基于蛋白互作和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究白花敗醬草治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

李曉晨，王帥，2，3，李天嬌，2，3，趙琳*，包永睿，2，3*，孟憲生，2，3（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)創(chuàng)新技術(shù)中心，遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 6600）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的反復(fù)發(fā)作的慢性疾病，常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便秘、便血以及炎癥等。目前廣泛認(rèn)為腸黏膜損傷是引發(fā)UC的主要原因之一。近年來，UC發(fā)病率逐年攀升，其治療藥物主要包括美沙拉秦、鹽酸小檗堿、柳氮磺胺吡啶、氨基水楊酸、糖皮質(zhì)類激素等。臨床治療中發(fā)現(xiàn)長時(shí)間使用上述藥物常會(huì)伴隨著多種不良反應(yīng)的發(fā)生，且停藥后復(fù)發(fā)率較高，給患者帶來極大的困擾[1-6]。

近年來，大量研究顯示中醫(yī)藥在臨床治療中療效好、毒性低[7]。因此，從中醫(yī)藥角度出發(fā)尋找治療UC新藥是一種可行的方法。UC的中醫(yī)病名為“休息痢”，目前認(rèn)為脾氣虛弱為其基本病機(jī)，濕熱之邪是其主要致病因素，瘀血阻滯是久病不愈的重要原因。白花敗醬草[Patrinia villosa（Thunb.）Juss.]系敗醬科植物，藥用其全草，味辛，性寒，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被《本草綱目》中記載為治腸癰之要藥，主要含有黃酮類、酚酸類以及皂苷類化合物，具有清熱解毒，利濕排膿，活血化瘀，鎮(zhèn)心安神的功效，臨床上常用于治療闌尾炎，癰腫瘡毒，腸炎，UC，慢性胃炎，腫瘤等[8-9]。已有文獻(xiàn)表明，敗醬草在臨床使用、體外實(shí)驗(yàn)等都具有顯著的療效，毒副作用及復(fù)發(fā)率均相對(duì)較低[5-6，10-11]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，構(gòu)建“潛在活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)對(duì)白花敗醬草治療UC靶點(diǎn)進(jìn)行全面預(yù)測并探討其作用機(jī)制；并在此基礎(chǔ)上，利用自由飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）建立的UC小鼠模型對(duì)其中篩選出的重要途徑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，深入探討白花敗醬草治療UC的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）[12]，有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem），蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）[13]，GeneCard數(shù)據(jù)庫，OMIM數(shù)據(jù)庫，Drugbank數(shù)據(jù)庫，String數(shù)據(jù)庫[14]，DAVID數(shù)據(jù)庫。

1.2 試藥

白花敗醬飲片[經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為白花敗醬Patrinia villosa（Thunb.）Juss.的干燥全草]；質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈（德國Merck KGaA公司）；質(zhì)譜級(jí)甲酸（美國Thermo公司，批號(hào)：141831A）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；美沙拉秦緩釋顆粒（上海愛的發(fā)制藥有限公司）；葡聚糖硫酸鈉鹽（Meilunbio公司，批號(hào)：S0925A）；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海科興有限公司，批號(hào)：21071230N）；IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上?？婆d有限公司，批號(hào)：21071233N）；Kodak X膠片（美國柯達(dá)公司）；RIPA裂解液（ambion生物科技有限公司）；PMSF蛋白酶抑制劑、6×protein loading buffer（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（Glycine）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海索萊寶生物科技有限公司）；SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒、飛克特超敏ECL發(fā)光液（大連美侖生物科技有限公司）；雙色預(yù)染蛋白Marker（Proteintech，Cat：PL00001）；兔 抗AKT多 克隆抗體（Proteintech，Cat：10176-2-Ap）；兔抗PI3 Kinase p85（Signaling，Cat：#4292）；兔 抗Beat Actin多克隆抗體（Proteintech，Cat：20536-1-Ap）；HRP-conjugated Affinipuer Goat anti-Rabbit IgG（H＋L）（Proteintech，Cat：SA00001-2）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g [遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（遼）2020-0001]。

1.4 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（美國SENCO公司）；Sartorius CP225D電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；CV200吉艾姆真空離心濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）；組織脫水機(jī)（日本櫻花：VIP6 AI）；BM450A包埋機(jī)、凍臺(tái)（派斯杰）；PH60病理切片機(jī)（Lecia）；PH60組織漂烘儀（派斯杰）；GHP-9160烤箱（上海恒一）；YA0170載玻片（Solarbio）；3DHISTECH P250 FLASH全景掃描儀（3DHISTECH）；CM1900冰凍切片機(jī)（Lecia）；酶標(biāo)儀（美國Molecular Drvices公司）；通用電泳儀（美國BD公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 藥物與疾病交集靶點(diǎn)預(yù)測 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺(tái)與白花敗醬草相關(guān)文獻(xiàn)[15]，以口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18為條件，篩選出活性較高的成分共12種，檢索并分析其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息；利用UniProt數(shù)據(jù)庫，規(guī)范相應(yīng)蛋白靶點(diǎn)，得到169個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，建立藥效成分潛在作用靶點(diǎn)庫，并構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。應(yīng)用GeneCards、OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫搜索UC的作用靶點(diǎn)，獲取相關(guān)基因1234個(gè)，構(gòu)建疾病靶標(biāo)庫；將所得靶點(diǎn)信息取交集，獲得藥物與疾病的交集靶點(diǎn)98個(gè)。

圖1 白花敗醬草治療UC的“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 ”Active component-target” network diagram of Patrinia villosa Juss.in treating ulcerative colitis

2.1.2 交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和富集分析 將藥材、疾病交集靶點(diǎn)輸入蛋白交互作用網(wǎng)站String，生物種類選擇“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)置“medium confidence”（＞0.4），其他參數(shù)選擇默認(rèn)值，即可得到PPI網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果進(jìn)一步美化，得到交集蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖[16]，其中蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）的degree值為82，在所有靶點(diǎn)中排列第一，表明其在整個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位。網(wǎng)絡(luò)圖包含98個(gè)節(jié)點(diǎn)，2028條相互作用，見圖2；以節(jié)點(diǎn)大小和顏色用于反映degree值的大小，選取degree值排列前20的靶點(diǎn)繪制棒棒糖圖，探究潛在靶基因功能，見圖3；利用String和DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)潛在基因進(jìn)行功能、通路富集分析，見圖4～6，結(jié)果中除人類癌癥相關(guān)通路外，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲氨酸激酶（AKT）信號(hào)通路排列第一，可能是白花敗醬草治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)及關(guān)鍵通路。已證實(shí)AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，主要負(fù)責(zé)由PI3K始動(dòng)的生物信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，位點(diǎn)被磷酸化后，結(jié)合在細(xì)胞膜上的AKT被完全激活，其首要的功能就是激活NF-κB，并誘導(dǎo)其釋放大量的炎性因子如IL-6和TNF-α等[17]。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Protein-protein interaction network

圖3 度值排名前20的相關(guān)靶點(diǎn)Fig 3 Top 20 related targets in degree value

圖4 BP、CC、MF三方面功能富集分析圖Fig 4 Functional enrichment analysis of BP，CC，and MF

2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 白花敗醬草藥液制備 精密稱取白花敗醬藥材粗粉約100.0 g，精密加入10倍量的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至0.1 g·mL-1生藥濃度的浸膏溶液[18]，過濾除菌分裝，4℃保存?zhèn)溆?。根?jù)人體每日推薦劑量15.0 g/70.0 kg計(jì)算，設(shè)置白花敗醬草給藥組進(jìn)行小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)，每日0.039 g/20.0 g。

圖5 通路富集分析圖Fig 5 Enrichment analysis diagram of pathway

圖6 活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 6 Network of active ingredient-target-KEGG pathway

2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方式 32只C57BL/6雌性小鼠喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組、白花敗醬草給藥組，每組8只?？瞻捉M每日自由飲用自來水，其余組小鼠自由飲用3.5% DSS溶液7 d，建立UC小鼠模型，一周后飲用自來水。造模成功后，白花敗醬草給藥組灌胃白花敗醬草提取液，陽性對(duì)照組小鼠按美沙拉秦緩釋顆粒臨床用量給予灌胃，空白組、模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃10 d。

2.2.3 疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)價(jià)及各組小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠體質(zhì)量、大便性狀和便血情況，按照三項(xiàng)得分進(jìn)行DAI評(píng)分，DAI＝（體質(zhì)量得分＋大便性狀得分＋便血得分）/3，詳細(xì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[19]。采用DSS溶液誘導(dǎo)的UC小鼠模型與人類UC最為相似[20]。根據(jù)觀察小鼠的體質(zhì)量、大便性狀，隱血、便血情況及組織學(xué)形態(tài)，符合炎癥的組織病理改變，提示造模成功。與空白組小鼠相比，模型組能夠引起UC小鼠的體質(zhì)量減輕及總DAI指數(shù)顯著升高（P＜0.01），經(jīng)給藥組干預(yù)后，給藥組小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)上升趨勢、總DAI 指數(shù)呈現(xiàn)顯著的下降趨勢（P＜0.01）。表明白花敗醬草與陽性藥物有相同作用，能有效改善UC小鼠體質(zhì)量減輕、緩解UC小鼠的癥狀（P＜0.01，見圖7）。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) Tab 1 DAI scoring criteria

圖7 各組小鼠DAI評(píng)分結(jié)果Fig 7 DAI score of mice in each group

2.2.4 樣本采集及病理學(xué)結(jié)果 最后一次灌胃24 h后，禁食，小鼠摘眼球取血，室溫下靜置30 min后，3000 r·min-1離心10 min，取上清液分裝，-80℃保存待測。取小鼠結(jié)腸組織，用生理鹽水清洗后濾紙吸干，各組小鼠取部分結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行石蠟包埋，切片脫蠟，用蘇木精和伊紅染色，脫水封片，觀察結(jié)腸組織形態(tài)。其余各組小鼠結(jié)腸組織液氮速凍，-80℃保存，備用。與空白組相比，模型組小鼠出現(xiàn)結(jié)腸黏膜炎癥，個(gè)別部位黏膜上皮明顯變薄，大量炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組相比，白花敗醬草給藥組小鼠及陽性藥物組小鼠結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)基本完整，炎性浸潤較模型組小鼠明顯減輕，上皮細(xì)胞排列較為緊密，提示白花敗醬草與陽性藥物具有相同治療作用，結(jié)果見圖8。

圖8 不同組組織病理學(xué)結(jié)果圖（×200）Fig 8 Histopathdogy of different groups（×200）

2.2.5 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平 每組小鼠隨機(jī)抽取3只樣本，取部分結(jié)腸組織，加入含有PMSF的RIPA裂解液，冰上研磨至無明顯顆粒狀，離心后吸取蛋白溶液，充分變性，置-20℃保存，備用。嚴(yán)格按照抗體說明書操作，檢測小鼠結(jié)腸組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平，并用Image J軟件進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，白花敗醬草給藥組與陽性藥給藥組小鼠結(jié)腸組織PI3K、AKT蛋白水平均下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果見圖9。

圖9 各組小鼠結(jié)腸組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)Fig 9 PI3K and AKT protein expression in colon tissues of mice in each group

2.2.6 ELISA法檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6含量 將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和每組隨機(jī)抽取的3只待測小鼠血清樣品依次加入ELISA酶標(biāo)板中，每孔100 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD值）。根據(jù)所測標(biāo)準(zhǔn)品OD值與濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的水平。結(jié)果表明與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，白花敗醬草給藥組與陽性藥物組TNF-α和IL-6水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥等過程中具有調(diào)節(jié)作用，在UC的發(fā)生和發(fā)展過程中，其表達(dá)水平與UC嚴(yán)重程度成正相關(guān)[21-22]；TNF-α，可促進(jìn)活化血小板因子釋放，產(chǎn)生氧自由基等，對(duì)腸黏膜造成傷害[23]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，IL-6、TNF-α的水平與UC病情具有較大的相關(guān)性[24]。基于以上結(jié)果，推測白花敗醬草可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制促炎因子IL-6、TNF-α的釋放，達(dá)到治療UC的目的。結(jié)果見表2。

表2 不同組ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab 2 ELISA for different groups

3 討論與結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法研究白花敗醬草治療UC的活性成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，并在此基礎(chǔ)上利用UC小鼠模型，對(duì)其中篩選出的關(guān)鍵通路PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證，初步解析白花敗醬草治療UC的作用機(jī)制。

通過對(duì)白花敗醬草中潛在活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，關(guān)鍵化學(xué)成分主要為槲皮素、山柰酚、木犀草素、異牡荊素、青風(fēng)藤堿、谷甾醇等。相關(guān)文獻(xiàn)表明，槲皮素能提高組織PI3K、AKT表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖能力，從而起到抗炎的作用[25-26]；山柰酚通過下調(diào)PI3K、AKT的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27]；木犀草素、異牡荊素主要通過降低炎癥轉(zhuǎn)錄因子活性，抑制促炎因子TNF-α、IL-6的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用[28-30]；青風(fēng)藤堿則可以減少促炎因子TNF-α、IL-6的釋放[31]；谷甾醇可抑制巨噬細(xì)胞IL-6活性，減少TNF-α等炎性因子的分泌[32-34]。提示白花敗醬草通過多成分、多靶點(diǎn)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，發(fā)揮治療UC的作用。

綜上，通過對(duì)白花敗醬草網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析及其干預(yù)UC模型小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，明確白花敗醬草治療UC的藥理藥效及作用機(jī)制，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。