• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乳酸乳球菌表達系統(tǒng)及其啟動子的研究進展

    2022-07-02 03:49:38黃琳琳方以誠熊智強艾連中
    食品科學 2022年11期
    關(guān)鍵詞:誘導型球菌乳酸

    王 慧,勞 曉,黃琳琳,方以誠,熊智強,艾連中,宋 馨*

    (上海理工大學健康科學與工程學院,上海 200093)

    乳酸菌是一類革蘭氏陽性、無孢子、G+C含量低的細菌,已被歐洲食品安全局認證為“可用于食品生產(chǎn)的安全微生物”。乳酸乳球菌()是研究乳酸菌的模式菌株,成為繼大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌之后最受關(guān)注的外源基因表達宿主。

    相較大腸桿菌,乳酸乳球菌具有單一的外膜,能夠?qū)⒛康牡鞍字苯臃置诘郊毎猸h(huán)境中,且乳酸乳球菌具有獨特的胞外管家蛋白酶HtrA,僅分泌一種主要的胞外蛋白Usp45,最大限度減少了胞外蛋白水解系統(tǒng)對蛋白質(zhì)的降解,更利于蛋白質(zhì)的下游加工,因此作為細胞工廠被廣泛應(yīng)用,生產(chǎn)具有商業(yè)價值的異源蛋白,如酶、化合物、抗原、過敏原和細胞因子等。

    穩(wěn)定的載體骨架和高效可控的啟動子是保證乳酸乳球菌表達外源蛋白的關(guān)鍵因素,本文主要介紹了乳酸乳球菌表達系統(tǒng),著重關(guān)注表達系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件üü啟動子,詳細闡述啟動子的結(jié)構(gòu)以及啟動子的預(yù)測與分析,總結(jié)新啟動子的克隆方法,最后對乳酸乳球菌啟動子的研究進行展望。以期為深入研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能并進一步在工業(yè)上生產(chǎn)外源蛋白提供參考。

    1 乳酸乳球菌表達系統(tǒng)

    外源基因在乳酸乳球菌中表達的方法有兩種,一種是將其整合到染色體上,進而轉(zhuǎn)錄表達;另一種是將攜帶有外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌中,通過質(zhì)粒復(fù)制表達。根據(jù)上述兩種表達方式,可將乳酸乳球菌表達系統(tǒng)分為整合型及游離型。

    整合型表達系統(tǒng)包括基于質(zhì)粒的同源重組系統(tǒng),基于外源重組酶的單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)重組系統(tǒng)、雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)重組系統(tǒng)等。該類表達系統(tǒng)不需要篩選壓力,外源基因能夠隨基因組穩(wěn)定傳代并表達,但外源基因在基因組上往往是單拷貝,因此表達強度較低。相較于整合型表達系統(tǒng),游離型表達系統(tǒng)能利用獨立自主復(fù)制的質(zhì)粒載體更簡捷地表達外源蛋白。當質(zhì)粒載體進入乳酸乳球菌中后,通過θ復(fù)制或滾環(huán)復(fù)制方式進行自主復(fù)制,目的基因的表達強度由表達載體的拷貝數(shù)決定,表達量會隨拷貝數(shù)的增加而提高,但游離型表達系統(tǒng)需要篩選壓力保持穩(wěn)定,且拷貝數(shù)很大時會增加載體的不穩(wěn)定性,進而影響基因的表達。

    無論是整合型還是游離型表達系統(tǒng),目的基因的穩(wěn)定表達都離不開啟動子元件。根據(jù)啟動子作用方式及功能,可將乳酸乳球菌表達系統(tǒng)分為誘導型啟動子表達系統(tǒng)及組成型啟動子表達系統(tǒng)。

    1.1 誘導型啟動子表達系統(tǒng)

    誘導型啟動子通常驅(qū)動細胞適應(yīng)環(huán)境相關(guān)基因的表達,已知許多脅迫乳酸乳球菌啟動子的條件因素,如噬菌體感染、溫度或pH值變化、特定的糖等。由誘導型啟動子驅(qū)動的基因表達系統(tǒng)即為誘導型啟動子表達系統(tǒng)。

    乳酸乳球菌中應(yīng)用最廣泛的誘導型啟動子表達系統(tǒng)是由荷蘭國家乳品研究所開發(fā)的乳酸鏈球菌素誘導基因表達系統(tǒng)(the nisin controlled gene expression system,NICE)。在NICE系統(tǒng)中,位于膜上的組氨酸激酶NisK感知Nisin的誘導信號并進行自身磷酸化,隨后將磷酸基團轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白NisR上,激活啟動子表達下游基因。Cia?ma等使用NICE系統(tǒng),在Nisin誘導的P調(diào)控下,在乳酸菌分泌型表達載體pNZ8124中合成并克隆了人可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡受體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)cDNA(TRAIL-cDNA)。Feizollahzadeh等以攜帶NICE系統(tǒng)的質(zhì)粒pNZ8149和乳酸乳球菌NZ3900分別作為載體和表達宿主,分泌表達白細胞介素-18。

    NICE系統(tǒng)具有以下優(yōu)點:1)操作簡便、易于使用;2)可嚴格控制、誘導高產(chǎn)表達外源蛋白;3)能減少毒性蛋白的積累、避免細胞死亡。NICE系統(tǒng)的誘導劑、宿主菌和載體都是食品級的,安全可靠,應(yīng)用前景相當廣闊。但Nisin的添加成本較高,且在蛋白的生產(chǎn)過程中(尤其是藥用蛋白)需進行下游提純。

    P170表達系統(tǒng)是乳酸乳球菌中的另一類誘導型表達系統(tǒng),由強誘導型啟動子P170控制。P170是通過轉(zhuǎn)座子誘變篩選而獲得的誘導型啟動子,該啟動子調(diào)控未知功能基因轉(zhuǎn)錄,細菌生長至穩(wěn)定期時,低pH值誘導P170表達上調(diào),進而調(diào)控蛋白表達。與NICE系統(tǒng)相比,P170表達系統(tǒng)通過生長過程中乳酸的積累實現(xiàn)自我誘導,利于下游蛋白的純化,該表達系統(tǒng)已廣泛用于乳酸乳球菌的工業(yè)生產(chǎn)中。雖然該系統(tǒng)的啟動子是一個強誘導型啟動子,但其適宜運作的pH值范圍較狹窄,僅當pH 5.5時才能夠強烈轉(zhuǎn)錄。此外,該系統(tǒng)受培養(yǎng)溫度影響較大,溫度低時活性更強。

    當培養(yǎng)基中鋅含量豐富時,乳酸乳球菌操縱子中的阻遏物與啟動子P結(jié)合,抑制基因轉(zhuǎn)錄,而缺鋅會導致失活,使得RNA聚合酶與P結(jié)合并進一步轉(zhuǎn)錄,研究者依此建立了P誘導表達系統(tǒng)。它基于乳酸乳球菌操縱子,該操縱子編碼緊急Zn吸收ABC轉(zhuǎn)運蛋白及其調(diào)控因子,而Zn可以抑制該轉(zhuǎn)運蛋白的表達。當外源添加乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)時,EDTA減少了培養(yǎng)基中的可用鋅,誘導P啟動,從而激活緊急攝取系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄。雖然通過EDTA可以耗盡Zn從而實現(xiàn)誘導,但這會阻礙需要陽離子的酶的過表達。

    此外,鋅離子濃度調(diào)節(jié)表達系統(tǒng)(zinc-regulated expression system,Zirex)由肺炎鏈球菌P及其編碼調(diào)控蛋白SczA組成,將Nisin誘導的啟動子與鋅誘導的啟動子P結(jié)合,使不同基因在同一乳酸菌細胞中分別以Nisin和ZnSO為誘導劑,同時獨立表達。該系統(tǒng)有利于活性依賴Zn的羊毛硫肽環(huán)化酶及其他金屬酶的過表達。

    除以上所述,乳酸乳球菌誘導表達系統(tǒng)還包括熱休克誘導系統(tǒng)、壓力誘導型表達系統(tǒng)(stress-inducible controlled expression,SICE)、木糖誘導表達系統(tǒng)(xylose-inducible expression system,XIES)、噬菌體?31爆發(fā)式誘導的表達系統(tǒng)、胍丁胺控制表達系統(tǒng)(agmatine-controlled expression,ACE)等。但這些系統(tǒng)大多實用價值不高,因為它們只能在有限范圍內(nèi)可控,效率較低。具體表現(xiàn)在:1)相應(yīng)的誘導劑是必需的營養(yǎng)物或代謝物,其在培養(yǎng)物中的濃度無法完全控制;2)對分解代謝物的抑制非常敏感(如某些糖誘導系統(tǒng));3)誘導表達的啟動子活性會降低;4)操作過程復(fù)雜繁瑣。目前最廣泛使用和最有效的基因表達系統(tǒng)依然是NICE系統(tǒng)。

    1.2 組成型啟動子表達系統(tǒng)

    許多已鑒定的啟動子不受任何調(diào)節(jié)劑或生長條件的控制,結(jié)構(gòu)基因的表達水平通常恒定在一定水平上,具有無時空特異性的特點,被稱為組成型啟動子。在乳酸乳球菌中,已鑒定出一些組成型啟動子,如P、P、P、P以及P、P、P、P,目前已被廣泛應(yīng)用于乳酸乳球菌中表達外源基因(表1)。

    表1 組成型啟動子調(diào)控表達異源蛋白Table 1 Constitutive promoters regulating the expression of heterologous proteins

    盡管組成型啟動子成本較低、易于使用且不受培養(yǎng)基的限制,但與誘導型啟動子相比,其表達強度不高。因此,篩選強組成型啟動子成為近年的研究熱點。

    2 啟動子的結(jié)構(gòu)

    啟動子作為表達系統(tǒng)的一個重要元件,對基因的高水平表達起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。

    原核生物啟動子長度約20~200 bp,轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start site,TSS)上游200 bp到下游100 bp為啟動子的保守區(qū)域。對于典型的原核啟動子,其保守區(qū)域包括TSS、-35區(qū)(Sextama框)、-10區(qū)(Pribnow框)以及間隔區(qū)(指在-10區(qū)和-35區(qū)之間的序列)(圖1)。

    幾乎所有的啟動子TSS上游10 bp處都有一個6 bp的保守序列(TATAAT),即-10區(qū)。另外一個6 bp的保守區(qū)域位于-35區(qū),序列為TTGACA,其堿基的保守性較-10區(qū)低。研究發(fā)現(xiàn),替換-10區(qū)內(nèi)序列比替換-35區(qū)內(nèi)序列對啟動子活性影響更大。然而,相較于間隔區(qū)域的距離差異,序列構(gòu)成并不重要,間隔太小或太大均會不同程度地影響啟動子活性。-35區(qū)和-10區(qū)間的最佳間隔序列為17 bp,也可能小于15 bp或者大于20 bp。另外,-10區(qū)延伸序列、-35區(qū)上游的UP元件、-10區(qū)與TSS的間隔序列等非典型元件都對啟動子的活性有影響(圖1)。

    圖1 原核啟動子核心保守序列Fig.1 Conserved core sequences of prokaryotic promoters

    在基因轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合酶具有重要作用,它能特異性識別啟動子并與之結(jié)合,隨后轉(zhuǎn)錄才能開始。啟動子與RNA聚合酶的親和力越高,啟動子活性越高,基因的表達水平越高。RNA聚合酶由5個亞基構(gòu)成,分別為亞基、亞基、’亞基、亞基和Sigma(σ)因子。σ因子能使RNA聚合酶核心酶識別和結(jié)合到啟動子的TSS上,決定了RNA聚合酶對啟動子序列的特異性,在基因轉(zhuǎn)錄過程中起著關(guān)鍵作用。

    核糖體結(jié)合位點(ribosome binding site,RBS)是位于起始密碼子AUG上游的一段富含嘌呤的DNA序列(AGGAGG),也稱作Shine-Dalgarno(SD)序列。該序列能識別核糖體16S rRNA并與之進行互補配對,促使mRNA與核糖體結(jié)合,從而促進翻譯的起始。目前,并沒有研究揭示乳酸乳球菌的RBS序列,但有研究者假定乳酸乳球菌載體pTRKH的RBS序列為“AAGGAGGT”,通過改變pTRKH質(zhì)粒repDE操縱子的RBS序列來修飾pAMβ1復(fù)制子的拷貝數(shù),從而影響核糖體與mRNA結(jié)合的強度,并最終影響復(fù)制起始蛋白RepE的產(chǎn)生。

    乳酸乳球菌作為典型的原核生物,其啟動子序列遵循原核啟動子的特點。在乳酸乳球菌的啟動子中,大多包含-35區(qū)及-10區(qū)保守序列,與大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的啟動子相似。此外,大約一半的乳酸乳球菌啟動子包含一個-10區(qū)延伸序列,該延伸序列經(jīng)常出現(xiàn)在革蘭氏陽性菌的啟動子中。目前,對乳球乳酸菌σ因子的研究較少,僅鑒定出一個σ因子(σ),由基因編碼。σ與來自枯草芽孢桿菌的σ和來自大腸桿菌的σ具有高度的相似性,表明σ能夠識別并結(jié)合到-35區(qū)序列“TTGACA”和-10區(qū)序列“TATAAT”上。然而,目前尚不清楚缺乏-35區(qū)的啟動子是否被σ識別,或者其他可能存在的σ因子是否參與乳酸乳球菌中啟動子的轉(zhuǎn)錄。

    3 啟動子的預(yù)測及分析

    由于啟動子在基因轉(zhuǎn)錄中的重要作用,準確預(yù)測啟動子位點成為基因表達、模型解釋以及建立和理解遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的必要步驟。為獲得可能的啟動子序列,研究者們通過對啟動子序列堿基偏好、局部保守模塊信息以及啟動子空間構(gòu)象特征、能量分布特征等的研究,進行生物信息學分析,開發(fā)有效的啟動子預(yù)測工具。

    早期,啟動子序列的預(yù)測僅基于各生物特有的核苷酸序列,缺乏足夠大的已知基因樣本庫,進而會產(chǎn)生不準確的預(yù)測結(jié)果。此外,一些基因預(yù)測方法是基于兩個或多個基因組之間的同源性,對于沒有同源性的菌株,這些方法并不適用。隨后,研究人員發(fā)現(xiàn)在所有類型的啟動子中,最突出的特征是上游和下游區(qū)域的DNA雙鏈穩(wěn)定性不同,并提出了一種基于啟動子和非啟動子區(qū)域之間DNA序列穩(wěn)定性差異的原核啟動子預(yù)測方法。利用DNA的物理特性預(yù)測啟動子的方法逐漸受到了廣泛的關(guān)注,SEPro是一種通過研究和利用DNA序列的內(nèi)置結(jié)構(gòu)和能量信息而開發(fā)的啟動子預(yù)測工具,適用于包括古細菌在內(nèi)的所有原核生物。表2列出了部分原核生物啟動子預(yù)測工具。

    表2 原核生物啟動子在線預(yù)測軟件Table 2 Online prediction software for prokaryotic promoters

    現(xiàn)有的預(yù)測軟件大多依據(jù)典型模式生物數(shù)據(jù)庫建立,例如革蘭氏陰性菌啟動子預(yù)測軟件依據(jù)大腸桿菌數(shù)據(jù)庫建立,革蘭氏陽性菌啟動子預(yù)測軟件依據(jù)枯草芽孢桿菌數(shù)據(jù)庫建立。BacPP能夠在線預(yù)測革蘭氏陰性菌的啟動子,其通過識別革蘭氏陰性菌給定序列的σ因子以預(yù)測可能的啟動子序列。

    除對啟動子序列進行準確預(yù)測外,對轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(transcription factor binding site,TFBS)等的預(yù)測分析同樣具有重要意義。用戶能利用在線搜索工具Virtual Footprint通過全基因組搜索以交互方式識別可能的TFBS,并立即獲得有關(guān)啟動子、相應(yīng)基因、操縱子和編碼蛋白的詳細信息。用于預(yù)測原核生物啟動子元件和調(diào)節(jié)子的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器PePPER,可在任何測序的細菌基因組中挖掘調(diào)控子和TFBS,研究者也借此建立了乳酸乳球菌TFBS數(shù)據(jù)庫。

    4 乳酸乳球菌啟動子的克隆

    從乳酸乳球菌和其他乳酸菌中分離克隆啟動子的策略有很多,主要分為啟動子探針質(zhì)粒載體篩選法和克隆法。

    4.1 啟動子探針質(zhì)粒載體篩選法

    啟動子探針載體是指無啟動子,攜帶報告基因、抗性標記和轉(zhuǎn)錄終止子的克隆載體。啟動子探針質(zhì)粒載體法是一種簡單有效而且精準的篩選啟動子的方法。篩選分離啟動子時,用合適的限制性內(nèi)切酶來消化相應(yīng)的基因組DNA,啟動子探針載體也同時用相同的酶進行酶切處理,然后,將酶切處理好的基因組片段和相同方式處理的啟動子探針連接重組,使克隆的片段恰好插在報告基因的上游位置,根據(jù)報告基因的表達與否、表達的強弱來確定啟動子的篩選情況。

    在構(gòu)建探針質(zhì)粒載體中,報告基因的選取至關(guān)重要,一般要求報告基因序列已知,目的蛋白特征清晰,檢測方便快捷,且在宿主中表達時不存在背景干擾。啟動子研究中最常用的報告基因大多是編碼抗生素抗性蛋白的基因,除此之外,還有編碼氯霉素乙?;D(zhuǎn)移酶、-半乳糖苷酶或-葡萄糖醛酸酶的基因以及熒光蛋白基因等。

    利用啟動子探針載體法無需具體的基因核苷酸序列,不用設(shè)計引物即可隨機篩選分離得到大量的啟動子,簡單輕松,但這種方法需要先構(gòu)建一個啟動子探針載體,且后續(xù)篩選工作量較大,既費時又費力,因此主要在早期的啟動子篩選克隆工作中應(yīng)用較多。

    4.2 克隆法

    對于已知序列的啟動子,可以設(shè)計序列特異性引物,通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)克隆獲得基因的啟動子序列。該方法結(jié)合了生物信息學技術(shù)和PCR技術(shù),先用計算機相關(guān)軟件對基因序列進行預(yù)測分析,然后利用PCR技術(shù)獲取已知序列中的啟動子,該方法已逐漸成為獲取啟動子的主要手段。

    利用PCR技術(shù)獲得啟動子的速度快、特異性強,避免了DNA本身連接和環(huán)化的問題,但其對啟動子的預(yù)測和分析要求比較精準。

    5 結(jié) 語

    近年來,研究者通過建立有效的乳酸乳球菌表達系統(tǒng)高效生產(chǎn)異源蛋白,并將其應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)。相比于傳統(tǒng)的大腸桿菌系統(tǒng),對乳酸乳球菌表達系統(tǒng)的研究遠遠落后。

    在進一步發(fā)展和完善乳酸乳球菌表達系統(tǒng)時,完善和擴大乳酸乳球菌載體系統(tǒng)和宿主系統(tǒng)是研究的重點,而在載體系統(tǒng)的改造過程中,啟動子調(diào)控元件是重中之重。未來的研究方向主要有:1)對乳酸乳球菌啟動子結(jié)構(gòu)進行更深入全面的研究,包括其σ因子、核糖體起始位點序列、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點等;2)現(xiàn)有的概念框架尚不足以完全理解啟動子信號的性質(zhì),應(yīng)開發(fā)針對乳酸乳球菌的模型或理論來解釋與啟動子相關(guān)的蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子及配體等在轉(zhuǎn)錄過程中的結(jié)構(gòu)及能量變化;3)提供準確的啟動子預(yù)測對于理解啟動子及RNA聚合酶如何進行轉(zhuǎn)錄過程十分重要,應(yīng)將實驗與計算預(yù)測相結(jié)合,以獲得精準有效的預(yù)測工具。

    啟動子的研究主要集中在兩個方面:1)新型高效可控強啟動子的發(fā)現(xiàn)是滿足工業(yè)生產(chǎn)高要求的最佳措施;2)對現(xiàn)有啟動子的改造。啟動子是控制目的基因表達的開關(guān),對啟動子進行精確的定位,闡明其各部分元件的工作原理及意義,有針對性地加以改造,可使啟動子利用效率最大化。

    從啟動子出發(fā),篩選新的強啟動子元件,構(gòu)建成熟高效的乳酸乳球菌表達系統(tǒng),無論是在理論研究還是實際生產(chǎn)中都有十分重要的意義。

    猜你喜歡
    誘導型球菌乳酸
    一株禽源糞腸球菌的分離與鑒定
    施硅提高玉米抗蚜性的組成型和誘導型生理代謝機制
    老年心力衰竭患者BNP及乳酸水平與心功能的相關(guān)性
    二甲雙胍與乳酸酸中毒及其在冠狀動脈造影期間的應(yīng)用
    試論“信息型”“誘導型”說明文本的翻譯策略
    戲劇之家(2019年4期)2019-03-28 10:50:40
    結(jié)節(jié)病合并隱球菌病的研究進展
    IL-33在隱球菌腦膜炎患者外周血單個核中的表達及臨床意義
    一株副球菌對鄰苯二甲酸酯的降解特性研究
    腹腔鏡手術(shù)相關(guān)的高乳酸血癥或乳酸性酸中毒
    多藥耐藥性腫瘤動物模型的評價
    日本a在线网址| 亚洲av成人一区二区三| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 我要搜黄色片| 欧美日韩乱码在线| 精品久久久久久久末码| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲人成电影免费在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产在线精品亚洲第一网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99国产精品99久久久久| 在线国产一区二区在线| 99国产精品一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av| 国产午夜福利久久久久久| 91字幕亚洲| 免费看a级黄色片| av国产免费在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| а√天堂www在线а√下载| 久久久久久久精品吃奶| 俺也久久电影网| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产97色在线日韩免费| 成人亚洲精品av一区二区| 一本精品99久久精品77| 免费在线观看日本一区| 香蕉久久夜色| 婷婷精品国产亚洲av| 色哟哟哟哟哟哟| 男人舔奶头视频| 一a级毛片在线观看| 美女黄网站色视频| 嫩草影院精品99| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美日韩高清专用| 成年免费大片在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 窝窝影院91人妻| 搞女人的毛片| 国产极品精品免费视频能看的| 好男人电影高清在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品,欧美在线| 亚洲无线在线观看| 国产成人精品无人区| 男插女下体视频免费在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 又爽又黄无遮挡网站| 观看免费一级毛片| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲色图av天堂| 悠悠久久av| 一级毛片女人18水好多| 窝窝影院91人妻| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 少妇丰满av| 在线免费观看的www视频| 露出奶头的视频| 国产成人精品久久二区二区91| 一本久久中文字幕| 很黄的视频免费| 国产成人欧美在线观看| 午夜久久久久精精品| 国产探花在线观看一区二区| netflix在线观看网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产乱人视频| 日本 av在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 一区二区三区激情视频| 国产男靠女视频免费网站| netflix在线观看网站| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一级毛片高清免费大全| 在线国产一区二区在线| 成年版毛片免费区| 色综合亚洲欧美另类图片| 丝袜人妻中文字幕| 成人欧美大片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 中文字幕av在线有码专区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲九九香蕉| 精品久久蜜臀av无| 免费av不卡在线播放| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 18禁国产床啪视频网站| 热99re8久久精品国产| 91在线观看av| 日本五十路高清| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 人妻久久中文字幕网| 岛国在线观看网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产真实乱freesex| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲美女黄片视频| 日韩av在线大香蕉| 久久久久久久久免费视频了| 国产三级在线视频| www.www免费av| 久久久精品大字幕| 日本五十路高清| 18禁美女被吸乳视频| 午夜福利成人在线免费观看| av在线蜜桃| 午夜福利免费观看在线| 99热这里只有精品一区 | 五月玫瑰六月丁香| 国产真实乱freesex| 日韩欧美在线乱码| 亚洲成人精品中文字幕电影| 中国美女看黄片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 香蕉久久夜色| 1000部很黄的大片| 精华霜和精华液先用哪个| 变态另类丝袜制服| 国产亚洲精品久久久com| 久久草成人影院| 国产激情偷乱视频一区二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 18禁美女被吸乳视频| 久99久视频精品免费| 日韩欧美国产在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲av美国av| 欧美在线一区亚洲| 免费在线观看亚洲国产| 九色国产91popny在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日本五十路高清| 麻豆国产97在线/欧美| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜影院日韩av| 久久久久久国产a免费观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品456在线播放app | 欧美日韩综合久久久久久 | 一a级毛片在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 麻豆成人午夜福利视频| 久久人妻av系列| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| av国产免费在线观看| 成在线人永久免费视频| 女警被强在线播放| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品一区二区精品视频观看| 一级a爱片免费观看的视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲成av人片免费观看| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日本黄色片子视频| 国产激情欧美一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 最新中文字幕久久久久 | 国产日本99.免费观看| 成人一区二区视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 男人舔女人下体高潮全视频| 男女之事视频高清在线观看| 99久久国产精品久久久| 成人一区二区视频在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 99re在线观看精品视频| 床上黄色一级片| 成年女人永久免费观看视频| 欧美在线黄色| 亚洲中文av在线| 在线观看午夜福利视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲五月婷婷丁香| 午夜成年电影在线免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品,欧美在线| 久久久久久久精品吃奶| 久久久久国产一级毛片高清牌| 9191精品国产免费久久| 亚洲 国产 在线| 成年女人永久免费观看视频| 国产麻豆成人av免费视频| 少妇的逼水好多| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲最大成人中文| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 最好的美女福利视频网| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 日本 欧美在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一a级毛片在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 婷婷六月久久综合丁香| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久久国产成人精品二区| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一个人免费在线观看电影 | 国产男靠女视频免费网站| 天天添夜夜摸| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 白带黄色成豆腐渣| 精华霜和精华液先用哪个| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲精品456在线播放app | 成人国产一区最新在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲欧美日韩高清专用| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 深夜精品福利| 亚洲精品久久国产高清桃花| 男女那种视频在线观看| 九九在线视频观看精品| 亚洲,欧美精品.| 午夜精品在线福利| 亚洲在线观看片| 亚洲成人久久性| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产欧美日韩一区二区精品| 99精品在免费线老司机午夜| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲中文字幕日韩| 欧美黄色片欧美黄色片| 两性夫妻黄色片| 免费观看精品视频网站| 日韩欧美 国产精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品一区二区三区视频在线 | netflix在线观看网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲九九香蕉| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产黄片美女视频| 国产精品,欧美在线| 久9热在线精品视频| 成人精品一区二区免费| 日本与韩国留学比较| 成人午夜高清在线视频| 级片在线观看| 精品国产亚洲在线| 波多野结衣高清作品| 亚洲人与动物交配视频| 中文资源天堂在线| 美女午夜性视频免费| 久久久久久久精品吃奶| 九色成人免费人妻av| 国产真实乱freesex| 亚洲av成人一区二区三| 在线观看一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产av在哪里看| 欧美在线一区亚洲| av黄色大香蕉| h日本视频在线播放| 深夜精品福利| 香蕉国产在线看| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品人妻1区二区| 欧美zozozo另类| 观看免费一级毛片| 一区二区三区高清视频在线| 淫秽高清视频在线观看| 成年免费大片在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 国产免费av片在线观看野外av| 嫁个100分男人电影在线观看| 免费在线观看日本一区| 午夜免费成人在线视频| 国产高清有码在线观看视频| 国产av一区在线观看免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美激情在线99| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| xxx96com| 欧美日韩黄片免| 在线观看一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 怎么达到女性高潮| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色播亚洲综合网| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美日韩黄片免| 久久久久久大精品| 精品久久久久久成人av| 身体一侧抽搐| 欧美日韩乱码在线| 最新美女视频免费是黄的| 男人舔女人的私密视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 麻豆一二三区av精品| 丁香欧美五月| 黄片大片在线免费观看| 看黄色毛片网站| 欧美在线黄色| 成年人黄色毛片网站| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 精品乱码久久久久久99久播| 无人区码免费观看不卡| 成人国产综合亚洲| 岛国视频午夜一区免费看| 国产69精品久久久久777片 | 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久久久久久久久久黄片| x7x7x7水蜜桃| 国产黄片美女视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费在线观看亚洲国产| 一个人看的www免费观看视频| 天堂动漫精品| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲国产欧美网| 一进一出好大好爽视频| 午夜精品在线福利| 亚洲无线观看免费| 丰满的人妻完整版| 欧美日韩一级在线毛片| 无限看片的www在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 女警被强在线播放| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲av美国av| 国产97色在线日韩免费| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品日产1卡2卡| 色哟哟哟哟哟哟| 偷拍熟女少妇极品色| 最近最新中文字幕大全电影3| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 18禁美女被吸乳视频| 国产成人av激情在线播放| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩欧美免费精品| 国产高清三级在线| 亚洲精品一区av在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲精品av在线| 88av欧美| 国产视频内射| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久国产精品麻豆| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲在线观看片| 国产精品久久久av美女十八| 午夜精品在线福利| 99国产精品一区二区三区| 久久中文看片网| 亚洲一区高清亚洲精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产高清有码在线观看视频| 免费观看精品视频网站| 搡老岳熟女国产| 午夜免费激情av| 亚洲午夜理论影院| 免费电影在线观看免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人国产一区最新在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩欧美在线乱码| 91麻豆精品激情在线观看国产| 女人被狂操c到高潮| 国产极品精品免费视频能看的| 一夜夜www| 国产探花在线观看一区二区| 在线观看一区二区三区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 激情在线观看视频在线高清| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日韩欧美在线二视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 天堂动漫精品| 亚洲avbb在线观看| 久久精品人妻少妇| 久久久久九九精品影院| 天天一区二区日本电影三级| 黄色女人牲交| 国产69精品久久久久777片 | 精品欧美国产一区二区三| 成人国产综合亚洲| 淫秽高清视频在线观看| 国产综合懂色| 国产真人三级小视频在线观看| 国产成人aa在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲av熟女| 午夜日韩欧美国产| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产av在哪里看| av女优亚洲男人天堂 | 久久性视频一级片| 国产精品一区二区精品视频观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品野战在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美中文综合在线视频| 精品人妻1区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 婷婷亚洲欧美| 香蕉丝袜av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲激情在线av| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲 国产 在线| 99在线视频只有这里精品首页| 麻豆成人av在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲熟妇熟女久久| 男女那种视频在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 好男人在线观看高清免费视频| 久久国产精品影院| 免费搜索国产男女视频| 9191精品国产免费久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲人成电影免费在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩欧美在线二视频| 久久久久久久久久黄片| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲七黄色美女视频| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜精品在线福利| 国产三级在线视频| www.熟女人妻精品国产| 久久香蕉国产精品| 亚洲最大成人中文| 青草久久国产| 91字幕亚洲| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美又色又爽又黄视频| 国产成人av教育| 免费在线观看影片大全网站| 久久性视频一级片| av福利片在线观看| av视频在线观看入口| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲中文av在线| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久这里只有精品中国| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 岛国视频午夜一区免费看| 日韩欧美在线乱码| 亚洲国产欧美一区二区综合| 日韩欧美 国产精品| 性欧美人与动物交配| 他把我摸到了高潮在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 色播亚洲综合网| av在线蜜桃| 性欧美人与动物交配| 香蕉av资源在线| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美激情在线99| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 99精品久久久久人妻精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美日韩一级在线毛片| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美一级a爱片免费观看看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲熟女毛片儿| 国产日本99.免费观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 婷婷亚洲欧美| 成人性生交大片免费视频hd| 色噜噜av男人的天堂激情| 中文字幕久久专区| а√天堂www在线а√下载| 久久精品91蜜桃| 国产97色在线日韩免费| 亚洲,欧美精品.| 欧美乱码精品一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久伊人香网站| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲色图av天堂| 可以在线观看的亚洲视频| 一a级毛片在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 搡老妇女老女人老熟妇| av在线蜜桃| 91麻豆av在线| 亚洲精品美女久久av网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美乱妇无乱码| 国产成人系列免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲一区二区三区色噜噜| 又爽又黄无遮挡网站| 在线永久观看黄色视频| 久久热在线av| 九色成人免费人妻av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 露出奶头的视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久中文字幕一级| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日日干狠狠操夜夜爽| 成年版毛片免费区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久性视频一级片| 我的老师免费观看完整版| 成人性生交大片免费视频hd| 999久久久国产精品视频| 国内精品久久久久久久电影| 村上凉子中文字幕在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产不卡一卡二| 制服人妻中文乱码| 香蕉av资源在线| 九色国产91popny在线| 国产高清视频在线观看网站| 窝窝影院91人妻| 久久久精品欧美日韩精品| 国产免费男女视频| 久久亚洲真实| 亚洲电影在线观看av| 一级作爱视频免费观看| 男女午夜视频在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产不卡一卡二| 在线播放国产精品三级| 国产成年人精品一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 最近视频中文字幕2019在线8| 一个人看视频在线观看www免费 | a在线观看视频网站| 悠悠久久av| 在线看三级毛片| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 伦理电影免费视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 亚洲成人久久性| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 搡老岳熟女国产| av黄色大香蕉| 变态另类丝袜制服| 亚洲无线观看免费| 中亚洲国语对白在线视频| 不卡一级毛片| 国内精品久久久久久久电影| av国产免费在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 波多野结衣巨乳人妻| 18禁美女被吸乳视频| 国产乱人伦免费视频| 91久久精品国产一区二区成人 | 中文字幕高清在线视频| av在线天堂中文字幕| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久性视频一级片| www.自偷自拍.com| 成人三级做爰电影| 色吧在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩有码中文字幕| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区|