等鞭金藻培養(yǎng)方式及其應用研究進展

李道貴，陳 娜，洪育翎，林榮昭，吳黎明，何勇錦

(福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117)

第一次工業(yè)革命以來，人類活動逐漸頻繁，工業(yè)化伴隨著二氧化碳、甲烷等溫室氣體過量排放，加劇全球氣候變化，致使極端天氣頻發(fā)。此外，在工業(yè)化的進程中，全球人口迅速增加，而人均耕地面積卻在逐漸減少，因此尋找可持續(xù)性、不依賴于耕地的農(nóng)產(chǎn)品來代替?zhèn)鹘y(tǒng)農(nóng)作物成為了重要的研究方向。等鞭金藻(Isochrysisgalbana)作為水生自養(yǎng)生物，在培養(yǎng)過程中不僅不占用耕地面積，還可利用二氧化碳合成大量的多糖、優(yōu)質蛋白質與多不飽和脂肪酸，為人們提供必要的膳食營養(yǎng)。同時等鞭金藻細胞含有豐富的脂類化合物，可作為石油等化石能源的替代品，從而緩解全球能源枯竭的趨勢。但微藻培養(yǎng)的高成本問題一直制約著整個行業(yè)的發(fā)展。近年來，隨著微藻規(guī)?；⒐I(yè)化培養(yǎng)技術研究的逐漸深入，利用微生物不同的培養(yǎng)方式，尋找最優(yōu)的培養(yǎng)方案用于等鞭金藻工業(yè)化生產(chǎn)逐漸成為研究熱點[1-4]，未來以低成本實現(xiàn)高效的生產(chǎn)應用將成為等鞭金藻等微生物資源可持續(xù)性發(fā)展的根本方向。本文綜述了目前等鞭金藻主要的培養(yǎng)方式及其優(yōu)缺點，并對多種規(guī)?；囵B(yǎng)裝置進行比對分析，總結等鞭金藻在休閑食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物醫(yī)藥、生物質能源等領域的應用研究進展與趨勢，旨在為等鞭金藻低成本、高效率的規(guī)?；a(chǎn)以及多領域應用提供參考。

1 等鞭金藻培養(yǎng)方式

等鞭金藻是一種單細胞藻類[5]，具有兩條等長的鞭毛，藻體通常呈金黃色[6-7]，主要分布在咸淡水和海水[6]。等鞭金藻以二分裂為主要繁殖方式[8]，具有易培養(yǎng)、生長速率快、可適應條件廣等特點，因而培養(yǎng)方式十分多樣。

1.1 自養(yǎng)培養(yǎng)模式

等鞭金藻是一種可以進行光合作用的低等植物。培養(yǎng)等鞭金藻生長的最適條件為光照強度3000～6 000 lx、溫度24～26℃、pH 7～8.5、鹽度23～28[9-13]，此外，不少等鞭金藻相關研究表明，自養(yǎng)培養(yǎng)等鞭金藻常用的培養(yǎng)基有NMB3培養(yǎng)液[14]、改良的f/2培養(yǎng)基[15]等。培養(yǎng)基中氮源、磷源、微量元素等營養(yǎng)成分以及二氧化碳濃度是影響等鞭金藻生長的重要因素。對于氮源，等鞭金藻生長及其脂肪酸的積累與培養(yǎng)基的氮濃度存在很大相關性。正常條件下，培養(yǎng)基中氮源濃度越高，藻細胞密度越大；氮源濃度低，則有利于脂肪酸積累[16]。在缺氮條件下，等鞭金藻生長緩慢，但油脂積累量較高[17]。此外，現(xiàn)有研究指出，光照強度、光照周期、環(huán)境溫度、環(huán)境pH、培養(yǎng)基鹽度也是影響等鞭金藻生長密度與油脂含量的重要因素[18-19]。

1.2 異養(yǎng)培養(yǎng)模式

微藻異養(yǎng)培養(yǎng)是在無光條件下，微藻利用培養(yǎng)基中有機碳源(葡萄糖、甘油等)進行生長的方式[20]。異養(yǎng)培養(yǎng)等鞭金藻可克服自養(yǎng)的不足，如生產(chǎn)周期長、細胞密度低、易被其他藻和菌污染等。姬恒等[21]選取球等鞭金藻3011作為出發(fā)藻株，優(yōu)化得到最適合異養(yǎng)培養(yǎng)球等鞭金藻3011的條件：葡萄糖、尿素和磷酸二氫鉀濃度分別為40.0、0.6、1.0 g/L。經(jīng)過5 d培養(yǎng)，球等鞭金藻細胞密度可達2.3×1010個/mL。

1.3 混合培養(yǎng)模式

微藻混合培養(yǎng)是指在正常光照強度和有機碳源條件下培養(yǎng)微藻細胞的方式。Danesh A等[22]研究不同培養(yǎng)模式下甘油和碳酸鹽對球等鞭金藻生長和脂質合成的影響，結果表明等鞭金藻在有機碳源混合培養(yǎng)條件下(甘油濃度為50 mmol/L)，生物量可達到0.23 g/L，在1 g/L碳酸鹽的培養(yǎng)下，生物量最高可達到0.38 g/L。Alkhamis Y等[23]的實驗結果也表明，50 mmol/L甘油混養(yǎng)下等鞭金藻的生長速率高于光自養(yǎng)組。王星宇等[24]研究不同碳源對球等鞭金藻生長和脂肪酸組成，實驗發(fā)現(xiàn)與其他碳源相比，葡萄糖介導的混養(yǎng)有助于等鞭金藻細胞的生長，并顯著提高藻細胞合成單不飽和脂肪酸。

2 等鞭金藻的規(guī)?；囵B(yǎng)模式

隨著微藻規(guī)模化、工業(yè)化培養(yǎng)技術的不斷發(fā)展，規(guī)?；囵B(yǎng)等鞭金藻的模式有開放式與封閉式兩種。

2.1 開放式培養(yǎng)

開放式培養(yǎng)是利用敞開式的光生物反應器(如人工搭建的池塘或跑道池形式，圖1)培養(yǎng)微藻[25]，其特點是可以高效利用太陽光，降低能耗，但易被外來雜菌或其他藻類污染，環(huán)境因子不易調(diào)控。Yadala S等[26]利用開放式跑道池(池深30 cm，跑道寬度約1 m，長度為300 m)培養(yǎng)等鞭金藻，提出一個動態(tài)化模型來描述微藻在開放式培養(yǎng)下生物量的積累，并優(yōu)化得到微藻種類、地理位置和跑道池幾何形狀的最佳組合，在該組合下，等鞭金藻的單位生物量生產(chǎn)成本最低。

注：Length表示池長(m)；q表示池寬(m)；p表示槽長(m)；CW表示槽寬(m)。箭頭表示水流方向。

2.2 封閉式培養(yǎng)

與開放式培養(yǎng)不同的是，封閉式培養(yǎng)是利用封閉式的光生物反應器培育微藻，具有不易被其他藻菌污染、溫度等環(huán)境因子可控、培養(yǎng)密度高等優(yōu)點[27]。目前，在研究中常見的光生物反應器類型有管式、柱式、平板式等[28]。

2.2.1 管式光生物反應器

管式反應器(圖2)由多條管道構成，可增加表面受光面積，顯著提高光合微藻生長率。張成會[29]在培養(yǎng)湛江等鞭金藻實驗過程中，發(fā)現(xiàn)垂直管式光生物反應器可實現(xiàn)湛江等鞭金藻的放大培養(yǎng)，且等鞭金藻細胞的生長率較高。但管式光生物反應器同樣具有能耗高、培養(yǎng)條件難調(diào)控等缺點。

2.2.2 柱式光生物反應器

常見的柱式光生物反應器包括氣升式和鼓泡式(圖3)。相較于管式光生物反應器，柱式光生物反應器的光照強度、培養(yǎng)基組分等培養(yǎng)條件易控制，但生產(chǎn)成本較高，不利于微藻大規(guī)模生產(chǎn)，而可用于微藻規(guī)?；a(chǎn)初期優(yōu)良藻種的篩選。Liu J等[31]從19種等鞭金藻種篩選出指數(shù)期DHA含量最高的藻種，隨后采用氣升式反應器培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)Isochrysis-galbana#153180可能是最有潛力開發(fā)商業(yè)生產(chǎn)DHA的理想金藻藻種。

2.2.3 平板式光生物反應器

與管式和柱式光生物反應器相比，平板式光生物反應器結構更為簡單，產(chǎn)品造價低，極大提高光通量的同時，實現(xiàn)光合微藻的快速增殖。本課題組利用平板光生物反應器(圖4)培養(yǎng)等鞭金藻，并構建細胞生長、油脂合成和氮源消耗的動力學模型，為封閉式規(guī)?；囵B(yǎng)等鞭金藻開發(fā)高附加值制品提供理論依據(jù)[33]。

3 等鞭金藻的功能性成分

3.1 巖藻黃素

巖藻黃素是一種棕色脂溶性分子[34]，具有清除人體內(nèi)自由基、抗衰老、抵抗癌細胞、降低血糖血脂等生物學功能[35-37]。Xia S等[38]從海洋硅藻中提取、純化巖藻黃素，通過測定抗氧化活性來研究巖藻黃素對DPPH (1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，又稱自由基)和ABTS[2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]的清除能力，結果表明其清除效果顯著。已有研究報道稱，等鞭金藻可合成可再生的巖藻黃素，其含量可達干生物量的 0.20%～2.66%，遠高于其他大型藻類[39]。孫錚等[40]的實驗表明巖藻黃素積累與藻株種類密切相關，大多數(shù)等鞭金藻藻株含有更為豐富的巖藻黃素。

3.2 多不飽和脂肪酸

等鞭金藻可合成對人體健康有益的多不飽和脂肪酸(PUFA)，如DHA、EPA等。等鞭金藻的脂肪酸(FA) 分布特征是多不飽和脂肪酸(PUFA) 的豐度較高，并且在PUFA 中，ω-3PUFA 是最豐富的[41]。多不飽和脂肪酸一直以來都被證實具有多種健康益處，例如它可以大大減少患心血管疾病的概率以及促進胎兒和幼兒視覺和認知功能的發(fā)展。有研究報道，球等鞭金藻可合成的ω-3 PUFA含量約占總脂肪酸含量的40%，其中DHA和EPA分別占ω-3 PUFA的25.0%和8.5%[42]。Fernandes T等[43]通過改變一系列生長條件來影響球等鞭金藻中DHA和EPA的含量，結果表明在生產(chǎn)力方面，等鞭金藻屬的微藻可合成較高含量的EPA和DHA。

4 等鞭金藻生物質應用進展

4.1 食品工業(yè)

微藻作為食物已經(jīng)有好幾千年的歷史，近年來利用微藻生產(chǎn)食物逐漸興起，食品界工作人員利用微藻開發(fā)功能性食品、休閑食品等。改善食品的營養(yǎng)結構，成為微藻研究的熱門領域之一。

4.1.1 功能性酸奶

有研究報道[44]，等鞭金藻可作為功能性成分，添加到酸奶中，改善酸奶中ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸的比值，提高酸奶的營養(yǎng)價值。添加等鞭金藻生物質提取物的酸奶與無添加的在顏色上有明顯差別，但不會影響人們對這種新型酸奶的食欲。

4.1.2 功能性餅干

在加入不同含量的等鞭金藻生物質后的傳統(tǒng)餅干，可以成為一種健康且非常有吸引力的食品。Gouveia I等[45]將等鞭金藻生物質添加到餅干中，不僅可以提高餅干的多不飽和脂肪酸(尤其是EPA與DHA)含量，還可以改善餅干的質構分布、維持其顏色的穩(wěn)定性。此外，等鞭金藻生物質的加入不會對餅干的氣味產(chǎn)生負面影響。

4.1.3 功能性面食

Fradique M等[46]將等鞭金藻生物質加入到意大利面條中，并比較了烹飪前后功能性意大利面條與標準小麥粉意大利面條的DHA與EPA含量，發(fā)現(xiàn)添加有等鞭金藻的意大利面條在烹煮過程中，主要的原有脂肪酸不會降解，反而顯著增加了多不飽和脂肪酸(主要是EPA與DHA)的含量。

4.1.4 嬰幼兒配方奶粉

母乳脂肪是提供嬰幼兒生長發(fā)育所需能量的主要來源。但是由于宗教信仰、疾病等不可預知的原因，導致部分哺乳期的婦女不能正常哺乳嬰兒。為此，現(xiàn)有開發(fā)的嬰兒配方奶粉可替代母乳汁，成為嬰幼兒時期的主要食物來源。然而，嬰兒配方奶粉中油脂主要是來自按一定比例混合的植物油和/或動物油，這與母乳脂肪在脂肪酸組成及其位置分布方面存在較大差異。為解決這個問題，本課題組研究發(fā)現(xiàn)[47]，等鞭金藻三酰甘油酯在脂肪酸組成、位置分布、熔化和結晶性能等方面，都非常接近母乳脂肪，這為將來開發(fā)嬰幼兒配方奶粉制品開辟了一條新的道路。

4.2 醫(yī)療保健

隨著人類的生活水平不斷提高，人類平均壽命大幅度增加，但伴隨而來的癌癥[48]、心腦血管疾病等老年病發(fā)病率也在逐年增加；這些疾病的死亡率占比極高，嚴重影響人們的生活質量[49-50]。治療相關疾病的藥物需求在逐漸增加，開發(fā)用于治療慢性疾病的功能性藥物熱度也在逐漸增加。

等鞭金藻細胞內(nèi)含有類胡蘿卜素、硫酸酯多糖等生物活性物質[51-52]，其可合成IPSⅠ、IEPSA等硫酸酯多糖，這類多糖具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的活性[51]。除此之外，Jose R A等[53]成功地提取出等鞭金藻產(chǎn)生的可降解生物聚合物，這些生物聚合物可以用于定向傳輸藥物到人體的相關組織，為等鞭金藻在靶向藥物運輸、疾病診斷等方面的應用提供了新的思路。

4.3 水產(chǎn)養(yǎng)殖

與其他微藻相比，等鞭金藻生物量產(chǎn)率高，培養(yǎng)占地面積小，總脂肪、蛋白質等營養(yǎng)物質豐富，藻細胞無細胞壁結構，易被海洋動物吸收，常作為貝類的開口飼料，提高貝類的存活率與產(chǎn)量[54]。在鄧正華等[55]的研究中，發(fā)現(xiàn)與其他微藻相比，不同品系的等鞭金藻易被珠母貝幼蟲攝食與消化，此外，多種微藻混合搭配方式更有利于珠母貝幼蟲的生長。在南日鮑的養(yǎng)殖過程中[56]，將等鞭金藻作為飼料接種到鮑養(yǎng)殖水中，可提高鮑的生長率，同時達到凈化養(yǎng)殖水質的效果。此外，等鞭金藻還可以用于青鉗[57]、對蝦[58-59]、金鯧[60]等水生生物養(yǎng)殖，以提高水產(chǎn)品的存活率與產(chǎn)量。

4.4 生物能源

近年來隨著化石能源的大量開采，全球可能面臨著嚴重的能源短缺問題，因此尋找替代化石能源的可再生能源變得尤為迫切?？茖W家也逐漸將注意力放在可持續(xù)的生物能源上。等鞭金藻細胞被認為是光驅動的油脂生產(chǎn)工廠，其能夠將空氣中的二氧化碳轉化為脂類化合物，這些脂類化合物可以成為傳統(tǒng)柴油等能源的替代品[61]。Atmanli A[62]比較了二形柵藻和等鞭金藻的產(chǎn)油特性，發(fā)現(xiàn)等鞭金藻的油酸和棕櫚油酸含量顯著高于二形柵藻，此外等鞭金藻所生產(chǎn)的油脂十六烷值與普通柴油相當，這意味著等鞭金藻可作為生物柴油生產(chǎn)的潛在藻種。Lin C Y等[53]比較了等鞭金藻和廢棄食用油的脂肪酸組成和典型燃料特性，發(fā)現(xiàn)等鞭金藻油脂的燃料性能更優(yōu)，更適合用于生產(chǎn)生物柴油。Sanchez A等[64]利用中型培養(yǎng)池培養(yǎng)等鞭金藻，將得到的生物質經(jīng)萃取獲得油脂，最后經(jīng)過催化反應獲得較為優(yōu)質的生物柴油。但是近年來利用微藻生物質生產(chǎn)柴油一直飽受爭議[65]，生物質能的生產(chǎn)成本問題一直是該行業(yè)發(fā)展的瓶頸，生物柴油的可持續(xù)性發(fā)展需要進一步研究如何降低生產(chǎn)成本。

5 總結與展望

目前，等鞭金藻主要培養(yǎng)模式為光自養(yǎng)培養(yǎng)，在該模式下，等鞭金藻培養(yǎng)周期長、生物質積累慢，導致生產(chǎn)成本較高，而異養(yǎng)與混養(yǎng)模式可以極大地縮短微藻的生長周期，提高其生物量與生物活性成分的產(chǎn)量，從而滿足大量生產(chǎn)的需求，未來以混養(yǎng)與異養(yǎng)為基礎，低成本規(guī)?；嘏囵B(yǎng)等鞭金藻將會成為重要的研究方向。等鞭金藻生物質含有巖藻黃素、多不飽和脂肪酸等多種有益成分，可作為功能性食品、醫(yī)療保健與水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要原料。此外，等鞭金藻具有高效的固碳能力與油脂生產(chǎn)力，將促進其在生物固碳與生物能源等領域的應用與發(fā)展。