加工誘導(dǎo)形成的食源性熒光碳點研究進展

喬鳳至，侯 率，譚明乾*

（大連工業(yè)大學(xué)食品交叉科學(xué)研究院，食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，海洋食品精深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

食源性熒光碳點（food-borne fluorescent carbon dots，F(xiàn)FCDs）是一類具有熒光特性的以碳為主要成分的點狀納米粒子，其主要是食品組分在物理加工如加熱和微波等作用下發(fā)生復(fù)雜物理化學(xué)變化而形成的新型三維納米結(jié)構(gòu)，其尺寸一般從小于1 nm到幾十納米不等。在經(jīng)加工處理過的面包及焦糖、烤制的肉類、面包皮、烤漢堡、烤披薩、黃花魚罐頭等固體食品及茶、商業(yè)化飲料、啤酒、熟醋、蜂蜜、牛肉湯等液體食品中都發(fā)現(xiàn)存在FFCDs。大部分天然食品原料中含有糖類、蛋白質(zhì)等成分，在加工誘導(dǎo)過程中不斷自我鈍化最終形成納米級碳點。FFCDs不僅來源廣泛，簡單易得，而且制備方法多樣，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。從物性方面來說，F(xiàn)FCDs具有納米級的尺寸及高通透性，表面含有大量的羥基、羧基等親水性官能團，還具有激發(fā)波長依賴性及較好的pH值穩(wěn)定性等特點。在功能特性方面，F(xiàn)FCDs因其優(yōu)良的性質(zhì)，在生物傳感成像、食品組分分析、藥物遞送載體、防偽驗證、熒光靶向示蹤、印刷噴繪等多個領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，有望成為無機納米粒子的良好替代品。通常，F(xiàn)FCDs普遍存在于日常加工的食物中，由于其尺寸效應(yīng)和高通透性，能隨飲食進入人體胃腸內(nèi)，它在人體內(nèi)的消化及吸收過程如何，以及是否會引發(fā)安全性等一系列問題，都需要更深入的研究驗證。

雖然FFCDs在加工食品中是普遍存在的，但其物化性質(zhì)、生物效應(yīng)以及長期攝入人體的安全性等仍存在許多問題，揭示FFCDs的生物效應(yīng)機制和安全性等仍需要進行大量的研究工作。王秋月、劉文、Huang、Liu Mengli等曾發(fā)表過側(cè)重于食品源碳點制備和應(yīng)用方面的綜述，這些綜述旨在總結(jié)以食品成分為原料制備熒光碳點用于熒光傳感等方面的應(yīng)用，而有關(guān)食品加工誘導(dǎo)產(chǎn)生的FFCDs的系統(tǒng)性論述尚屬空白，所以本文重點圍繞關(guān)于FFCDs的發(fā)現(xiàn)、提取及形成機制、理化性質(zhì)、生物效應(yīng)與安全性方面進行綜述。

1 食品加工中FFCDs的發(fā)現(xiàn)與提取

以來源豐富、價格低廉、環(huán)境友好且安全可靠的食物或食品為原料加工誘導(dǎo)形成FFCDs，不僅操作簡單，而且符合當(dāng)前人們所倡導(dǎo)的綠色化學(xué)理念。當(dāng)食品原料經(jīng)過烤制、高壓煮制、水熱、微波等加工處理條件后，其內(nèi)部含有的蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物等物質(zhì)會發(fā)生復(fù)雜的物化反應(yīng)（如酯化、羰基化和焦糖化），從而導(dǎo)致水分損失、變性和氧化等，并進一步縮聚成納米級的FFCDs，而不同加工方式誘導(dǎo)食品產(chǎn)生的FFCDs理化性質(zhì)及應(yīng)用也略有差異。未經(jīng)加工處理的食品原料本身不含有FFCDs，因此，加工誘導(dǎo)是FFCDs形成的必要條件。關(guān)于食品熱加工誘導(dǎo)產(chǎn)生FFCDs最早可追溯到2012年，Sk等發(fā)現(xiàn)在面包、棕櫚糖和焦糖等熱加工食品中存在粒徑在4～30 nm之間的不定形FFCDs，它們具有紫外光激發(fā)下發(fā)射熒光的特性。一般來說，F(xiàn)FCDs的分離純化手段依據(jù)原料種類不同而略有差異。FFCDs可以直接利用乙醇等溶劑提取，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)富集濃縮，除去醇不溶性的蛋白質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)，然后采用氯仿或乙酸乙酯等有機溶劑繼續(xù)多次萃取，以去除脂類雜質(zhì)，最后利用D101大孔樹脂柱、Sephadex G-25凝膠過濾色譜柱及C反相色譜柱等進一步除掉醇溶性蛋白、無機鹽和生物小分子等，獲得相對純凈的FFCDs。

2 FFCDs的形成機制

天然的食物原料作為人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，是一種包含了碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)、水和礦物質(zhì)等多組分的復(fù)雜體系。不同來源食物的基質(zhì)組分含量、種類和加工方式各不相同，導(dǎo)致FFCDs的形成機制也存在差異，幾種具有代表性的研究實例如下。

De等以香蕉汁中的碳水化合物和VC充當(dāng)碳源，在水熱條件下，不同碳水化合物發(fā)生水解、脫水和分解，產(chǎn)生可溶性化合物，然后發(fā)生聚合和縮合，轉(zhuǎn)變成不同的可溶性聚合物，進而通過環(huán)化加成反應(yīng)進行芳構(gòu)化和碳化。最后，這些聚合物團簇在過飽和點的臨界濃度下成核，最后形成FFCDs。李欣彤等研究發(fā)現(xiàn)牛奶和雞蛋清中的蛋白質(zhì)在水熱條件下與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，進一步形成FFCDs。蛋白質(zhì)的氨基與葡萄糖羰基之間發(fā)生羰氨反應(yīng)，然后引發(fā)后續(xù)的縮合、環(huán)化和聚合等，從而產(chǎn)生具有共軛結(jié)構(gòu)的FFCDs。Zhang Zehui等提出了利用蛋清中的蛋白質(zhì)基于水熱合成FFCDs的可能機制，在水熱處理的初期，蛋清中的蛋白質(zhì)先被水解成小的低分子質(zhì)量的肽和氨基酸，然后氨基酸部分聚合并碳化形成被許多低聚物包被的碳核。隨著反應(yīng)的進行，碳核逐漸變大，而外部低聚物則逐漸減少或消失，最終產(chǎn)生了帶有大量羥基和羧基官能化的氮摻雜的FFCDs。Edison等報道了利用歐洲甜櫻桃果提取物水熱形成FFCDs，主要是利用櫻桃果提取物中的葡萄糖和蘋果酸，經(jīng)過脫水、聚合、碳化/芳構(gòu)化和鈍化等一系列復(fù)雜的過程得到FFCDs。2018年，Bi Jingran等對源自烤海鰻魚中的FFCDs形成機制進行了探討，提出其主要包括聚合、熱解、核化、生長、聚集及成核等多個階段。海鰻魚中富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物等，在受熱早期（160 ℃條件下），魚肉中的組分發(fā)生涉及熱誘導(dǎo)聚合、脂質(zhì)氧化及熱解等多種反應(yīng)，形成大尺寸不規(guī)則的異質(zhì)聚合物。隨著烤制溫度升高至200 ℃，聚合物不斷通過熱分解，同時通過美拉德反應(yīng)等產(chǎn)生碳核并進一步形成自組裝納米結(jié)構(gòu)。當(dāng)溫度升高到230 ℃時，熱分解與碳化反應(yīng)繼續(xù)增強，碳核不斷增多。直至烤制溫度至260 ℃，高溫導(dǎo)致碳碳鍵斷裂，形成較多的FFCDs。最后當(dāng)烤制溫度達到300 ℃，形成了均勻單分散的FFCDs。2019年，Geng Jiaxin等在高壓煮制的牛肉湯中提取出FFCDs，研究30、50 min與70 min煮制時間對納米顆粒的粒徑的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)時間越長，最終得到的FFCDs粒徑越小，且70 min高壓煮制牛肉湯中的FFCDs具有最長的熒光壽命與熒光量子產(chǎn)率，說明可能是持續(xù)的高溫反應(yīng)加劇了碳核的收縮。

綜上，由于食物原料的差異性、營養(yǎng)組分的多樣性、加工過程的復(fù)雜性等，F(xiàn)FCDs的形成機制既存在共性的一面，也存在一定的差異。

3 FFCDs的性質(zhì)

3.1 形貌、結(jié)構(gòu)與尺寸特征

納米級的FFCDs總體呈現(xiàn)分散性較好的類球形結(jié)構(gòu)，粒徑一般在10 nm以下，但也有部分可以達到幾十納米。X射線衍射圖譜顯示絕大部分FFCDs主要在2＝20°附近存在一個較寬的單峰，例如以脫水香菇和豬皮為原料經(jīng)加工處理獲得的FFCDs的X射線衍射峰2分別為20.5°和23.8°，從烤鴨肉和烤披薩中提取的分別為23.36°和20.7°，表明FFCDs主要為無定形的非晶結(jié)構(gòu)。通過對高分辨率透射電鏡進一步分析顯示，F(xiàn)FCDs可能存在無定形與晶格兩種形貌結(jié)構(gòu)。拉曼光譜則顯示FFCDs由sp雜化和sp雜化的碳原子組成。FFCDs的結(jié)構(gòu)與粒徑可能取決于它形成過程中的條件，尤其是原材料、加工方式、處理溫度、時間等。Li Yao等研究了不同烤制溫度對烤牛肉餅中提取的FFCDs性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)在相對較低的溫度（220 ℃）下，形成的FFCDs粒徑相對較大，隨著烤制溫度的提高（260 ℃和300 ℃），碳化程度不斷加深，形成的FFCDs粒徑逐漸減小，并可以觀察到清晰的晶格條紋，推測FFCDs具有明顯的晶格結(jié)構(gòu)。

3.2 元素組成及表面官能團

FFCDs通常由碳、氧、氫等元素組成，其中尤以碳含量最高，由于FFCDs來源于加工食品，因此部分也會摻雜氮和硫等元素。Zhou Jiaojiao等利用X射線光電子能譜分析顯示，西瓜皮經(jīng)水熱誘導(dǎo)形成的FFCDs中，碳元素占比64.65%，之后依次為氧26.55%、氫7.67%及氮1.13%。Cong Shuang等從烤鴨肉中提取純化的FFCDs中碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達70.48%，并含有少量硫元素（1.11%）。FFCDs表面含有如羧基、氨基和羥基等種類豐富的官能團，這些基團的存在既賦予了其優(yōu)良的親水性和熒光特性，也增加了FFCDs與其他體內(nèi)生物物質(zhì)相互作用的可能性。Wang Haitao等從啤酒中純化出FFCDs的傅里葉變換紅外光譜圖主要在4個位置出現(xiàn)吸收峰，分別對應(yīng)—NH/üOH、—CH—、—COOH及—C＝C—，通過進一步分析高分辨率X射線光電子能譜，顯示FFCDs存在—C＝C—、—CüC—、—CüN—、—Cü

O—、—C＝O、—NH、—OüH、*O＝CüO、O＝CüO*等特征峰，證實了啤酒FFCDs表面有大量活躍官能團的存在。Wang Nanying等還利用核磁共振氫譜分析了從烤牛肉中提取的FFCDs可通過羥基和氨基等與Fe發(fā)生螯合反應(yīng)，提示了FFCDs作為納米載體在開發(fā)微量元素補充劑方面的潛力，同時用于對Fe離子的檢測。Miao Hong等發(fā)現(xiàn)以番茄汁為前體材料獲得的FFCDs，表面羧基、羥基含量較高，通過π-π堆積作用吸附癌胚抗原適配體，從而用于腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原的檢測。

3.3 熒光特性

熒光特性是FFCD最突出的理化性質(zhì)之一，目前已經(jīng)報道的FFCDs主要以藍色熒光和綠色熒光為主，也有少量表現(xiàn)出黃色熒光（表1）。一般來說，F(xiàn)FCDs的熒光發(fā)射光譜會隨著激發(fā)波長的增加而紅移，即具有典型的激發(fā)波長依賴性。某些FFCDs還具有上轉(zhuǎn)換熒光性質(zhì)，屬于反斯托克斯熒光發(fā)光（發(fā)射波長比激發(fā)波長短），例如，Alam等以卷心菜為原料通過水熱法產(chǎn)生的FFCDs，當(dāng)激發(fā)波長在600～800 nm時，在485 nm附近的發(fā)射波長處產(chǎn)生強烈的上轉(zhuǎn)換熒光。關(guān)于FFCDs熒光性質(zhì)產(chǎn)生機制的主要觀點包括表面態(tài)、量子約束效應(yīng)及分子熒光等。

表1 FFCDs的性質(zhì)與應(yīng)用Table 1 Properties and applications of FFCDs

續(xù)表1

熒光量子產(chǎn)率（quantum yield，QY）作為衡量FFCDs熒光特性的重要參數(shù)，它的值越大說明熒光性發(fā)射能力越強。熒光量子產(chǎn)率與原材料和反應(yīng)條件密切相關(guān)，一般采用硫酸奎寧和羅丹明6G等為參比物進行參比測定，例如從茶、速溶咖啡、飲料、啤酒、陳醋、蜂蜜、牛肉湯等液體食品中提取的FFCDs，QY都低于10%，而烤牛肉中FFCDs的QY則可以達到40%。Bi Jingran等研究了不同烤制溫度（160～300 ℃）對烤海鰻魚FFCDs QY的影響。隨著溫度升高，QY從最低的12.86%增至80.16%。此外，熒光壽命是熒光物質(zhì)在激發(fā)態(tài)的統(tǒng)計平均停留時間，通常FFCDs的熒光壽命為納秒級別。

FFCDs可以經(jīng)過不同加工手段誘導(dǎo)產(chǎn)生，其理化性質(zhì)和應(yīng)用并不完全相同（圖1）。FFCDs的熒光穩(wěn)定性對其后續(xù)細(xì)胞及體內(nèi)器官分布示蹤至關(guān)重要，目前的報道主要集中在FFCDs存儲時間、紫外光、離子強度、pH值、金屬離子對穩(wěn)定性影響等方面（表1）。研究表明，F(xiàn)FCDs具有良好的貯存穩(wěn)定性。Bi Jingran等從烤海鰻魚中純化出FFCDs，在常溫放置一個月后，F(xiàn)FCDs的熒光強度無明顯下降。利用微波處理菠蘿蜜種子后得到氮摻雜FFCDs，其熒光強度在室溫長期貯存180 d內(nèi)同樣無顯著變化。另外，F(xiàn)FCDs具有良好的抗光漂白特性，無論是從烤披薩還是烤鴨肉中提取的FFCDs，在最大激發(fā)光波長連續(xù)照射30 min條件下，未見熒光強度有明顯改變。因原料和加工處理條件的差異，F(xiàn)FCDs對溶液離子強度與pH值的耐受性并不完全相同。來源于烤海鰻魚的FFCDs在高達2 mol/L的NaCl濃度下，熒光強度依然很穩(wěn)定。而在NaCl濃度僅為1 mol/L時，從200 ℃烤制鴨肉中純化的FFCDs的熒光強度出現(xiàn)了明顯波動，從100%降至73.16%，但300 ℃純化的FFCDs卻依然穩(wěn)定?？九_中FFCDs的熒光呈現(xiàn)明顯的pH值依賴性，在近中性較穩(wěn)定，在酸性和堿性條件下則部分淬滅。來源于扁紅豆的FFCDs在不同pH值（3～13）溶液中的熒光強度幾乎相同。而南瓜來源的磷氮共摻雜的黃色熒光FFCDs，其熒光強度隨pH值從1.5變化到7.4逐漸增強，且在pH值范圍為4.7～7.4內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。對于金屬離子這一因素來說，大部分FFCDs熒光穩(wěn)定性幾乎不會受到如Mn、Fe、Zn、Mg、Ca等多數(shù)金屬離子的影響，但有很多容易被Fe離子淬滅，另有少數(shù)則對Hg、Au或Ag敏感，因此FFCDs可用于檢測食品包裝或食品中某些金屬離子的含量是否超標(biāo)。

圖1 利用幾種典型的加工方式從食品中（烤海鰻魚[25]、菠蘿蜜種子[48]、速溶咖啡[40]、龜殼[49]）誘導(dǎo)產(chǎn)生FFCDs的部分理化性質(zhì)及應(yīng)用Fig.1 Physicochemical properties and applications of FFCDs induced by different processing methods from foods (roasted pike eel[25], jackfruit seeds[48], instant coffee[40] and turtle shell[49])

4 FFCDs的生物效應(yīng)與安全性

FFCDs是食品營養(yǎng)組分經(jīng)過外界物理場加工衍生而來，人們關(guān)心它經(jīng)口服進入體內(nèi)胃腸后，是否會對機體產(chǎn)生正面或負(fù)面的影響。雖然理論上相比傳統(tǒng)的無機或金屬等納米材料具有更好的生物相容性，但是其結(jié)構(gòu)相較于加工前發(fā)生了很顯著變化，表現(xiàn)出納米級物質(zhì)獨有的一些特點，如超小尺寸、高比表面積、高催化特性、較強的滲透和通過性質(zhì)等，因此非常有必要對FFCDs的生物效應(yīng)與安全性進行深入系統(tǒng)的討論與研究。目前這部分的研究尚處于起步階段，以后仍有大量的工作有待于開展。

4.1 體外模擬消化

現(xiàn)階段，體外消化模型因其簡單、廉價、可重復(fù)性高、可實現(xiàn)多樣本同時檢測等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于藥物劑型分解、營養(yǎng)成分生物利用度、物質(zhì)消化等研究中，同時，還可監(jiān)測機體胃腸道對食物或藥物的消化行為、消化部位等。一般來說，F(xiàn)FCDs隨食物經(jīng)口攝入后，首先需要克服胃腸道屏障才能到達循環(huán)系統(tǒng)，而胃腸道復(fù)雜的消化環(huán)境可能會造成FFCDs形貌、結(jié)構(gòu)、溶解性等理化性質(zhì)的改變。通常采用體外模型來模擬體內(nèi)消化環(huán)境，常用的包括靜態(tài)模型和動態(tài)模型，多數(shù)研究集中在靜態(tài)模型。Li Shen等分別用人工唾液（pH 6.5，5 min）、胃液（pH 2，120 min）和十二指腸膽汁液（pH 8，120 min）模擬源自可口可樂FFCDs在口腔、胃和腸道的消化過程，在連續(xù)處于人工唾液、胃液和十二指腸膽汁液的環(huán)境中分別約有69.97%、23.28%和6.23%的熒光發(fā)生淬滅。Wang Haitao等利用類似的方法對雪花啤酒中的FFCDs研究結(jié)果顯示，F(xiàn)FCDs的熒光強度在胃液中猝滅率最高，為65.2%，唾液和腸液中猝滅率相對較低，但消化后仍可見熒光信號，這有助于對FFCDs的后續(xù)追蹤。Song Yukun等同樣發(fā)現(xiàn)烤三文魚中FFCDs的熒光強度受唾液影響較小而受胃腸液影響較大，并通過進一步的探究發(fā)現(xiàn)FFCDs與胃蛋白酶和胰蛋白酶等胃腸道消化酶存在相互作用，從而對酶的活性產(chǎn)生抑制作用（圖2A）。

4.2 吸收、分布、代謝與排泄的特點和規(guī)律

研究FFCDs在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄（adsorption, distribution, metabolism and excretion，ADME）過程的特點和規(guī)律，對于FFCDs的生物安全性評價和體內(nèi)應(yīng)用至關(guān)重要，目前研究者們主要通過監(jiān)測熒光信號來研究其ADME過程。Song Yukun等利用大鼠翻轉(zhuǎn)腸囊模型，將不同質(zhì)量濃度來自烤三文魚的FFCDs置于腸囊內(nèi)側(cè)，然后從腸囊外側(cè)取樣檢測其熒光強度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FFCDs的熒光強度隨FFCDs質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，且高濃度轉(zhuǎn)運速率強于低濃度，證實FFCDs可以被小腸吸收從而進入血液循環(huán)系統(tǒng)。Zhao Xue等利用尤斯室模型體外模擬研究烤豬肉FFCDs在小鼠小腸中的滲透吸收情況，結(jié)果表明其透過量和累積透過量隨時間延長而增加，且具有濃度依賴性效應(yīng)，濃度越大，上升越明顯，而表觀滲透系數(shù)隨時間延長則先急劇下調(diào)再緩慢上升，由此推測FFCDs以被動轉(zhuǎn)運的方式透過腸黏膜被吸收。大量體外細(xì)胞攝取實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)FCDs能進入細(xì)胞并被攝取利用，一部分FFCDs分布于細(xì)胞質(zhì)，也有部分在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)皆有分布，胞內(nèi)分布的差異不僅與FFCDs的來源有關(guān)，也可能與FFCDs的使用濃度有關(guān)（圖2B）。

圖2 食源性熒光碳點的生物效應(yīng)Fig.2 Biological effects of FFCDs

Song Yukun等通過BALB/c小鼠灌胃結(jié)合活體熒光成像實驗對源自烤三文魚的FFCDs在小鼠體內(nèi)各器官的分布情況進行了分析（圖2C），發(fā)現(xiàn)小鼠的小腸、胃、腎、肝和腦的熒光強度陸續(xù)達到最大值，但肺部的熒光強度卻幾乎沒有變化，表明FFCDs能夠代謝到除肺部以外的多個器官中。值得注意的是，在小鼠的腦內(nèi)也能觀測到FFCDs的熒光信號增強，因此FFCDs能夠穿過血腦屏障，在小鼠的腦部分散。值得注意的是，小鼠在灌胃24 h后，各個主要臟器的熒光信號強度皆回到正常水平，推斷FFCDs有可能被代謝出小鼠體外?；谕瑯拥姆椒ǎ琇i Shen和Wang Haitao等分別發(fā)現(xiàn)從可樂和啤酒中提取的FFCDs皆能夠代謝分布于小鼠的腸、肝和腦，而在肺和腎臟等器官則沒有檢測到明顯的熒光強度變化，但Zhao Xue等發(fā)現(xiàn)烤豬肉FFCDs在小鼠的心臟、腎臟、大腦、腸、肺、胃、肝和睪丸等多個器官皆有分布。有研究發(fā)現(xiàn)，分別將來自烤鴨和烤披薩的FFCDs摻雜在大腸桿菌OP50中喂食野生型秀麗隱桿線蟲后，在線蟲的腸道中皆觀察到明亮的藍色熒光，F(xiàn)FCDs被線蟲吸收后大部分分布在腸道內(nèi)?？傊?，F(xiàn)FCDs自身獨具的熒光特性為體內(nèi)體外的熒光成像提供了可能，但是深入追蹤其體內(nèi)分布及代謝途徑，闡明其在人體內(nèi)的消化過程及代謝的途徑仍是一項挑戰(zhàn)。

4.3 與生物分子的相互作用

FFCDs通過羥基、羧基等基團或不飽和鍵等表面結(jié)構(gòu)，與大分子蛋白、小分子氨基酸或金屬離子之間發(fā)生相互作用力而結(jié)合成健，為進一步遞送功能性營養(yǎng)因子提供了可能。

當(dāng)納米粒子進入生物系統(tǒng)后，會接觸到蛋白質(zhì)一類的具有生物活性的大分子物質(zhì)，納米粒子的表面不斷迅速吸附蛋白質(zhì)并被迅速覆蓋，形成一層或多層冠狀結(jié)構(gòu)，稱之為蛋白冠。據(jù)報道，F(xiàn)FCDs能與血漿中的人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）主要通過靜電作用自發(fā)結(jié)合，并且會導(dǎo)致HSA內(nèi)源性熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，圓二色譜結(jié)果進一步表明FFCDs還會導(dǎo)致HSA構(gòu)象的改變。HAS的結(jié)構(gòu)存在兩個結(jié)合位點，分別是位點I（亞結(jié)構(gòu)域IIA）和位點II（亞結(jié)構(gòu)域IIIA）。利用華法林和布洛芬競爭（位點特異性標(biāo)記試劑）的實驗表明，烤雞胸肉中的FFCDs主要與位點I結(jié)合（圖2D），而來源于烤三文魚中的FFCDs則與位點I和位點II皆有結(jié)合。FFCDs與蛋白質(zhì)相互作用形成蛋白冠后還會影響FFCDs的生物毒性。Song Yukun等對烤三文魚FFCDs與HSA的深入研究發(fā)現(xiàn)，蛋白冠的形成可以降低FFCDs的細(xì)胞毒性，促使細(xì)胞能量代謝由糖酵解向有氧呼吸轉(zhuǎn)變，并減緩FFCDs引起糖代謝和脂代謝的紊亂。另有研究表明FFCDs還能與神經(jīng)遞質(zhì)（多巴胺）以及消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）等蛋白相互作用。FFCDs作為遞送載體能與鋅、鐵離子等發(fā)生螯合，拓寬了微量元素補充劑的開發(fā)途徑。Geng Jiaxin等研究表明FFCD與Zn主要通過與氨基氮原子（NüH）和羧基（—COOH）或羥基（OüH）氧原子結(jié)合。Wang Nanying等比較了從不同烤制溫度、時間的牛肉中純化出的FFCDs與鐵的螯合率，可能由于隨著焙燒時間延長，F(xiàn)FCDs表面的羥基數(shù)量減少，導(dǎo)致與鐵的螯合率降低。

4.4 抗氧化作用

自由基是機體正常細(xì)胞代謝產(chǎn)生的一種代謝物和信號分子，主要包括ROS自由基和活性氮自由基，這些自由基含有未成對電子，使它們易于與其他分子反應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為氧化。而當(dāng)自由基過量存在并超過體內(nèi)抗氧化防御機制所能清除的水平時，就會引起機體氧化應(yīng)激，進而導(dǎo)致機體衰老及癌癥，以及心血管類疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病和神經(jīng)衰退性疾病等疾病的發(fā)生。研究表明，以姜汁為原料水熱合成的FFCDs和從面包皮中提取的FFCDs會導(dǎo)致胞內(nèi)ROS水平升高。但另有研究顯示，F(xiàn)FCDs能夠通過清除自由基而發(fā)揮抗氧化作用。Sachdev等利用吸光度法證實以香菜葉為原料水熱合成的FFCDs能夠明顯清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基。Huang Gang等利用類似的方法發(fā)現(xiàn)以富含酚類成分的甘蔗糖蜜為原料水熱合成的FFCDs同樣能夠有效清除DPPH自由基，并推測FFCDs的這種抗氧化作用與其表面的酚羥基有關(guān)。Li Jiaqi等利用電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）技術(shù)證實從烤鯖魚中純化的FFCDs對由芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基和由亞甲藍可見光光敏反應(yīng)產(chǎn)生的甲基自由基皆具有明顯清除效果。Wang Haitao等同樣利用ESR技術(shù)證實烤羊肉FFCDs能夠有效清除羥自由基和DPPH自由基，且發(fā)現(xiàn)這種清除能力與烤制溫度有一定的相關(guān)性，烤制溫度越高自由基清除能力也相對越好，并進一步利用HO誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激結(jié)合測定細(xì)胞活力的系列實驗證實，F(xiàn)FCDs對細(xì)胞氧化損傷起到一定的保護作用。Das等通過高錳酸鉀還原實驗、DPPH自由基清除以及細(xì)胞水平的羥自由基清除實驗和超氧化物活性抑制實驗等證實了以海棗糖蜜為原料利用微波法合成的FFCDs具有較好的抗氧化作用，并推測其對自由基的清除作用依賴于表面富含的能夠充當(dāng)質(zhì)子供體的羥基、醛基和酮基等活性基團（圖2E）。

4.5 細(xì)胞毒性

細(xì)胞作為人體結(jié)構(gòu)和生理功能的基本單位，其活力能在一定程度上反映機體的變化，是研究FFCDs的常用評價體系。大量研究表明，F(xiàn)FCDs可以被細(xì)胞攝取，目前針對FFCDs細(xì)胞毒性作用的研究主要集中在FFCDs對細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞能量代謝等方面。

細(xì)胞活力測定是細(xì)胞毒理學(xué)檢測中最常用的一個指標(biāo)，常用的細(xì)胞活力檢測方法包括MTT法、WST-1法、細(xì)胞毒性實驗（cell counting kit-8，CCK-8）以及實時細(xì)胞分析（real-time cell analysis，RTCA）法等，前3種方法屬于細(xì)胞終點代謝物的檢測法，而RTCA法則是基于細(xì)胞實時無標(biāo)記動態(tài)檢測原理進行的。利用MTT法，以小鼠胚胎成骨細(xì)胞系MC3T3-E1為模型，Bi Jingran等評價了從烤海鰻魚中提取的FFCDs對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度高達20 mg/mL的FFCDs處理24 h時，小鼠成骨細(xì)胞活力沒有明顯的改變，而Li Yao等則考察了不同烤制溫度的烤漢堡FFCDs對小鼠成骨細(xì)胞活力的影響，采用220、260 ℃和300 ℃烤制形成的FFCDs（質(zhì)量濃度3.2 mg/mL）處理小鼠成骨細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活力分別下降約5%、15%和21%，推測高溫烤制會通過增加碳化程度增強FFCDs的細(xì)胞毒性。同樣利用MTT法研究發(fā)現(xiàn)，以榴蓮、大蒜皮、蛋清、豬皮、菠蘿蜜種子、香菜葉、花生殼、牛奶、淀粉、獼猴桃、卵清蛋白等作為前體物質(zhì)，經(jīng)加工合成的FFCDs分別處理不同細(xì)胞后，細(xì)胞活力變化不明顯或隨FFCDs濃度增加略有下調(diào)。但Li Dongmei等從黃花魚罐頭中提取出的FFCDs質(zhì)量濃度大于2 mg/mL時，肝癌細(xì)胞活力大幅急劇下降約90%（圖3A）。此外，利用CCK-8法測定結(jié)果表明，來自百事可樂或速溶咖啡的FFCDs（20 mg/mL）處理中國倉鼠卵巢細(xì)胞系CHO 24 h，細(xì)胞活力無明顯改變。Huang Gang等用人乳腺癌細(xì)胞系MCF7并通過WST-1法研究發(fā)現(xiàn)，以甘蔗糖蜜水熱合成的FFCDs在經(jīng)0.2～4.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)處理后，對細(xì)胞活力同樣影響不大（圖3A）。Wang Haitao等通過RTCA法考察了啤酒FFCDs對MC3T3-E1細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)最初的3 h內(nèi)FFCDs對細(xì)胞指數(shù)影響不大，而隨著時間繼續(xù)延長，則以劑量依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞指數(shù)逐漸下降，可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

圖3 FFCDs的細(xì)胞安全性評價Fig.3 Evaluation of cytotoxicity of FFCDs

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，它能夠保證生命在親代和子代之間的連續(xù)性，從而發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，細(xì)胞周期紊亂與腫瘤等疾病的發(fā)生有十分重要的關(guān)聯(lián)性。真核生物細(xì)胞周期主要包括間期和分裂期（M期），間期再細(xì)分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）和DNA合成后期（G2期）。細(xì)胞受到外界刺激物作用，發(fā)生損傷，會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（又稱程序性細(xì)胞死亡）。目前，主要通過碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色或Annexin V-FITC/PI雙染后利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分別進行測定。Cong Shuang等研究發(fā)現(xiàn)，5 mg/mL烤披薩FFCDs處理正常大鼠腎上皮細(xì)胞系NRK 12 h后，G0/G1期的占比由對照組的49.47%提高到57.63%，表明烤披薩FFCDs會導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G0/G1期（圖3B）。進一步通過細(xì)胞凋亡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，早期凋亡（如果Annexin V單陽性則說明細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，而Annexin V和PI雙陽性則提示細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡）細(xì)胞數(shù)會由對照組的4.72%提高到18.2%，表明烤披薩FFCDs會明顯促進細(xì)胞的早期凋亡（圖3C）。Wang Haitao等以人肝癌細(xì)胞系HepG2為模型，發(fā)現(xiàn)來自烤羊肉的FFCDs會導(dǎo)致S期部分阻滯和細(xì)胞的早期凋亡。Wang Haitao等以MC3T3-E1為模型研究了啤酒FFCDs對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)采用質(zhì)量濃度4 mg/mL FFCDs處理細(xì)胞4 h后，G2/M期的占比由對照組的9.6%提高到17.5%，同時Annexin V陽性細(xì)胞的占比也明顯增加，表明啤酒FFCDs會促進G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡。

此外，也有報道指出FFCDs會影響細(xì)胞能量代謝。Li Dongmei等利用Seahorse XFp分析儀通過監(jiān)測氧氣消耗速率（oxygen consumption rate，OCR）和細(xì)胞外酸化速率（extracellular acidification rate，ECAR），考察了黃花魚罐頭FFCDs對線粒體呼吸和糖酵解的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FFCDs處理后，OCR和ECAR水平皆呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢，低濃度FFCDs組變化不明顯，而高濃度FFCDs組皆明顯下降，表明高劑量FFCDs會抑制線粒體呼吸和糖酵解，進一步研究發(fā)現(xiàn)FFCDs對糖酵解的抑制作用可能是通過抑制某些糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶活性實現(xiàn)的。

綜上，可能是食源性的原因，大部分FFCDs在質(zhì)量濃度達到20 mg/mL的級別才表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，而FFCDs的細(xì)胞毒性可能與食品原料、加工方法、劑量、受試細(xì)胞等因素有關(guān)，另外也不排除研究人員操作與分析不當(dāng)?shù)纫蛩貙嶒灥母蓴_。

4.6 體內(nèi)毒性

體外細(xì)胞實驗由于與體內(nèi)活體環(huán)境差別巨大，難以反映生物體內(nèi)真實存在的復(fù)雜生理環(huán)境，而直接進行人體實驗則存在倫理等問題，因此可采用諸如線蟲、小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅等動物模型來評估FFCDs的體內(nèi)毒性，常見的動物毒理學(xué)評價實驗主要包括急性、亞急性和長期毒性實驗等。

Li Shen等用來自于可樂中的FFCDs灌胃BALB/c小鼠，在單次口服2 g/kg劑量的內(nèi)源性納米粒子24 h后，未觀察到小鼠死亡或明顯的臨床毒性跡象，并通過HE染色對小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、胃、小腸、結(jié)直腸、卵巢和睪丸等主要器官進行了病理學(xué)分析，結(jié)果顯示小鼠無明顯的器官損傷和組織病理學(xué)異常，且各項生化指標(biāo)在生物學(xué)上沒有顯著差異。Wang Haitao和Song Yukun等采用類似的方法分別研究了來自雪花啤酒和烤三文魚的FFCDs對小鼠的急性口服毒性，同等實驗劑量下，小鼠無明顯的體質(zhì)量變化、死亡或臨床毒性跡象，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、尿素和肌酐水平等生化指標(biāo)以及組織病理學(xué)結(jié)果皆沒有發(fā)生明顯變化。綜合上述結(jié)果，2 g/kg的劑量FFCDs對小鼠無急性毒性。

Zhao Xue等將烤豬肉中的FFCDs摻雜在大腸桿菌OP50中，經(jīng)喂食野生型秀麗隱桿線蟲后發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量濃度FFCDs對秀麗隱桿線蟲的體長、蟲卵體積、移動行為、身體曲度、頭部抽動和爬行頻率等指標(biāo)均產(chǎn)生明顯的負(fù)面作用。當(dāng)暴露在質(zhì)量濃度超過5 mg/mL的FFCDs時，線蟲壽命明顯縮短。

畢景然以斑馬魚為模式動物，對來源于烤海鰻魚的FFCDs的急性、亞急性和長期毒性進行了研究。急性毒性實驗結(jié)果表明FFCDs處理斑馬魚96 h后的半致死濃度為321.951 mg/L，屬于低毒性。亞急性毒性實驗結(jié)果表明，高質(zhì)量濃度（65 mg/L）FFCDs處理14 d會導(dǎo)致ROS水平上升，進而造成一定的氧化損傷，而低質(zhì)量濃度或處理時間短則變化不明顯。在30 d的長期毒性實驗中發(fā)現(xiàn)，同樣只有高質(zhì)量濃度（30 mg/L）FFCDs處理會誘導(dǎo)ROS水平上升和氧化損傷。

因而，大部分FFCDs對動物無明顯的急性毒性，這可能與FFCDs與血液中形成蛋白冠有關(guān)系，但從長期攝入角度來說，F(xiàn)FCDs在體內(nèi)的代謝可能存在時間累積效應(yīng)，而目前鮮見FFCDs有關(guān)遺傳或長期毒性等的報道。

5 結(jié) 語

FFCDs是在加工食品中普遍存在的，具有高比表面積、較優(yōu)的熒光穩(wěn)定性以及豐富的表面官能團，對DPPH自由基、羥自由基清除等方面的抗氧化效果也較顯著。FFCDs能隨食物進入人體胃腸內(nèi)被消化吸收進入血液，分布到機體的腦等重要器官，最終可能經(jīng)代謝排出體外。從細(xì)胞實驗結(jié)果來看，F(xiàn)FCDs的細(xì)胞毒性與食品原料、加工方法、濃度劑量、受試細(xì)胞等因素密切相關(guān)；而動物實驗結(jié)果表明FFCDs（2 g/kg的劑量）對小鼠無明顯急性毒性，但遺傳或長期毒性現(xiàn)在還不得而知。迄今為止，關(guān)于FFCDs的形成機制、熒光發(fā)光機理、被細(xì)胞攝取與轉(zhuǎn)運機制以及生物效應(yīng)調(diào)控等難題還沒有確切的答案。深入了解這些問題對FFCDs在食品加工領(lǐng)域安全控制和人類健康都具有重要的意義。