液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中 恩諾沙星殘留量的不確定度評估

李 苗，代 菲，紀麗君，丁洪流

（蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇蘇州 215104）

本實驗依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL06：2006）[2]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[1]，參照農(nóng)業(yè)部1077號公告—1—2008 水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]，對LC-MS/MS外標法測定魚肉中恩諾沙星殘留量的不確定進行分析，為實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持，保障實驗數(shù)據(jù)準確性、可靠性。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材

標準品：恩諾沙星（美國A Chemtek公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色譜純，美國Merck公司）；無水硫酸鈉（650 ℃灼燒4 h，冷卻后貯存于密閉容器中備用，分析純，國藥集團試劑有限公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水一級水。

1.2 儀器設(shè)備

ACQUITY UPLC/TQ-XS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，美國Waters公司；離心機，艾本德；Multi Reax渦旋 儀，德國海道爾夫公司；超聲波清洗儀，德國Elma； 多通道旋蒸儀，德國IKA。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

稱取5 g試樣于50 mL離心管內(nèi)，加入10 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，再加入于20 mL酸化乙腈，渦旋混合，超聲提取10 min。以4 000 r/min離心 5 min，取上清液于梨形瓶中。殘渣中再加入20 mL酸化乙腈溶液，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，提取液于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)至干。加10.0 mL甲醇溶解殘留物，再加入2 mL正己烷渦旋混合30 s，轉(zhuǎn)入離心管中，以4 000 r/min離心5 min，棄上層液，取下清液，過0.22 μm濾膜，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2 不確定度來源分析

通過對測量過程的分析，并結(jié)合計算公式，可以歸納出以下幾個不確定度來源[5]。①測量重復(fù)性引起的不確定度（A類）。②樣品前處理引起的不確定度（B類）（天平引起的不確定度與1.0 mL移液管引起的不確定度）。③標準曲線溶液配制帶入的不確定度（B類）。④工作曲線擬合引起的不確定度（B類）。⑤儀器引起的不確定度（B類）。

1.3.3 數(shù)學(xué)模型建立

數(shù)學(xué)模型建立如下：

式中：X樣為試樣中恩諾沙星的含量，μg/kg；m樣為魚肉的質(zhì)量，g；C樣為樣液中恩諾沙星的濃度，ng/mL；CBlank為空白中恩諾沙星的濃度，ng/mL；V為樣液最終的定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量重復(fù)性引起的相對標準不確定度urel(d )（A類）

按農(nóng)業(yè)部1077號公告—1—2008方法對同一樣品平行測定6次，結(jié)果見表1。由重復(fù)性測定結(jié)果可得測量標準偏差S，并計算重復(fù)性相對標準不確定度urel(d)為：

表1 重復(fù)性測定結(jié)果

式中：xi為第i次測量的測定值，μg/kg；n為測量次數(shù)；x—為n次測量所得的算術(shù)平均值，μg/kg。

2.2 樣品前處理引起的相對標準不確定度urel(r)（B類）

2.2.1 天平引起的相對標準不確定度urel(r1)

稱取5 g試樣，天平的準確度a為0.01 g，采用矩形分布計算天平的不確定度和相對標準不確定度為：

2.2.2 1.0 mL移液管引起的相對標準不確定度urel(r2)樣品前處理過程加入1.0 mL流動相溶解殘留物，1.0 mL移液管準確度a為±0.007 mL，見表2，采用矩形分布計算1.0 mL移液管的不確定度和相對標準不確定度為：

2.3 標準曲線溶液配制帶入的相對標準不確定度urel(s)（B類）

2.3.1 標準溶液準確度引起的相對標準不確定度urel(s1)

本實驗采用的恩諾沙星標準溶液由BePure公司提供，濃度為100.2 μg/mL，已知標準物質(zhì)證書給出的恩諾沙星的不確定度a為±3%（k=2），恩諾沙星標準溶液的相對標準不確定度為：

2.3.2 稀釋體積帶入的相對標準不確定度urel(s2)

據(jù)《常用玻璃量器計量檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[4]A級玻璃量器的允差（表2），按均勻分布。各移液管和容量瓶的標準不確定度見表2。

表2 實驗室A級單標線玻璃量器的分度值與容量允差

其中，1 mL移液管移取1.0 mL 100.2 μg/mL標準溶液于100 mL容量瓶中，甲醇定容得到濃度為 1 μg/mL的標準溶液，將1 μg/mL的標準溶液進行逐級稀釋，配制成濃度點為1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、40 ng/mL和50 ng/mL的標準系列，分別計算移液管和容量瓶的相對不確定值，見表3。

表3 不同標準濃度的不確定值

則稀釋體積帶入的相對標準不確定度為：

將以上標準曲線溶液配制過程中各相對標準不確定度，按照下列公式進行合成，則標準曲線溶液配制帶入的相對不確定度為：

2.4 工作曲線擬合引起的相對標準不確定度urel(p)（B類）

配制6個濃度的標準溶液，用LC-MS/MS重復(fù)測定3次，得到各濃度的色譜峰面積，用最小二乘法對恩諾沙星濃度-峰面積進行擬合，得到標準工作曲線為y=ax+b（y為峰面積，x為濃度）和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表4。

根據(jù)表4中標準工作曲線y=91 996.2x+18 727.1，進行數(shù)據(jù)分析，各濃度點峰面積計算結(jié)果見表5。

表4 線性關(guān)系測定結(jié)果

由表5可知，標準系列溶液濃度的平均值x—= 21.83 ng/mL，由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為：

表5 峰面積計算結(jié)果表

2.5 LC-MS/MS儀器引起的相對標準不確定度urel(X)（B類）

經(jīng)檢定，LC-MS/MS儀器的不確定度為0.02，k=2，由LC-MS/MS儀器引入的相對標準不確定度

3 合成標準不確定度的評定

各相對標準不確定度見表6。

表6 各相對標準不確定度結(jié)果表

由表6可知，魚肉中恩諾沙星檢測結(jié)果的合成標準不確定度ucrel為：

4 擴展不確定度的評定與結(jié)果

根據(jù)CNAS—GL06：2006[2]，取k=2，被測量值大約95%含于此區(qū)間，則相對擴展不確定度為U=ucrel×k=0.051 90×2=0.104。本次實驗測得樣品中恩諾沙星的最佳估值為X=60.8 μg/kg，則其擴展不確定度為U=60.8 μg/kg×0.104≈6.32 μg/kg。

5 結(jié)論

在LC-MS/MS測定魚肉中恩諾沙星殘留量時，應(yīng)調(diào)整標準曲線的權(quán)重，降低工作曲線擬合引起的不確定度，提高檢驗人員的操作水平，定期對儀器進行校準，測試平行樣，嚴控前處理各環(huán)節(jié)，減少引入的不確定度，提高檢測結(jié)果的準確性。