燕麥β-葡聚糖-槲皮素復(fù)合物的制備及其對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

趙嬌嬌 司茜媛 張琨霖 劉歡歡 郭慶彬 王昌祿 梁宏和 蔣愛民 李貞景

(1.天津科技大學 食品科學與工程學院, 天津 300457；2.天津科技大學 食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室, 天津 300457；3.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所, 廣西 南寧 530001；4.桂林原心達生物科技有限公司, 廣西 桂林 541000)

燕麥β-葡聚糖(oats β- glucan,OG)是一種葡萄糖的同聚物,具有抗氧化、降膽固醇、降血脂、抗病毒等多種生物活性[1-3]。 近年來,有關(guān)OG 延緩衰老的研究逐漸引起人們的關(guān)注。 研究表明,OG 可通過抑制脂質(zhì)過氧化、提高機體的抗氧化能力達到延緩衰老的作用[4]。 此外,OG 因具有較簡單的糖單元結(jié)構(gòu),呈線性并具有親水基團,因此易與多酚交聯(lián)從而加強其抗氧化活性[5-6]。

槲皮素(quercetin,QE)是最豐富的黃酮類化合物之一,作為天然抗氧化劑在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)有廣泛的用途[7]。 研究表明,QE 具有促進細胞自我更新和分化的特性,可減輕人骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老[8],被認為是一種抗早衰的藥物。 盡管大量文獻報道QE 抗氧化活性顯著,但因溶解度低、提取過程中易流失,從而導(dǎo)致其生物利用度較低,因此在臨床應(yīng)用上受到限制。

天然糖酚復(fù)合物存在于多種植物中,目前已有從小球藻、馬尾藻、紫菜、冷杉藻、迷迭香、百里香和馬鞭草等植物中提取出高抗氧化活性糖酚物質(zhì)的報道[9-11]。 在糖酚的制備方面,殼聚糖和原花青素可通過自由基誘導(dǎo)制備出穩(wěn)定性高、抗氧化活性好的糖酚復(fù)合物[12]；在應(yīng)用方面,利用漿果多酚-黑木耳多糖復(fù)合物開發(fā)出的復(fù)合果汁飲料具有良好的抗氧化功能[13]。

此外,糖、酚作為人類食物的主要成分之一,在腸胃的消化過程中,兩者極易形成復(fù)合物,但有關(guān)糖酚復(fù)合物的研究相對較少,導(dǎo)致對糖酚復(fù)合物的形成機制、消化特性和生物活性知之甚少。 多酚在胃的酸性環(huán)境中是穩(wěn)定的,但在小腸的中性和弱堿性環(huán)境下會被降解。 多糖可包裹多酚,有效保護多酚在堿性條件下不被降解,并在腸液中緩慢而持久地釋放。 研究表明,糖酚交聯(lián)為復(fù)合物后,可減少多酚在腸道環(huán)境中的降解,提高多酚在小腸中的滲透,甚至增加多酚在血液中的含量[14]。 因此,亟需加強糖酚復(fù)合物的有關(guān)基礎(chǔ)研究。

秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans(C. elegans)結(jié)構(gòu)簡單、培養(yǎng)方便,是進行抗氧化、抗衰老研究最理想的模式生物之一。 目前尚未見到有利用秀麗隱桿線蟲研究糖酚互作的報道。

本研究以O(shè)G 和QE 為原料,通過自由基催化、氫鍵吸附的方法分別制備燕麥β-葡聚糖-槲皮素共價復(fù)合物(COGQ)與非共價復(fù)合物(NOGQ),研究其結(jié)構(gòu)性質(zhì)及對秀麗隱桿線蟲壽命的影響,以期為糖酚復(fù)合物的制備及新型食品抗氧化劑的開發(fā)提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥 β-葡 聚 糖(AR 80%), 分 子 質(zhì) 量 為350 kDa,購于山東佰興生物科技有限公司,經(jīng)實驗室醇沉純化至AR 92%；槲皮素(AR 98%),購于上海生工生物有限公司；N2 野生型秀麗隱桿線蟲與OP50 型大腸桿菌,天津科技大學保藏；無水乙醇、苯酚、透析袋、H2SO4、NaNO3、CH3OH、二甲基亞砜、NaCl、MgSO4、CaCl2,天津江天化工技術(shù)股份有限公司；膽固醇、抗壞血酸、蛋白胨,生工生物工程(上海)股份有限公司；5-氟尿嘧啶(5-FU),阿拉丁試劑(上海)有限公司。 實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PIVC 2-25 plus 型真空濃縮儀,德國Christ 公司；ITC 200 型等溫滴定量熱儀、IS 50 型傅里葉紅外光譜儀,日本尼高利公司；Infinite 200 PRO 型酶標儀,瑞士TECAN 公司；Bruker Avance NEO 型核磁共振波譜儀,布魯克(北京)科技有限公司；Q 50 型熱重分析儀,美國TA 儀器公司；SU 1510 型掃描電子顯微鏡,天美(中國)科學儀器有限公司；HN-150Y 型超聲波破碎細胞儀,濟南童鑫生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 OG 的純化與總糖含量測定

取1.0 g OG 溶于10.0 mL 蒸餾水,濃縮至1.0 mL,緩慢加入1.5 mL 無水乙醇,4 ℃冷藏24 h,6000 r/min離心,收集上清液,旋蒸回收乙醇,凍干后4 ℃保存。 按苯酚-硫酸法[15]測定OG 總糖含量。

1.3.2 NOGQ 的制備

OG 可通過氫鍵、疏水作用、范德華力等與QE結(jié)合,形成具有特異性強、可逆的NOGQ。 QE 酚羥基上的氫和葡聚糖醚鍵上的氧原子之間形成氫鍵,苯環(huán)作為交聯(lián)葡聚糖凝膠羥基的電子供體[16],使OG 形成包封QE 的結(jié)構(gòu)從而形成NOGQ。

配制25 mg/mL OG 溶液,60 ℃磁力攪拌4 h 后,置于超聲破碎細胞儀(18 kHz,600 W,每循環(huán)處理3 s,間歇2 s,共20 個循環(huán))降分子質(zhì)量。 利用DMSO助溶配制0.5 mg/mL QE 溶液。 將配好的OG 與QE 溶液置于超濾管,6000 r/min,20 ℃離心10 min,內(nèi)管中沉淀即為NOGQ,凍干后,4 ℃保藏備用。

1.3.3 COGQ 的制備

OG 可通過自由基誘導(dǎo)、酶促和碳二亞胺交聯(lián)等方法與QE 發(fā)生共價相互作用[17]。 QE 通過氧化作用生成醌,進而與OG 分子間發(fā)生希夫堿反應(yīng)或邁克爾加成反應(yīng)[18],最終生成COGQ。

稱取1.0 g OG 溶于100.0 mL 超純水,加入4.0 mL 25 μg/mL 抗壞血酸溶液,磁力攪拌30 min,加入物質(zhì)的量比為0.1∶1.0 的QE(nQE∶nOG=1.0∶0.1),磁力攪拌24 h,8000 r/min離心10 min,保留沉淀,蒸餾水透析72 h,去除多余的QE,得到COGQ,凍干后,4 ℃保藏備用。

1.3.4 復(fù)合物相對分子質(zhì)量的測定

采用高效排阻色譜(high performance size exclusion chromatography,HPSEC) 法測 定OG、NOGQ、COGQ 的相對分子質(zhì)量,條件為:流動相為0.15 mol/L NaNO3溶液,流速為0.6 mL/min,檢測溫度為40 ℃,并根據(jù)標準曲線計算出相對分子質(zhì)量[19]。

1.3.5 復(fù)合物特殊官能團的分析

準確稱量樣品1.0 mg 和干燥的150.0 mg KBr,均勻混合后充分研磨,使用壓片機在30 MPa 下保持30 s,得到透明狀薄片后,進行背景掃描去除干擾,在400 ～4000 cm-1進行32 次掃描得到紅外光譜圖[20]。

1.3.6 復(fù)合物糖苷鍵的分析

準確稱量樣品40.0 mg 溶于1 mL 重水(D2O),反復(fù)凍融3 次溶解于核磁管,利用500 MHz 核磁共振波譜儀,在25 ℃記錄1H-NMR[21]。

1.3.7 復(fù)合物結(jié)合比的測定

配制OG 溶液1 mg/mL,QE 溶液10 mg/mL,使用等溫滴定量熱儀測定熱量變化曲線[22]。

1.3.8 復(fù)合物熱降解特性的分析

準確稱量樣品5.0 mg,置于氧化鋁樣品盤,氮氣作為載氣,30 mL/min,25 ～600 ℃,10 ℃/min,根據(jù)時間和溫度的函數(shù),跟蹤加熱后剩余固體的質(zhì)量,得到失重曲線[23]。

1.3.9 樣品微觀結(jié)構(gòu)的觀察

取少量樣品均勻分散于粘有導(dǎo)電雙面膠的樣品臺上,洗耳球吹走多余樣品后,放入離子濺射鍍膜儀中,在真空環(huán)境中做噴金處理后,放入樣品室觀察不同放大倍數(shù)下樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.10 線蟲壽命實驗

用N2 野生型秀麗隱桿線蟲研究壽命,以尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(E. coliOP50)作為線蟲食物,培養(yǎng)于線蟲生長培養(yǎng)基(nematode growth medium,NGM)上。 將同期化至L4 期線蟲挑至含有OP50 的NGM 上(含12.5 mg/L 5-FU),隨機分為4 組,分別為OG 組、QE 組、COGQ 組、NOGQ 組,每組3 板,每板40 條。 每日將活線蟲轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基,記錄壽命,直到線蟲全部死亡。 若挑針觸動線蟲無反應(yīng),則認為死亡,若線蟲爬到培養(yǎng)皿壁干死,則從總數(shù)中剔除。 實驗重復(fù)3 次并做壽命曲線。

1.3.11 線蟲氧化應(yīng)激實驗

將同期化至L4 期線蟲挑至含有質(zhì)量分數(shù)為0.1%過氧化氫的NGM 平板,每隔0.5 h 統(tǒng)計一次壽命,直到線蟲全部死亡。 其他條件同壽命實驗。

1.3.12 線蟲抗氧化酶活性的測定

收集同期化至L4 期的線蟲,培養(yǎng)方法同壽命實驗,5 d 后用PBS 沖洗線蟲至EP 管,每管約2000 條,反復(fù)洗滌3 次后,再次加入200 μL PBS,于冰上勻漿,離心后取上清液。 根據(jù)試劑盒方法測定超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性,實驗重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理,采用SPSS 26軟件做差異顯著性分析。 所有實驗均重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值±標準差表示,采用Origin 2019 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 COGQ、NOGQ 的結(jié)構(gòu)與理化特性分析

2.1.1 共價、非共價交聯(lián)對復(fù)合物相對分子質(zhì)量分布的影響

按照1.3.4 方法測定復(fù)合物相對分子質(zhì)量分布情況。 以葡聚糖相對分子質(zhì)量1 萬、4 萬、7 萬、50 萬Da 作為標準品,得到葡萄糖標準曲線回歸方程y= -0.4616x+11.522,R2=0.979。 以保留時間為橫坐標,信號值為縱坐標,得到復(fù)合物的高效排阻色譜,見圖1。 由圖1 可知,OG 組、NOGQ 組、COGQ 組的保留時間分別為17.264、 17.282、17.394 min,計算出相對分子質(zhì)量分別為355、354、349 kDa。 復(fù)合物形成后,其表面的羥基與水形成剛性結(jié)構(gòu),內(nèi)部只是形成疏水空腔或間隙[24],并未改變其他結(jié)構(gòu),因而其相對分子質(zhì)量變化不大。

圖1 復(fù)合物的高效排阻色譜Fig.1 HPSEC of composites

2.1.2 共價、非共價交聯(lián)對復(fù)合物特殊官能團的影響

利用紅外光譜技術(shù),將已知官能團出現(xiàn)的吸收峰與未知化合物的吸收峰作比較。 復(fù)合物的紅外光譜(FI-IR)分析結(jié)果見圖2。 由圖2 可知,OG 和QE的FT-IR 譜圖有典型特征峰,這些峰在COGQ 和NOGQ 的光譜中也存在。 OG 中1660 cm-1處的吸收峰為 ==C O 的伸縮振動,在1243 cm-1處的吸收峰為C—O—C 的伸縮振動。 QE 中1562 cm-1處的吸收峰為苯環(huán)骨架的 ==C C 伸縮振動。 COGQ 與NOGQ 在1660 cm-1處具有屬于OG 的 ==C O 的伸縮振動,在1243 cm-1處具有屬于OG 的C—O—C的伸縮振動,在1562 cm-1處具有屬于QE 的苯環(huán)骨架的 ==C C 伸縮振動。 另外,NOGQ 與COGQ 相比,在3000 cm-1處具有不飽和C—H 伸縮振動。 QE 在1000 ～1700 cm-1處存在強烈的吸收峰,而OG、COGQ、NOGQ 沒有明顯的峰,表明這3 種物質(zhì)此時是無定型狀態(tài)。 復(fù)合物中具有屬于OG 的羰基和醚鍵,也具有屬于QE 的苯環(huán)骨架,且QE 中強烈的吸收峰在COGQ、NOGQ 包封QE 后信號減弱,可能由于部分相關(guān)基團消失,表明OG 與QE 存在化學鍵交聯(lián)。

圖2 復(fù)合物的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectra of composites

2.1.3 共價、非共價交聯(lián)對復(fù)合物糖苷鍵的影響

1H-NMR 可識別多糖結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵構(gòu)型,由于OG 中的質(zhì)子和復(fù)合物中的芳香氫、活潑的—OH基團質(zhì)子在溶劑中易受到去屏蔽影響和各向異性效應(yīng)的影響[25],因此通過重水交換,可去除其他氫信號的干擾。 復(fù)合物的核磁共振波譜見圖3。 由圖3(a)可知,OG 的異頭氫信號集中在化學位移4.5 ～5.5 處,QE 在化學位移6.5 ～8.5 處有明顯的3 個芳香基質(zhì)子信號[圖3(d)]；而共價、非共價復(fù)合物在化學位移4.5 ～5.5 處出現(xiàn)了α 型異頭氫質(zhì)子的信號峰,且在化學位移6.5 ～8.5 處產(chǎn)生了3 個屬于QE 的芳香基的新質(zhì)子信號,與紅外光譜的結(jié)果相符,進一步驗證了QE 被成功連接到OG 的糖苷鍵上。

圖3 各組樣品的一維核磁波譜Fig.3 1H-NMR spectra of samples

2.1.4 共價、非共價交聯(lián)對復(fù)合物結(jié)合比例的影響

利用等溫滴定量熱技術(shù)測定糖酚結(jié)合情況,實驗結(jié)果見圖4。 由圖4 可知,隨著滴定的進行,加熱絲補償給樣品池和參比池的熱量存在變化且逐漸減少并逐漸達到飽和狀態(tài),說明OG 與QE 可結(jié)合,每1 mol OG 可結(jié)合4.5 mol QE。 滴定過程是通過QE酚羥基上的氫和OG 醚鍵上的氧原子之間形成氫鍵,苯環(huán)作為交聯(lián)葡聚糖凝膠羥基的電子供體,通過氫鍵與范德華力的吸引形成復(fù)合物進而封裝QE[26]。 另外,復(fù)合物的熱量變化隨QE 濃度的變化而變化,濃度過低,補償熱量高；而過量的QE 可能會結(jié)合相鄰的納米顆粒,促進架橋絮凝和結(jié)構(gòu)變形,從而進一步降低復(fù)合物的穩(wěn)定性；當濃度適宜時,結(jié)合的復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性。

圖4 復(fù)合物的結(jié)合比例Fig.4 Binding ratio of composites

2.1.5 共價、非共價交聯(lián)對復(fù)合物熱降解特性的影響

利用熱重技術(shù)可研究復(fù)合物的熱降解特征,實驗結(jié)果見圖5。 由5(a)可知,隨著溫度的升高,各物質(zhì)的質(zhì)量都呈現(xiàn)下降的趨勢。 由圖5(b)可知,COGQ 與NOGQ 在100 ℃左右出現(xiàn)第一個明顯的失重峰,可能是由于樣品失去表層水分,同時失去結(jié)合水,造成質(zhì)量略有下降；第二降解階段集中在200 ～300 ℃,這一時期失重加快,由于原料中的化學結(jié)構(gòu)發(fā)生降解,羰基和C—H 鍵斷裂,發(fā)生高分子降解,析出揮發(fā)物而導(dǎo)致質(zhì)量下降[27]；第三個熱降解階段是300 ℃,這一階段是由于原料發(fā)生了碳化而導(dǎo)致質(zhì)量下降[28],因此COGQ 與NOGQ 在300 ℃以下不易降解。

圖5 復(fù)合物的熱降解特性曲線Fig.5 Thermal degradation characteristic curve of composites

2.1.6 共價、非共價交聯(lián)對復(fù)合物微觀結(jié)構(gòu)的影響

掃描電子顯微鏡是觀察物體微觀結(jié)構(gòu)最直接的手段,通過放大300、500、900 倍,可以清楚地觀察到樣品呈現(xiàn)出的表面結(jié)構(gòu)(圖6)。 由圖6 可見:OG 組物質(zhì)較為分散,菱角鋒利,大小不一,呈分散的顆粒狀；QE 組物質(zhì)結(jié)合疏松,呈絲狀或線條狀；COGQ 組物質(zhì)結(jié)構(gòu)較為致密,呈光滑卷曲狀；NOGQ 組物質(zhì)較為平整,連接緊密,呈凹凸狀。 COGQ、NOGQ 在包埋QE 之后,與可溶性O(shè)G 相比,復(fù)合物結(jié)構(gòu)更為致密,推測可能是因為復(fù)合物經(jīng)過化學鍵的連接,分子間作用力增強而呈現(xiàn)。復(fù)合物組表面不規(guī)則的形狀和粗糙度可能是因為樣品在凍干時用極少量的水溶解后,沒有被很好地水化而直接吸附在樣品臺,導(dǎo)致呈聚集狀。

圖6 各組樣品的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructure of each group of samples

2.2 COGQ、NOGQ 對線蟲衰老的影響

2.2.1 復(fù)合物對線蟲壽命與氧化應(yīng)激的影響

為研究復(fù)合物對線蟲壽命的影響,將OG、QE、COGQ、NOGQ 喂食線蟲后,觀察線蟲存活時間,實驗結(jié)果見表1。 由表1 可知,COGQ 組與NOGQ 組較空白組壽命有所延長。 NOGQ 組線蟲平均壽命為(17.70 ±1.63)d(P＜0.05),最長壽命為(27.33 ±0.85)d(P＜0.01),其中最長壽命比空白組延長17.95%,表明復(fù)合物能有效延長線蟲壽命。

表1 復(fù)合物對線蟲壽命的影響Tab.1 Effect of composites on lifespan of C. elegans

氧化應(yīng)激可反映線蟲清除氧化自由基,維持自由基和氧化應(yīng)激系統(tǒng)動態(tài)平衡的能力,實驗結(jié)果見表2。 由表2 可知,COGQ 組與NOGQ 組的線蟲較空白組壽命有所延長。 NOGQ 組線蟲平均壽命為(3.76 ±0.35)h(P＜0.05), 最 長 壽 命 為(4.72 ±0.40)h(P＜0.01),其中最長壽命比空白組延長12.23%,表明復(fù)合物在氧化應(yīng)激方面有良好的效果。 由于多糖與多酚交聯(lián)后,多糖包埋多酚,可能會降低多酚的抗氧化潛能,因此表2 中出現(xiàn)復(fù)合物延長壽命效果低于多酚的現(xiàn)象。

表2 復(fù)合物對線蟲氧化應(yīng)激的影響Tab.2 Effects of composites on oxidative stress of C. elegans

復(fù)合物延長線蟲壽命還可能與胰島素-1 信號通路有關(guān)[29],此信號通路是調(diào)節(jié)生物個體衰老最重要的信號通路之一。daf-16 基因在線蟲中屬于胰島素信號通路中的關(guān)鍵基因,在人類身上可以找到其所在信號通路的同源基因。 目前已有大量文獻報道,通過提供特定的營養(yǎng)素可調(diào)控daf-16 基因,延緩壽命[30-32]。

2.2.2 復(fù)合物對線蟲體內(nèi)SOD 和CAT 酶活性的影響

機體內(nèi)自由基的過多積累會破壞細胞結(jié)構(gòu)進而導(dǎo)致細胞衰老甚至死亡。 SOD 是目前已知的唯一能直接清除超氧自由基的專一酶,CAT 也是分解H2O2的專用酶。 提高SOD 和CAT 的活性可以清除體內(nèi)多余的自由基,并可潛在地延長壽命[33-34]。圖7 顯示了復(fù)合物對線蟲體內(nèi)SOD 和CAT 酶活的影響,由圖7 可知,與空白組相比,NOGQ 組SOD 酶活極顯著提高(P＜0.01),COGQ 組CAT 酶活極顯著提高(P＜0.01)。 由于多糖與多酚的相互作用對多酚清除自由基、提高SOD 與CAT 酶活有掩蔽作用,因此會降低多酚的抗氧化潛能,出現(xiàn)復(fù)合物抗氧化效果低于多酚的現(xiàn)象[35]。 研究結(jié)果表明,復(fù)合物可提高機體抗氧化酶活性,同時也就具有抑制及清除自由基的作用,這與氧化應(yīng)激實驗的結(jié)果一致。

圖7 復(fù)合物對線蟲體內(nèi)SOD 和CAT 活性的影響Fig.7 Effect of composites on SOD and CAT activity of C. elegans

3 結(jié)論與展望

本研究采用氫鍵、范德華力吸附制備NOGQ,利用自由基移植催化反應(yīng)制備COGQ,表征復(fù)合物的化學性質(zhì)并利用秀麗隱桿線蟲評價復(fù)合物延緩衰老的作用。 實驗發(fā)現(xiàn),復(fù)合物經(jīng)過交聯(lián)后相對分子質(zhì)量較OG 變化不大,呈非晶無定型狀態(tài),在300 ℃以下穩(wěn)定,微觀結(jié)構(gòu)致密。 復(fù)合物能提高線蟲的平均壽命和最長壽命,能有效提高機體抗氧化應(yīng)激能力及抗氧化酶的活性。 研究結(jié)果旨在為糖酚復(fù)合物制備及新型食品抗氧化劑的開發(fā)提供參考。 本研究初步探索了糖酚復(fù)合物的抗衰老活性,今后可研究不同結(jié)合度、不同側(cè)鏈、不同類型的糖苷鍵復(fù)合物,進一步探索其結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。