西方蜜蜂AmOBP17基因的生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析

聶紅毅，郭永康，鄭秋嵐，曾何泉

（福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

0 引言

西方蜜蜂嗅覺系統(tǒng)是高度發(fā)達(dá)的感受系統(tǒng)，其靈敏的嗅覺與生命活動的各個方面息息相關(guān)，如：蜂王通過分泌蜂王信息素控制蜂群的發(fā)展，工蜂通過識別幼蟲信息素產(chǎn)生哺育行為，因此西方蜜蜂嗅覺系統(tǒng)對蜂群的發(fā)展和幼蟲成長具有重大意義［1，2］.西方蜜蜂嗅覺感受器是蜜蜂識別氣味分子的基礎(chǔ)，西方蜜蜂觸角上分布著大量嗅覺感受器，是在化學(xué)通訊中感受氣味或化學(xué)分子的主要感受器官［3］.西方蜜蜂嗅覺感受器位于淋巴液中，脂溶性的氣味物質(zhì)很難在沒有載體的情況下，穿過親水性血淋巴到達(dá)嗅覺感受器，需要借助一種特殊的蛋白才能實(shí)現(xiàn)氣味物質(zhì)與嗅覺神經(jīng)樹突膜上的氣味受體結(jié)合，而氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）就是負(fù)責(zé)執(zhí)行這一重要功能的蛋白［4］.

OBPs 是一種小分子可溶性蛋白，其三級結(jié)構(gòu)高度保守，由 8 個反向平行的 β 折疊和 1 個短的 α 螺旋組成，位于感覺神經(jīng)元周圍的液體中，通過將氣味分子穿過淋巴液輸送到氣味受體蛋白（ORs），促進(jìn) 嗅 覺 系 統(tǒng) 的 敏 感 性［2，5-10］.2006 年 ，F(xiàn)orêt 和Maleszka［11］在西方蜜蜂中鑒定出了 21 個 OBPs 基因，明顯少于岡比亞按蚊（70 個）和黑腹果蠅（51個）中的OBPs 基因數(shù)目，它們利用實(shí)時熒光定量技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在西方蜜蜂觸角中只有9 個OBPs 基因表達(dá) .Iovinella 等［12］人在 2011 年利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究了西方成年蜜蜂上顎腺中的OBPs 的表達(dá)與級型和日齡相關(guān)，發(fā)現(xiàn)OBP13 主要在剛出房蜜蜂和處女蜂王中表達(dá)，而OBP21 在采集蜂中高量表達(dá)，同樣也在交配的蜂王中普遍存在，而且OBP14在工蜂的腺體中也有產(chǎn)生.2019 年，Wu Fan 等［13］通過交叉培育實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OBP14 對哺育蜂產(chǎn)漿有較大的影響.

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氣味結(jié)合蛋白17（odorant binding protein 17，OBP17）基因在自然蜂群的哺育蜂觸角和人工組建相同日齡蜂群的哺育蜂觸角中都顯著上調(diào)表達(dá)，表明西方蜜蜂體內(nèi)的OBP17 不僅在嗅覺功能中發(fā)揮作用，而且其可能在西方蜜蜂哺育行為中也發(fā)揮著重要作用［14］.但是OBP17 影響西方蜜蜂哺育行為的機(jī)理，還尚未報(bào)道.本研究在西方蜜蜂不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，克隆西方蜜蜂OBP17 基因，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)、生化理化性質(zhì)，進(jìn)一步探究OBP17 基因在腦部、上顎腺和咽下腺中的表達(dá)量，期望為OBP17 基因在西方蜜蜂中的深入研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)蜂群

本實(shí)驗(yàn)所用蜂群來自于福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂分子育種實(shí)驗(yàn)室所飼養(yǎng)的“蜂強(qiáng)1 號”西方蜜蜂.

1.2 主要試劑

Trizol 試劑盒、Blunt Zero 載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖、TAE 緩沖液、DNA marker 2K、Gel stain 生物染色劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司，DNA 凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega、LB 培養(yǎng)基購自上海生工生物工程股份有限公司.

1.3 AmOBP17基因的克隆

在蜂群巢門口，隨機(jī)抓取成年工蜂5 只，立即置于研缽中，加入液氮充分研磨.利用Trizol 法提取其RNA，并通過NanoDrop2000 和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整度.取1 μg RNA 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求，合成cDNA 的第一鏈，用于后續(xù)克隆.利用Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)AmOBP17 基因（登錄號為 NM_001040207）的特異引物（F：GATGTAATTCAAGTGCATTCGAGTCTG；R：GTTGTCGTATCCTGAATAATCCTCTTG）.以成年工蜂的cDNA 為模板，擴(kuò)增該基因CDS 全長序列.PCR 反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 1 min，循環(huán)數(shù) 35；72 ℃終延伸 5 min.取 1 μL AmOBP17 基因 PCR 產(chǎn)物 50 ng/μL 與 1 μL Blunt zero 載體混合，37 ℃連接5 min，然后加入 Ttans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞 50 μL，按照說明書要求進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作.最后挑取10 個菌斑進(jìn)行菌液PCR，將擴(kuò)增出與目的條帶大小一致且亮度較亮的菌液送去上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測序.

1.4 生物信息學(xué)分析

在NCBI 網(wǎng)站下載西方蜜蜂AmOBP17 基因mRNA 序列和氨基酸序列.基于pI/Mw 在線工具，計(jì)算其分子量與等電點(diǎn)；SignalP-5.0 預(yù)測蛋白的信號肽；ProtScale 軟件預(yù)測蛋白的疏水性/親水性.分別利用NEPhos 2.0 和NetOGlyc 4.0 預(yù)測蛋白的N 磷酸化、O 糖基化位點(diǎn) .利用 NCBI conserved domain search 在線預(yù)測結(jié)構(gòu)域，基于PSORT II Prediction 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測.

1.5 AmOBP17基因的時空表達(dá)譜

基于本課題組前期的西方蜜蜂不同發(fā)育時期（1 日齡胚胎、2 日齡胚胎、3 日齡胚胎、1 日齡幼蟲、3日齡幼蟲、5 日齡幼蟲、7 日齡幼蟲、1 日齡蛹、3 日齡蛹、5 日齡蛹、7 日齡蛹、9 日齡蛹、剛出房蜜蜂、10 日齡哺育蜂、21 日齡采集蜂）轉(zhuǎn)錄組測序（數(shù)據(jù)未公布）以及3 日齡工蜂、10 日齡哺育蜂、10 日齡采集蜂、21 日齡哺育蜂和21 日齡采集蜂的腦部、咽下腺（SUB7391751）和上顎腺（SUB8031156）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［14-16］，利用NovoMagic 平臺從各轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取AmOBP17 基因在各個樣本中的FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值，作為該基因在各個樣本中的基因表達(dá)量，分析AmOBP17 基因的時空表達(dá)模式；在腦部、上顎腺和咽下腺的數(shù)據(jù)分析中，校準(zhǔn)后的Padj ＜0.05 作為基因差異顯著的閾值.

2 結(jié)果分析

2.1 AmOBP17的基因克隆

以西方蜜蜂成年工蜂的cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增包含AmOBP17 基因CDS 全長片段.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，500 bp 附近檢測到明顯的單一條帶如圖 1 所示 .經(jīng)測序驗(yàn)證，AmOBP17 基因 CDS 全長為408 bp，與NCBI 中該基因序列基本一致.

圖1 AmOBP17基因CDS序列瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 AmOBP17蛋白的結(jié)構(gòu)和理化特性預(yù)測

西方蜜蜂氣味結(jié)合蛋白OBP17（odorant binding protein 17）（登錄號：NM_001040207）mRNA 全長1179 bp，包含5 個外顯子，編碼序列為408 個核苷酸，有135 個氨基酸殘基.該蛋白17-126 位包含一個信息素/普通氣味結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域，具有6個保守的半胱氨酸殘基形成3 對二硫鍵，如圖2 所示.等電點(diǎn)和分子量分別為4.54 和15031.43Da.PSORT II Prediction 亞細(xì)胞定位預(yù)測OBP17 蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá).AmOBP17 蛋白在第18、66 存在潛在的蘇氨酸N 磷酸化位點(diǎn)，在第126 位存在潛在的酪氨酸N 磷酸化位點(diǎn)，在第84 位存在潛在的O糖基化位點(diǎn).

圖2 AmOBP17的氨基酸序列

基于 SignalP-5.0 預(yù)測 OBP17 蛋白 1-16 位氨基酸序列存在1 個Sec/SPI 類型的信號肽，該信號肽的概率為0.9862；第16 位和第17 位氨基酸之間存在切割位點(diǎn)，如圖3 所示.

圖3 AmOBP17蛋白的信號肽預(yù)測

利用ProtScale 軟件的Kyte and Doolittle 算法對西方蜜蜂AmOBP17 蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析.結(jié)果顯示西方蜜蜂AmOBP17 中疏水性最強(qiáng)的是4-16 區(qū)域，具有較強(qiáng)的疏水性的是61-64 區(qū)域；77-80區(qū)域的親水性最強(qiáng)，其次52-55、95-97 區(qū)域具有較強(qiáng)的親水性，可見西方蜜蜂AmOBP17 的疏水區(qū)域大于親水區(qū)域，如圖4 所示.

圖4 西方蜜蜂AmOBP17氨基酸序列疏水性/親水性的預(yù)測

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用MEGA6.0 軟件鄰位相連法進(jìn)行500 次重復(fù)計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5 所示，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)，同屬于蜜蜂屬的大蜜蜂（Apis dor-sata）與AmOBP17 的親緣關(guān)系最近.

圖5 AmOBP17基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 AmOBP17基因的時期表達(dá)譜

轉(zhuǎn)錄組分析AmOBP17 基因在不同發(fā)育時期（1 日齡胚胎、2 日齡胚胎、3 日齡胚胎、1 日齡幼蟲、3日齡幼蟲、5 日齡幼蟲、7 日齡幼蟲、1 日齡蛹、3 日齡蛹、5 日齡蛹、7 日齡蛹、9 日齡蛹、剛出房蜜蜂、10 日齡哺育蜂、21 日齡采集蜂）的表達(dá)模式如圖6 所示.結(jié)果表明：該基因從1 日齡胚胎至5 日齡蛹期表達(dá)量較弱（或基本不表達(dá)），剛出房蜜蜂和哺育蜂中表達(dá)量最高，其哺育蜂時期達(dá)到表達(dá)量的峰值，暗示該基因可能在剛出房蜜蜂和哺育蜂感知蜂群內(nèi)信息素分子中發(fā)揮重要作用.

圖6 AmOBP17基因時期表達(dá)譜檢測

2.5 AmOBP17 基因在腦部、上顎腺和咽下腺中的表達(dá)量

通過 3 日齡工蜂、10 日齡采集蜂、10 日齡哺育蜂、21 日齡采集蜂和21 日齡哺育蜂的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)AmOBP17 基因的表達(dá)量在10 d 哺育蜂和21 d哺育蜂腦中的表達(dá)量顯著高于相同日齡采集蜂腦中的表達(dá)量如圖7（A）所示（P ＜ 0.05），其中10 日齡的哺育蜂和21 日齡哺育蜂腦部表達(dá)量較高，3 日齡工蜂腦部的表達(dá)量最低，且AmOBP17 基因的表達(dá)量在10 日齡和21 日齡采集蜂腦部表達(dá)量差異不顯著（P ＞ 0.05）.通過5 個樣本上顎腺的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)AmOBP17 基因在10 日齡哺育蜂上顎腺中的表達(dá)量顯著高于3 日齡工蜂和21 日齡采集蜂中的表達(dá)量，在10 日齡哺育蜂上顎腺中的表達(dá)量也顯著高于10 日齡采集蜂上顎腺中的表達(dá)量（P ＜0.05），該基因在21 日齡哺育蜂上顎腺中的表達(dá)量顯著高于21 日齡采集蜂中的表達(dá)量（P ＜0.05）如圖7（B）所示.同樣地，通過分析5 個樣本咽下腺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AmOBP17 基因在10 日齡哺育蜂和21 日齡哺育蜂咽下腺中的表達(dá)量均高于相應(yīng)日齡采集蜂中的表達(dá)量，21 日齡哺育蜂咽下腺中的表達(dá)量顯著高于21 日齡采集蜂中的表達(dá)量（P ＜0.05），且AmOBP17 基因的表達(dá)量在10 日齡和21日齡采集蜂咽下腺中表達(dá)量差異不顯著（P ＞0.05）如圖7（C）所示.

圖7 AmOBP17基因在蜜蜂大腦、咽下腺、上顎腺中的表達(dá)量

3 討論

典型的氣味結(jié)合蛋白（OBPs）具有6 個半胱氨酸形成的3 個二硫鍵，用以維持其三級蛋白結(jié)構(gòu).文獻(xiàn)報(bào)道在中華蜜蜂OBP10 的氨基酸序列中有6個保守的半胱氨酸殘基［17］.通過生物信息分析，我們也發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂AmOBP17 基因的氨基酸序列也存在6 個保守的半胱氨酸，表明OBPs 在不同昆蟲中高度保守.

在昆蟲嗅覺刺激的檢測和識別方面，OBPs 具有重要的作用.同時，發(fā)現(xiàn)OBPs 具有新的功能，已初步應(yīng)用于新藥研發(fā)和環(huán)境中污染物的清除［18］.西方蜜蜂OBP14 可以與其他配體結(jié)合，比如高香草酸、香草酸甲酯以及丁子香酚的羥基結(jié)合［19］.中華蜜蜂OBP10 基因在毒腺中高量表達(dá)，同時也發(fā)現(xiàn)該基因在響應(yīng)應(yīng)激刺激中（如低溫、H2O2、噠螨靈、滅多蟲、吡蟲啉、高溫、紫外線、維生素C、HgCl2、氯化鉻、百草枯和辛硫磷等）發(fā)揮重要作用［17］.蜜蜂中已鑒定了超過177 個OBP 基因，其中4 個基因（OBP10、OBP13、OBP14 和OBP17）在化學(xué)感受器較少的區(qū)域高量表達(dá)，表明其可能存在其他潛在的功能［19］.在本文中，時空表達(dá)譜顯示 AmOBP17 基因在哺育蜂時期表達(dá)量達(dá)到峰值，同時該基因的表達(dá)量在哺育蜂腦部、上顎腺和咽下腺中的表達(dá)量均高于同日齡采集蜂腦部、上顎腺和咽下腺中的表達(dá)量.蜜蜂作為膜翅目昆蟲的代表，其職能分工存在日齡依賴性.通常情況下，在出房后的2～3 周，工蜂從事巢內(nèi)的活動，包括飼喂小幼蟲，清理巢房等；3周后，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樵诔餐饣顒拥牟杉洌?fù)責(zé)采集花粉、花蜜和水等.哺育幼蟲是哺育蜂的主要職責(zé).在此階段，上顎腺和咽下腺是蜂王漿合成和分泌的主要器官，其中上顎腺主要負(fù)責(zé)分泌蜂王漿中的脂質(zhì)成分（如10-羥基-2-癸烯酸），而咽下腺主要分泌蜂王漿中蛋白質(zhì).我們發(fā)現(xiàn)AmOBP17 基因在哺育蜂的上顎腺和咽下腺中高量表達(dá)，暗示該基因可能在哺育蜂蜂王漿合成和分泌過程發(fā)揮重要的作用.

由于基因編輯效率高和操作簡單，基因組編輯技術(shù)已在昆蟲基因功能研究中廣泛應(yīng)用.本團(tuán)隊(duì)前期已構(gòu)建了西方蜜蜂基因編輯平臺，成功獲得了具有明顯表型的yellow-y 突變體雄蜂和csd 突變體［20，21］.我們將利用基因組編輯平臺深入闡明AmOBP17 基因在西方蜜蜂哺育蜂中發(fā)揮功能的分子機(jī)制.