基于高通量測(cè)序的寧波三江干流微生物多樣性分析

張曉鎮(zhèn)，陸志波，季樹(shù)勛，夏珊珊，王 穎

（1. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092；2. 寧波市水利發(fā)展規(guī)劃研究中心，浙江 寧波 315000）

河流是淡水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，河道生態(tài)系統(tǒng)中的浮游微生物是河道生物多樣性的重要組成部分，且與河流中溶解氧、pH、硝態(tài)氮、總磷和重金屬等眾多環(huán)境因子息息相關(guān)[1-3]，做好河流微生物多樣性研究是河流健康評(píng)價(jià)、水系連通與生態(tài)修復(fù)、供水安全保障等工作的重要基礎(chǔ)。

近 30 年來(lái)，各國(guó)形成了側(cè)重點(diǎn)不同、各具特色的評(píng)價(jià)方法，如，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（US EPA）提出的快速生物監(jiān)測(cè)協(xié)議（Rapid Bio-assessment Protocols，RBP）[4]、歐盟的《水框架法令》(WFD)[5]等都已在河流水生態(tài)系統(tǒng)健康管理中得到應(yīng)用。2020 年世界自然基金會(huì)聯(lián)合我國(guó)8 家科研院所共同發(fā)布《長(zhǎng)江生命力報(bào)告2020》，提出長(zhǎng)江生命力指數(shù)。這些評(píng)價(jià)方法均將水生態(tài)作為重要維度。

微生物作為有機(jī)化合物的主要分解和礦化者[6-7]，在食物鏈和食物網(wǎng)中所處的營(yíng)養(yǎng)級(jí)比大型水生動(dòng)植物更低[8]，水體微生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性一定程度上能反應(yīng)水體中大型生物的網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性與社區(qū)對(duì)擾動(dòng)的抵抗力和恢復(fù)力[9]。微生物群落結(jié)構(gòu)、豐度等也可以作為有機(jī)物分解、反硝化功能的指標(biāo)[10]。

近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，地表水微生物安全主要是通過(guò)檢測(cè)糞便污染的細(xì)菌指標(biāo)來(lái)確定[11]，但除致病菌外，在地表水微生物監(jiān)測(cè)中污染指示微生物更能反應(yīng)水體受污染的現(xiàn)狀[12]。有研究者[13]提出可以創(chuàng)建可靠、標(biāo)準(zhǔn)化的參考數(shù)據(jù)庫(kù)，作為指示健康微生物群落的基線指標(biāo)。通過(guò)相關(guān)性計(jì)算可以分析環(huán)境因子與物種分布間的相關(guān)關(guān)系[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)微生物多樣性指數(shù)與總磷和磷酸鹽含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[15]。SOUFFREAU et al[16]也發(fā)現(xiàn)總磷和氨氮對(duì)湖泊的微生物群落組成有顯著影響。

微生物多樣性研究的傳統(tǒng)方法是微生物分離純化培養(yǎng)，存在如培養(yǎng)周期長(zhǎng)、分類學(xué)鑒定不準(zhǔn)確等弊端[17]。分子生物學(xué)技術(shù)可以高效、準(zhǔn)確地從遺傳物質(zhì)水平上研究環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)[18]。高通量測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)微生物群落分析的常用技術(shù)[19-21]，具備測(cè)序快速、通量高等優(yōu)勢(shì)，且可對(duì)多樣品的多個(gè)可變區(qū)同時(shí)測(cè)序[22]。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究三江干流水體微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，可以為構(gòu)建三江流域生態(tài)系統(tǒng)管理方案提供科學(xué)依據(jù)。

寧波市的余姚江、奉化江和甬江合稱“三江”。三江口由于其獨(dú)特的自然地理?xiàng)l件，成為寧波市的重要標(biāo)志[23-24]。三江河道的治理方案主要為水利工程建設(shè)[20]，需要對(duì)河道水生態(tài)進(jìn)行長(zhǎng)期綜合監(jiān)測(cè)以提供數(shù)據(jù)支撐，極有必要對(duì)其中微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性展開(kāi)全面研究。當(dāng)前對(duì)于寧波三江流域微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的研究較為缺乏，本文開(kāi)展的研究說(shuō)明通過(guò)高通量測(cè)序的方法開(kāi)展河流的生態(tài)指標(biāo)監(jiān)測(cè)具有可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

此次三江干流巡航測(cè)量范圍為余姚江（牟山閘/永思橋～蜀山大閘～姚江大閘～三江口）、奉化江（三江口～澄浪堰）、甬江（三江口～入?？冢：綔y(cè)總長(zhǎng)度約105 km。以下稱三江干流均為上述范圍。巡航測(cè)量時(shí)間為2021 年5 月11～14 日。測(cè)量方式為使用航測(cè)船只沿余姚江、奉化江和甬江深泓航道線單向巡航一次。途中在三江干流12 處點(diǎn)位停船進(jìn)行水體取樣測(cè)量。測(cè)量斷面及取樣點(diǎn)位置分布，見(jiàn)表1 和圖1。

表1 三江干流航測(cè)斷面及取樣點(diǎn)位置分布

圖1 寧波三江干流采樣點(diǎn)分布

取樣過(guò)濾裝置含真空泵或蠕動(dòng)泵、六聯(lián)過(guò)濾器和直徑為47 mm、孔徑0.45 μm 的混合纖維素酯膜。

1.2 生物信息提取與分析

DNA 提取和測(cè)序在Personal Biotechnology Co. Ltd.（中國(guó)上海）進(jìn)行。按照制造商的說(shuō)明，通過(guò)DNeasy PowerSoil Kit（QIAGEN，Hilden，Germany）提取水樣中總微生物基因組 DNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和 NanoDrop ND-1 000 分光光度計(jì) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 評(píng)估提取的DNA 的質(zhì)量和數(shù)量。

使用引物對(duì)515F_926R 和18SV4F_18SV4R來(lái)分別對(duì) 16S rRNA 基因、18S rRNA 基因的可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

采用Illumina HiSeq X-10（Illumina，San Diego，CA，USA）平臺(tái)對(duì)群落DNA 片段進(jìn)行雙端（Pairedend）測(cè)序。使用DADA2 方法進(jìn)行去引物，質(zhì)量過(guò)濾，去噪(denoise)，拼接和去嵌合體等步驟。用QIIME2 (2 019.4)進(jìn)行物種分類學(xué)注釋。將有效數(shù)據(jù)在97%的相似水平上劃分為不同的運(yùn)算分類單位(operational taxonomic unit, OTU), 將OTU 代表序列與相應(yīng)的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 利用Greengene數(shù)據(jù)等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)物種進(jìn)行注釋, 從而得到每個(gè)樣本所含的物種信息。通過(guò)對(duì)OTUs 進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)、豐度等分析, 并對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析, 得到細(xì)菌群落的組成信息, 再通過(guò)Beta 多樣性分析, 系統(tǒng)分析三江干流不同流域樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。

使用Alpha 多樣性來(lái)衡量局域均勻生境下的物種數(shù)目。α 多樣性使用Hill’s number family 多樣性計(jì)算[25]，主要包括Chao 指數(shù)；Faith’s pd 指數(shù)；Simpson 指數(shù)；Shannon 指數(shù)；Good’s coverage 指數(shù)；Pielou’s evenness 指數(shù)；Observed species 指數(shù)。

Chao1 是基于豐度的估計(jì)量，計(jì)算見(jiàn)式（1）[26]：

式中，Schao1為預(yù)測(cè)豐富度，Sobs為觀測(cè)到的物種數(shù)量，n1為單序列OTUs 數(shù)目，n2為雙序列OTUs 數(shù)目。

Faith’s pd 指數(shù)反映了譜系多樣性，等于生命發(fā)育樹(shù)（The Tree of Life Web）的分支數(shù)量[27]。

Simpson 指數(shù)是衡量個(gè)體在分類時(shí)的集中程度，見(jiàn)式（2）[25]：

式中，Sobs為觀測(cè)到的OTUs 數(shù)量，ni為第i個(gè)OUT 對(duì)應(yīng)的個(gè)體數(shù)目，N為群落中所含的總個(gè)體數(shù)目（所有 OTU 的豐度之和）。

Shannon 指數(shù)量化了預(yù)測(cè)從數(shù)據(jù)集中隨機(jī)抽取的個(gè)體物種身份的不確定性，見(jiàn)式（3）[28]：

式中，Sobs為觀測(cè)到的OTUs 數(shù)量，ni為第i個(gè)OUT對(duì)應(yīng)的個(gè)體數(shù)目，N為群落中所含的總個(gè)體數(shù)目。

Good’s coverage 指數(shù)用于評(píng)估測(cè)序結(jié)果代表的community 物種的總數(shù)[29]，見(jiàn)式（4）：

式中，F(xiàn)是單序列 OTU 的數(shù)量，N是群落中所含的總個(gè)體數(shù)目。

Pielou’s evenness 指數(shù)用于描述物種中的個(gè)體的相對(duì)豐富度或所占比例[30]，見(jiàn)式（5）：

式中，H’為Shannon 指數(shù)的值，H’max為H’的最大值。

Observed species 指數(shù)為群落中豐度＞0 的物種數(shù)之和，可以反映物種種類信息。

Beta 多樣性是指沿著環(huán)境梯度變化的不同群落之間，物種組成的相異性或物種沿環(huán)境梯度的更替速率，因此也被稱為生境間多樣性(betweenhabitat diversity)。β多樣性分析所使用的Braycurtis 距離基于OTUs 的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，比較2 個(gè)群落微生物的組成差異，見(jiàn)式（6）[31]：

式（6）中，SA,i和SB,i表示第i個(gè)OTU 分別在A 群落和B 群落中的計(jì)數(shù)。min 表示取兩者最小值。

2 結(jié)果與討論

2.1 三江干流微生物群落組成

通過(guò)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)序列物種分類學(xué)注釋的結(jié)果對(duì)物種組成進(jìn)行分類，展示相對(duì)豐度最高的10 個(gè)分類，其余合并顯示為others。統(tǒng)計(jì)樣本的物種注釋結(jié)果中門(Phylum) 、綱(Class) 、目(Order) 、科(Family) 和屬(Genus)水平上含有的分類單元的數(shù)量。

對(duì)于原核微生物，在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)的平均豐度最高（圖2a），在C1、C3、C4 和PC2 點(diǎn)位處相對(duì)豐度均超過(guò)60%，但在靠近入?？诘腃13 點(diǎn)位處擬桿菌門(Firmicutes)的相對(duì)豐度最高，達(dá)到42.8%。需要注意在C4、C5 和C7 等采樣水域厚壁菌門(Firmicutes) 表現(xiàn)出較高豐度，說(shuō)明已經(jīng)存在污水排放導(dǎo)致的DO 含量下降，存在厭氧環(huán)境[32]。在綱水平上（圖2b），γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria) 的平均豐度最高，其中在C1-C5、PC1、PC2 的7 個(gè)點(diǎn)位處相對(duì)豐度均超過(guò)50%，在臨近入?？诘腃13 處γ-變形菌綱的豐度明顯下降，擬桿菌綱(Bacteroidia)、梭菌綱(Clostridia)的相對(duì)豐度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在門水平與綱水平上，優(yōu)勢(shì)菌種與其他研究中的結(jié)果一致[33-34]。在目水平上（圖2c ），在余姚江河段，假單胞菌目(Pseudomonadales)平均相對(duì)豐度較高，達(dá)到46.4%，在奉化江和甬江河段異常球菌目(Deinococcales)相對(duì)豐度可達(dá)到20%以上，在C9 處達(dá)到最高值42.7%。在科水平上（圖2d），莫拉菌科(Moraxellaceae)在余姚江河段各采樣點(diǎn)處都表現(xiàn)出較高的豐度，在C2-C5 點(diǎn)位處豐度均高于40%，尤其在C4 處達(dá)到54.5%，異常球菌科(Deinococcaceae)在甬江流域也表現(xiàn)出較高豐度，在C9 處達(dá)到最高值42.7%。在屬水平上，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)的平均豐度最高，異常球菌屬(Deinococcus)在甬江流域也表現(xiàn)出了較高的豐度，最高在C9 支流交匯處，達(dá)到42.7%。最豐富的細(xì)菌種類包括奇異球菌(Deinococcus grandis)(9.44%)、魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter lwoffii) (1.18%)、波西米亞不動(dòng)桿菌(Acinetobacter bohemicus) (1.09%)等。

圖2 原核生物群落結(jié)構(gòu)組成

對(duì)于真核微生物，在門水平上，綠藻門(Chlorophyta)的平均豐度最高（圖3a），在C2、C6 和PC2 點(diǎn)位處相對(duì)豐度均超過(guò)40%，在C6、PC1、PC2 和C12 等采樣點(diǎn)處子囊菌門(Ascomycota) 也表現(xiàn)出較高的相對(duì)豐度，在PC1 點(diǎn)位處子囊菌門(Ascomycota)的相對(duì)豐度最高，達(dá)到65.5%。在綱水平上（圖3b），綠藻綱 (Chlorophyceae)的平均豐度最高，為25.6%，其次為引藻綱(Cryptomonadales)(12.7%)、甲藻綱(Dinophyceae)(7.8%)等分類。在臨近入?？诘腃12、C13 處綠藻綱的豐度明顯下降，擬桿菌綱(Bacteroidia)、梭菌綱(Clostridia)的相對(duì)豐度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在目水平上（圖3c），在C1～C6， 環(huán) 藻 目 (Sphaeropleales)、 海 鏈 藻 目(Thalassiosirales)相對(duì)豐度較高，達(dá)到46.4%，在C7、C10 處，隱藻目(Cryptomonadales)相對(duì)豐度分別達(dá)到85.0%、69.1%，表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。在科水平上（圖3d），隱鞭藻科(Cryptomonadaceae) 平均豐度達(dá)到13.2%，在C7、C10 處表現(xiàn)出顯著的高豐度，尤其在C7 處達(dá)到85.0%，但在C1～C5 各點(diǎn)位處其豐度并不顯著。在屬水平上，隱藻屬(Cryptomonas)的平均豐度最高，主要在C7、C10 處表現(xiàn)出顯著的高豐度，小環(huán)藻屬(Cyclotella)在C1 處相對(duì)豐度達(dá)到46.6%。最豐富的真核微生物種類包括彎隱藻(Cryptomonas curvata) (6.85%)、寄生索囊藻(Choricystis parasitica)(0.79%)和馬索隱藻(Cryptomonas marssonii) (0.62%)等。

圖3 真核生物群落結(jié)構(gòu)組成

2.2 微生物群落Alpha 多樣性分析

以Chao1 和Observed species 指數(shù)表征豐富度，以Shannon 和Simpson 指數(shù)表征多樣性，以Faith’s PD 指數(shù)表征基于進(jìn)化的多樣性，以Pielou’s evenness 指數(shù)表征均勻度，以Good’s coverage 指數(shù)表征覆蓋度，微生物群落Alpha 多樣性分析結(jié)果，見(jiàn)圖4。

圖4a 可知，對(duì)于原核微生物，YYJ 樣品的Chao1 和Observed species 指數(shù)最高， FHJ 和YJ 樣品的Chao1 和Observed species 指數(shù)值差異不大，說(shuō)明余姚江流域的群落豐富度最高，Chao1 值在3 000 以上。YYJ 樣品的Shannon 指數(shù)值相對(duì)較高，但3 組樣品整體差異不顯著，Simpson 指數(shù)基本穩(wěn)定在0.98 以上，說(shuō)明三江干流流域各采樣點(diǎn)原核微生物群落多樣性較豐富，穩(wěn)定性較好，其中余姚江流域的原核微生物多樣性相對(duì)更高。YYJ 流域樣品的Faith’s PD 指數(shù)較小，而YJ 流域樣品Faith’s PD指數(shù)較大，F(xiàn)HJ 居中，說(shuō)明三江干流自上游至下游原核微生物的親緣關(guān)系逐漸復(fù)雜化，基于進(jìn)化的多樣性較高。YYJ 流域樣品的Pielou’s evenness 指數(shù)較高，F(xiàn)HJ 其次，YJ 最小，說(shuō)明3 個(gè)流域的物種均勻度自上游向下游逐漸減低。Good’s coverage 指數(shù)值均在0.97 以上，說(shuō)明測(cè)序?qū)θ郝渲形锓N的覆蓋度較高，未被檢測(cè)出的物種所占的比例很少。與瀾滄江[35]、科希河[36]和博斯騰湖流域[37]等流域相比，寧波三江流域原核微生物群落豐富度與多樣性更高。

圖4b 可知，對(duì)于真核微生物，F(xiàn)HJ 樣品的Chao1和Observed species 指數(shù)最高， YJ 其次，YYJ 樣品最低，說(shuō)明奉化江采樣監(jiān)測(cè)流域的群落豐富度最高。FHJ 樣品的Shannon 指數(shù)值相對(duì)較高，67%的采樣點(diǎn)的Simpson 指數(shù)在0.9 以上，3 組樣品Simpson 指數(shù)值無(wú)顯著差異，說(shuō)明三江干流流域各采樣點(diǎn)真核微生物群落多樣性較豐富，穩(wěn)定性較好，其中FHJ 流域的真核微生物多樣性相對(duì)更高。YYJ 流域樣品的Faith’s PD 指數(shù)較小，而YJ 流域樣品Faith’s PD 指數(shù)較大，F(xiàn)HJ 居中，說(shuō)明三江干流自上游至下游真核微生物的親緣關(guān)系與原核微生物的發(fā)展一致，也呈現(xiàn)逐漸復(fù)雜化的趨勢(shì)，基于進(jìn)化的多樣性較高。FHJ 流域樣品的Pielou’s evenness 指數(shù)較高，YJ 其次，YYJ 最小，說(shuō)明3 個(gè)流域的物種均勻度自上游向下游逐漸升高。Good’s coverage 指數(shù)值均在0.999 以上，說(shuō)明測(cè)序?qū)θ郝渲形锓N的覆蓋度較高，未被檢測(cè)出的物種所占的比例極少。與九龍江[38]、西安渭河、灞河和浐河[39]等流域相比，寧波三江流域真核微生物豐富度更低，多樣性相近。

圖4 Alpha 多樣性分析

2.3 微生物群落Beta 多樣性分析

根據(jù)Bray-curtis 距離算法，對(duì)物種進(jìn)行非度量多維尺度(non-metric multidi-mensional scaling，NMDS)分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)YYJ 的樣品在維度NMDS1 和維度NMDS2 能夠很好地與FHJ、YJ 區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明余姚江流域樣品的原核、真核微生物種類與FHJ、YJ 有較為明顯的區(qū)分性。其中Stress 值分別為0.057 1、0.107，均＜0.2，很好地證明了數(shù)據(jù)的可靠性。

圖5 基于相似性＞95%的OTU 水平上非度量多維度分析

采用層次聚類(hierarchical clustering)的分析方法，以等級(jí)樹(shù)的形式展示樣本間的相似度，通過(guò)聚類樹(shù)的分枝長(zhǎng)度衡量聚類效果的好壞。對(duì)Braycurtis 距離矩陣采用UPGMA 算法（即聚類方法為average）在門水平上進(jìn)行聚類分析，見(jiàn)圖6?？梢钥闯?，三江干流的YYJ、FHJ 和YJ 的3 部分采集的樣品中的原核微生物在不同河段呈現(xiàn)出鮮明的聚類效果，說(shuō)明三江干流自上游向下游原核微生物在門水平上有比較明顯的變化，不同流域的原核微生物相似度較高，入?？贑13 處則展示出完全不同的群落組成。位置相近的采樣點(diǎn)的真核微生物的聚類也比較相似，如干流上游方位的C1～C5 點(diǎn)位處樣本之間的相似度很高，但與相對(duì)處于下游方向的點(diǎn)位之間的相似度較低。在支流匯入后的樣品的群落構(gòu)成會(huì)出現(xiàn)比較明顯的變化，如C9 采樣點(diǎn)與其他點(diǎn)位的相似度就相對(duì)較低。

圖6 門水平上的層次聚類分析

2.4 物種組成熱圖

根據(jù)測(cè)序結(jié)果和注釋OTU 數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本間豐度和相似性聚類，構(gòu)建寧波三江干流微生物屬層次物種分類Heatmap 圖譜，以顏色梯度變化表現(xiàn)豐度值的高低，見(jiàn)圖7。使用平均豐度前30 位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖。樣本按照物種組成數(shù)據(jù)的歐式距離(euclidean distance)進(jìn)行UPGMA聚類。

圖7 三江干流微生物屬層次物種分類Heatmap

原核微生物在屬上的Heatmap 圖譜顯示，YYJ 流域樣品中微小桿菌屬(Exiguobacterium) 的豐度最高，次為馬賽菌屬(Massilia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)等；FHJ 流域樣品中豐度最高的屬為新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、砂單胞菌屬(Arenimonas)和短波單胞菌屬 (Brevundimonas)等；YJ 流域樣品中分支桿菌屬(Mycobacterium)、鞘脂菌屬(Sphingobium)和異常球菌屬(Deinococcus)等豐度更高。原核乳桿菌屬(Lactobacillus)、鼠桿菌屬(Muribaculaceae)等只在入?？贑13 處測(cè)得，該處組成與其余點(diǎn)位有明顯的區(qū)別。

真核微生物在屬水平上的Heatmap 圖譜顯示，YYJ 流域樣品中綠藻屬(Pseudomuriella)、麥可屬(Mychonastes) 和海鏈藻屬(Thalassiosira)的豐度最高， FHJ 樣品中囊藻屬(Tetracystis)、 扁藻屬(Tetraselmis)和直鏈藻屬(Aulacoseira)表現(xiàn)出較高的豐度，YJ 樣品中尖尾藻屬(Teleaulax)、隱藻屬(Cryptomonas)相對(duì)豐度較高。入?？贑13 采樣點(diǎn)處測(cè)得銅綠微囊藻屬(Hererocapsa)、小二仙草屬(Haloragis)、劍水蚤屬(Mesocyclops)和赤潮異彎藻屬(Heterosigma)等僅在此點(diǎn)位顯示出較高豐度的真核生物屬。

3 結(jié)論與展望

3.1 結(jié)論

通過(guò)高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)三江干流優(yōu)勢(shì)菌門主要有變形菌門、放線菌門、異常球菌-棲熱菌門和擬桿菌門，真核微生物優(yōu)勢(shì)門包括子囊菌門、甲藻門、綠藻門和硅藻門等，這些均為典型淡水微生物門類，與其他水域微生物群落組成檢測(cè)結(jié)構(gòu)相似[40-42]。如劉峰等[43]發(fā)現(xiàn)汾河入黃口水體中變形菌門、放線菌門和厚壁菌門處于優(yōu)勢(shì)地位，在湖泊水體中變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門也是最主要的5 個(gè)原核生物門類[44]，這些典型的淡水菌門在淡水生態(tài)系統(tǒng)中的廣泛分布已經(jīng)得到研究證實(shí)[45-46]。在三江干流下游異常球菌-棲熱菌門豐度的增加可能意味著該河段受到較多的熱污染影響[45]。在西安渭河、灃河、灞河和浐河的研究中，綠藻和真菌界子囊菌門也是在各類群中的優(yōu)勢(shì)物種[39]，與寧波三江流域真核微生物優(yōu)勢(shì)門一致，個(gè)別點(diǎn)位處（如C4、C9 等處）甲藻門豐度較高可能與溫度的升高或pH 的降低有關(guān)[46]，與原核微生物的優(yōu)勢(shì)菌門中異常球菌-棲熱菌門的出現(xiàn)共同說(shuō)明寧波三江干流受到熱污染的可能性很高。

同時(shí)通過(guò)Beta 多樣性分析也注意到，不同流域微生物群落組成表現(xiàn)出明顯的區(qū)分性，如異常球菌-棲熱菌門、子囊菌門在三江干流的中下游水域豐度更高，而在上游的采樣點(diǎn)C1～C5 處的樣品中豐度較低。厭氧性厚壁菌的出現(xiàn)說(shuō)明存在工業(yè)或生活廢水的排入，已經(jīng)造成水生態(tài)環(huán)境的破壞[47]。入?？谔幩虻奈⑸锝M成也與其他采樣點(diǎn)處明顯不同。由物種組成熱圖發(fā)現(xiàn)，微生物組成在相鄰采樣點(diǎn)間相似性較高，YYJ、FHJ 和YJ 3 組樣品中也有不同的優(yōu)勢(shì)物種，可以作為流域水環(huán)境狀況的指示生物。

Alpha 多樣性分析反映了寧波三江干流流域微生物多樣性的綜合指標(biāo)，自三江干流上游向下游進(jìn)行采樣檢測(cè)，各采樣點(diǎn)水域處的原核微生物豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均較高，YYJ 樣品與FHJ 樣品、YJ 樣品相比較，原核微生物豐富度差異不大，YYJ流域樣品多樣性最高。真核微生物方面，三江干流流域整體原核微生物豐富度與其他流域研究結(jié)果相比偏低，多樣性維持在較高的水平，其中FHJ 樣品的物種豐富度和多樣性相對(duì)更高。自上游至下游微生物的親緣關(guān)系呈現(xiàn)逐漸復(fù)雜化的趨勢(shì)。

3.2 展望

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅就寧波三江干流流域微生物多樣性進(jìn)行表征，水體微生物多樣性受到多種環(huán)境因子的影響，一方面水體微生物多樣性與環(huán)境因子之間的關(guān)系，不同水域所處的地理位置對(duì)于水體微生物群落的影響都值得進(jìn)一步探索。

同時(shí)，水體的微生物作為重要的環(huán)境指示生物也可以作為水生態(tài)環(huán)境現(xiàn)狀的指示，通過(guò)研究流域微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與群落結(jié)構(gòu)，可以為構(gòu)建完善的監(jiān)測(cè)與管理體系提供理論支持。在常態(tài)化生態(tài)監(jiān)測(cè)工作中微生物多樣性的監(jiān)測(cè)與分析工作也具備可行性。通過(guò)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與其驅(qū)動(dòng)因子的研究，可以開(kāi)發(fā)寧波三江干流流域特殊功能菌群，為區(qū)域水環(huán)境治理提供針對(duì)性支持。