控制葡萄糖代謝速率的第一個關(guān)鍵酶，在機體代謝過程中發(fā)揮著重要作用和調(diào)節(jié)功能［22］。本實驗中，HK和PK兩種酶的活力在12 h前后變化較大，說明隨著干露時間的延長，稚貝可能通過調(diào)節(jié)兩種酶的活力調(diào)控代謝方式和水平，提高葡萄糖的無氧氧化產(chǎn)生ATP，為機體提供能量，以抵抗干露脅迫對機體的影 響， 這 與 三 疣 梭 子 蟹 （Portunus trituberculatus）［23］、厚殼貽貝［24］的研究報道一致。

SDH負責把琥珀酸脫氫形成延胡索酸，是有氧氧化中重要的酶［22］。本實驗中，SDH活力在12 h達到最大值，說明12 h是毛蚶有氧呼吸最旺盛的時間，毛蚶通過增強SDH活力來加速丙酮酸分解產(chǎn)生ATP，為機體抵抗干露脅迫提供能量。12 h后SDH活力逐漸下降，可能因為隨著氧氣攝入越來越少，毛蚶稚貝逐漸轉(zhuǎn)入無氧呼吸。有研究表明，大竹蟶SDH酶活力隨著干露時間的延長逐漸下降，超過24 h活力下降愈發(fā)明顯［13］，說明對海水貝類來說，12～24 h是干露耐受的重要節(jié)點［25］。

能量穩(wěn)態(tài)對生物環(huán)境脅迫耐受性起著關(guān)鍵作用，能量平衡是動物脅迫適應(yīng)的基本要求。能量的獲取、轉(zhuǎn)換與分配影響動物環(huán)境壓力下的代謝適應(yīng)。在不同的環(huán)境脅迫壓力下，生物體往往表現(xiàn)出不同的能量代謝策略［3，26-27］。本實驗中，在12 h之前毛蚶全組織ATP含量隨干露時間延長而增加，在12 h達到最大值，與SDH活力的變化趨勢一致，說明毛蚶通過提升有氧代謝水平，產(chǎn)生能量以應(yīng)對不利環(huán)境帶來的影響。12 h以后可能毛蚶體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝，有氧條件下1分子葡萄糖可產(chǎn)生32個ATP，而糖酵解只能產(chǎn)生4個ATP分子［22］，導致毛蚶體內(nèi)ATP含量下降。有研究報道，蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）在4℃干露下24 h內(nèi)ATP含量變化不大，而48 h后含量急劇下降［28］，也可能與此有關(guān)。

SOD是抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶［29］。本實驗中，毛蚶組織SOD活力在干露后6～24 h出現(xiàn)下降，表明干露脅迫對毛蚶的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了顯著影響，可能產(chǎn)生的大量活性氧自由基抑制了抗氧化酶的活力。菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）在25℃下干露，SOD活力也出現(xiàn)顯著下降［14］，而蝦夷扇貝各組織SOD活力在4℃干露1 d后顯著上升［28，30］，說明不同貝類在應(yīng)對干露脅迫時的免疫反應(yīng)有差異。ACP是溶酶體的重要組成部分，在體內(nèi)直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝，并在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［31］。在本實驗中，干露2 h時ACP活力變化不大，6～12 h活力顯著上升，表明干露脅迫激活了毛蚶體內(nèi)參與免疫的水解酶活力，以增加機體對外源異物的防御能力和代謝水平。有研究指出，干露條件下甲殼類無法獲得足夠的氧氣，體內(nèi)以無氧呼吸為主，會產(chǎn)生乳酸、琥珀酸等無氧代謝產(chǎn)物，導致甲殼類酸中毒［11-12］，破壞其免疫功能［4，32-34］，說明干露脅迫下甲殼類的呼吸代謝與免疫功能密切相關(guān)。

以上結(jié)果表明，干露脅迫初期，毛蚶稚貝主要通過有氧呼吸為機體提供能量；隨著干露時間延長，稚貝逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝。轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，長牡蠣（Crassastrea gigas）在干露脅迫后維持基礎(chǔ)代謝的能量成本增加，隨著脅迫延續(xù)，長牡蠣通過減少體內(nèi)代謝活動維持機體基礎(chǔ)能量消耗，整體能量策略從積極的補償策略變?yōu)楸Ｊ氐墓?jié)能策略［27］，本實驗中毛蚶稚貝的代謝適應(yīng)策略應(yīng)與長牡蠣類似。

3.3 脅迫后恢復狀況

呼吸代謝是直接反映生物體能量代謝的基本生理活動，不僅反映生物體的代謝特征和生理狀態(tài)，還可用來評估環(huán)境改變對生物體的影響程度［13］。貝類濾水率受生物因素和環(huán)境因素的影響較大［35-37］，是反映貝類生理狀態(tài)的重要指標。耗氧率是新陳代謝的重要指標之一，也是貝類能量學研究的重要參數(shù)。環(huán)境條件不適合時，貝類通過調(diào)整自身代謝，消耗自身儲存的能量來抵抗逆境，從而導致耗氧率的變化［38］。本實驗中，干露毛蚶的濾水率在放回水中后，前12 h與對照組無顯著差異，說明干露脅迫后毛蚶攝食能力的恢復需要一定時間，可能與毛蚶貝殼的開放程度有關(guān)。貝類在遇到不適環(huán)境時會通過關(guān)閉進出水管或貝殼來保護自己［39］，進出水管上側(cè)纖毛也會減少擺動［40-41］，進出貝類體內(nèi)的氧氣量和水量會降低，導致耗氧率和濾水率下降。12 h后毛蚶的濾水率顯著升高，說明毛蚶適應(yīng)了水環(huán)境，貝殼張開，與外界水體交換量增大，這與對文蛤［16］的研究結(jié)果一致。本研究中，干露脅迫后放回水中的毛蚶耗氧率先降低后升高。貝類在經(jīng)過脅迫后會出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象，經(jīng)過一段時間的適應(yīng)后，會進行代謝補償［15］，如櫛江珧（Atrina pectinata）耗氧率會隨著溫度的升高先降低后升高［37］。本實驗中，毛蚶放回水中24～48 h，耗氧率與對照組無顯著差異，說明毛蚶經(jīng)過48 h的干露后呼吸代謝仍然可以恢復到正常水平。

4 小結(jié)

本研究表明，干露脅迫對毛蚶稚貝的生理代謝有顯著影響。干露脅迫初期，毛蚶稚貝通過提高有氧代謝水平維持基礎(chǔ)代謝；隨著干露時間延長，稚貝逐漸轉(zhuǎn)為無氧代謝，以降低機體能量需求，維持機體生存需要。重新接觸海水后，毛蚶稚貝通過調(diào)節(jié)代謝水平，如升高濾水率、降低耗氧率，來增加餌料攝入和機體能量水平，以盡快恢復到正常狀態(tài)。本實驗結(jié)果表明，毛蚶運輸時干露時間應(yīng)控制在24 h內(nèi)，以降低無氧代謝對毛蚶機體的損傷。