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    宰后成熟期間能量物質(zhì)、pH值和肌原纖維小片化指數(shù)對(duì)秦川牛肉嫩度的影響及其機(jī)理

    2022-07-02 03:49:30李亞蕾羅瑞明張杏亞馬思麗
    食品科學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:秦川牛嫩度肌原纖維

    羅 輝,楊 波,李亞蕾*,羅瑞明,張杏亞,馬思麗,姬 琛

    (寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

    秦川牛是陜甘寧地區(qū)優(yōu)勢(shì)畜種,近5 年存欄量在300萬(wàn) 頭左右,年均出欄量有100萬(wàn) 頭左右,年產(chǎn)肉量在50萬(wàn) t以上,具有一定地域特色。秦川牛肉質(zhì)細(xì)致、肉味濃郁、營(yíng)養(yǎng)全價(jià),肉用性能好。其背最長(zhǎng)肌具有瘦肉比例高、大理石花紋豐富等特點(diǎn),可用于制作高檔牛排,提升附加值,因此本研究選用秦川牛背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象。

    目前肉類(lèi)行業(yè)無(wú)論是在活體動(dòng)物中還是在屠體中缺乏一種快速、客觀的技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)評(píng)估牛肉貯藏過(guò)程中的品質(zhì)指標(biāo)變化。解決這一技術(shù)難題能提高牛肉行業(yè)的效率,并提高工業(yè)生產(chǎn)更高質(zhì)量肉制品的能力。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),必須確定影響肉質(zhì)性狀變化的潛在機(jī)制,為此,研究肉質(zhì)的科研工作者普遍認(rèn)為,在試圖開(kāi)發(fā)預(yù)測(cè)肉品質(zhì)的技術(shù)之前,首先要揭示負(fù)責(zé)調(diào)控表觀變化的基因和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。這樣便于準(zhǔn)確地管理肉類(lèi)質(zhì)量性狀,并為生產(chǎn)者開(kāi)發(fā)基因選擇方案,以優(yōu)化種牛品質(zhì)。在過(guò)去的幾十年里,人們?yōu)閷?shí)現(xiàn)這一目標(biāo)已經(jīng)做出了許多嘗試,特別是利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)研究肉類(lèi)品質(zhì)變化,以更好地揭示牛肉嫩度的潛在機(jī)制。Sawdy等研究表明牛背最長(zhǎng)肌貯藏7 d后嫩度與肌球蛋白重鏈斷裂有關(guān),在肌肉嫩化過(guò)程中,肌球蛋白輕鏈1、2和重鏈1的表達(dá)量明顯降低;李升升利用非標(biāo)記定量(label-free quantitative,LFQ)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究牦牛平滑肌貯藏過(guò)程嫩度的變化機(jī)理,結(jié)果表明SLC25A4、Calpastatin、TPM3、UQCRC1、LMOD1、THBS4和ZYX 7種蛋白可能是牦牛平滑肌貯藏期嫩度變化的指示蛋白;Jia等也利用LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)牛胸最長(zhǎng)肌肌漿蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),在貯藏的前期peroxiredoxin-6表達(dá)量高的組隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)嫩度也會(huì)顯著增高,由此可以通過(guò)檢測(cè)活體組織或屠宰后不久牛胸最長(zhǎng)肌中peroxiredoxin-6含量來(lái)預(yù)測(cè)嫩度變化,因此peroxiredoxin-6可作為肉類(lèi)嫩度的潛在蛋白標(biāo)記物;Poleti等利用高清晰度質(zhì)譜儀(high definition mass spectrometry,HDMS)檢測(cè)Nellore牛背最長(zhǎng)肌蛋白表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)118種蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生了顯著變化,經(jīng)過(guò)生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要富集在丙酮酸代謝、分解代謝、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合和鈣離子結(jié)合等途徑,由此推斷能量代謝和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化可能影響到嫩度。在幾十年的研究中,人們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷揭示了調(diào)控嫩度變化的指示蛋白,調(diào)控嫩度的蛋白質(zhì)圖譜也在逐漸完善,嫩度變化預(yù)測(cè)技術(shù)也有了部分理論的支撐。但不同牛品種之間表現(xiàn)也會(huì)有較大差異,秦川牛背最長(zhǎng)肌嫩度變化機(jī)理報(bào)道鮮有發(fā)現(xiàn),本研究希望能進(jìn)一步完善這一理論基礎(chǔ)。

    本研究中利用4維-LFQ(4 dimension-LFQ,4D-LFQ)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選秦川牛差異蛋白,4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相對(duì)于3維蛋白質(zhì)組學(xué)在質(zhì)荷比(/)、離子強(qiáng)度和保留時(shí)間3個(gè)維度添加了離子淌度(mobility)。離子淌度為牛肉肌肉組織這種復(fù)雜樣品體系的蛋白組檢測(cè)提供了更多可能,可根據(jù)離子的截面和形狀進(jìn)一步對(duì)蛋白進(jìn)行分離鑒定,使蛋白組檢測(cè)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確、全面。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    25 月齡秦川公牛 甘肅省平?jīng)鍪袥艽h旭康食品有限責(zé)任公司。

    蛋白酶抑制劑 德國(guó)Calbiochem 公司;胰酶美國(guó)Promega公司;乙腈 美國(guó)Fisher Chemical公司;甲酸瑞士Fluka公司;三氟乙酸、尿素、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、三乙基碳酸氫銨、三氟乙酸 美國(guó)Sigma公司;BCA試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;pH校準(zhǔn)液上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 那艾精密儀器(上海)有限公司;205便捷式pH計(jì) 德國(guó)德圖集團(tuán);MiniVac Alpha冷凍離心機(jī) 美國(guó)Scan speed公司;timsTOF Pro質(zhì)譜儀、NanoElute超高效液相色譜儀 德國(guó)Bruker公司;Forma 994超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司;TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀英國(guó)Stable Micro Systems公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品采集

    選用3 頭生長(zhǎng)發(fā)育正常、體壯無(wú)病、25 月齡左右的去勢(shì)秦川公牛,屠宰后取牛兩側(cè)背最長(zhǎng)肌并分割為質(zhì)量約(100f10)g的肉樣,隨機(jī)分成5 組并置于透氣性為23.5 g/(m?d)的聚乙烯保鮮袋中。立即取其中一組樣品檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)(視為宰后第0天樣品),將蛋白質(zhì)組學(xué)、能量物質(zhì)檢測(cè)和剪切力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所用樣品置于液氮中保存。其他4 組貯藏于0~4 ℃的冰箱中,分別在第2、4、6、8天時(shí)取出,測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

    1.3.2 能量物質(zhì)含量的測(cè)定

    稱(chēng)取50 mg樣品置于離心管中,加入4 ℃預(yù)冷的1 mL 混合液(含0.6 mol/L高氯酸和1 mmol/L乙二胺四乙酸),勻漿2 min后4 ℃、10 000h條件下離心10 min,取700 μL上清液加入0.2 mL 1 mol/L NaOH。搖勻后反應(yīng)5 min,取0.5 mL混合溶液用聚碳酸酯濾膜過(guò)濾后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用高相液相色譜法檢測(cè)ATP、ADP、AMP、NADH的含量。流動(dòng)相為220 mmol/L硫酸鉀緩沖液(含10%甲醇并使用四丁基氫氧化銨調(diào)節(jié)至pH 6.5),等度洗脫,流速為0.8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

    1.3.3 剪切力測(cè)定

    參考文獻(xiàn)[16]測(cè)定樣品剪切力,以表征樣品的嫩度。取出貯藏在0~4 ℃環(huán)境下的肉樣,插入熱電偶溫度計(jì)至肉樣中央并置于蒸煮袋中,在85 ℃水浴鍋中加熱,待肉樣中心溫度達(dá)80 ℃時(shí)取出,流動(dòng)自來(lái)水沖洗蒸煮袋將肉樣冷卻至室溫,切除表面,避開(kāi)筋腱等部分,平行于肌纖維方向用口徑為1.27 cm的取樣器切割制作肉柱,用質(zhì)構(gòu)儀“V”型剪切刀檢測(cè)肉柱,剪切刀垂直于肌纖維方向,剪切速率與剪切距離分別為1.5 mm/s、40 mm,每個(gè)肉樣檢測(cè)3 次,結(jié)果取平均值。

    1.3.4 pH值測(cè)定

    參照文獻(xiàn)[17]的方法,pH計(jì)使用前用pH校準(zhǔn)液校正,取4 cmh4 cmh4 cm樣品(60 g左右)背最長(zhǎng)肌,探頭沿肌纖維方向插入肉樣內(nèi)部,每個(gè)樣品取5個(gè)點(diǎn)測(cè)定,結(jié)果取平均值。

    1.3.5 4D-LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度

    參照文獻(xiàn)[18]的方法提取蛋白質(zhì)。4 ℃預(yù)冷后的研缽放入適量樣品和液氮研磨成粉末狀,加樣品4 倍體積的裂解緩沖液(等體積的8 mol/L尿素和1%蛋白質(zhì)酶抑制劑)。超聲裂解后移入離心管,4 ℃、12 000h條件下離心10 min,取上清液利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。

    參照文獻(xiàn)[19]的方法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行胰酶酶解。取上述蛋白溶液加入二硫蘇糖醇溶液,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度為5 mmol/L。56 ℃避光環(huán)境下還原30 min再加入100 mmol/L碘代乙酰胺溶液,將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至1 mmol/L,25 ℃避光環(huán)境下靜止12 min。用四乙基溴化銨溶液將樣品中的尿素稀釋到2 mol/L以下,按照蛋白質(zhì)量的2%添加胰酶,37 ℃酶解12 h,再按照蛋白質(zhì)量的1%添加胰酶,37 ℃酶解4 h。

    液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析:使用NanoElute超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行肽段分離,流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液,用來(lái)溶解蛋白片段;流動(dòng)相B為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈溶液;流速為300 nL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?~3 min,4%~6% B;3~70 min,6%~25% B;70~82 min,25%~32% B;82~87 min,32%~80% B;87~90 min,80%~100% B。肽段分離后注入到capillary離子源中進(jìn)行電離,電壓設(shè)置為1.4 kV,使用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)肽段母離子及其二級(jí)碎片進(jìn)行檢測(cè)和分析,設(shè)置掃描范圍100~1 700/。通過(guò)平行累積串行碎裂模式(parallel accumulation serial fragmentation,PASEF)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。將采集后一級(jí)質(zhì)譜用10 次PASEF模式采集母離子電荷數(shù)在0~5范圍獲得二級(jí)譜圖,為了避免母離子的重復(fù)掃描串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為24 s。

    1.3.6 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

    二級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)檢索采用Maxquant(v1.6.6.0)軟件進(jìn)行。各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置如下:選擇Bos_taurus_9913_PR_20190915.fasta(37 948 條序列)為數(shù)據(jù)庫(kù),加入常見(jiàn)的污染庫(kù)排除污染蛋白質(zhì)的影響,加入反庫(kù)特征信息匹配排除計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽(yáng)性率(false discovery rate,F(xiàn)DR)影響;酶切方式為T(mén)rypsin/P,Main search與First search的二級(jí)碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為0.04 Da,一級(jí)母離子質(zhì)量誤差容忍度設(shè)為40h10Da;肽段最大修飾數(shù)、漏切位點(diǎn)數(shù)和肽段最小長(zhǎng)度分別設(shè)置為5、2、7。固定修飾為半胱氨酸烷基化,可變修飾為蛋白N端的乙?;图琢虬彼岬难趸k钠ヅ鋱D譜鑒定的FDR和蛋白鑒定均設(shè)置為1%。

    1.3.7 生物信息學(xué)分析

    篩選出的差異蛋白質(zhì)利用軟件ClusterProfiler(3.4.4)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,比對(duì)后獲得差異基因的基因本體(gene ontology,GO)(包括生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC))功能信息。利用String 10.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)和Cytoscape 3.6.1軟件繪制差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.3.8 肌原纖維小片化指數(shù)的測(cè)定

    稱(chēng)取肉樣1 g使用冷凍研磨儀攪碎后置于離心管中,加入10 mL肌原纖維小片化指數(shù)(myofibril fragmentation index,MFI)緩沖液(含100 mmol/L氯化鉀、11.2 mmol/L磷酸氫二鉀、8.8 mmol/L磷酸二氫鉀、1 mmol/L乙二醇雙四乙酸、1 mmol/L氯化鎂、1 mmol/L疊氮化鈉),4 ℃、1 200 r/min勻漿3 min,然后4 ℃、1 000h離心15 min收集上清液;加入10 mL MFI緩沖液重懸沉淀并按上述步驟再次勻漿后離心,收集上清液;再加入5 mL預(yù)冷MFI緩沖溶液使沉淀充分懸浮后用200 目篩過(guò)濾,再用5 mL MFI緩沖液清洗離心管,然后用200 目篩過(guò)濾,合并上清液和濾液,并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定混合溶液的蛋白質(zhì)量濃度。用MFI緩沖液調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL左右,在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3 次,取平均值帶入下式計(jì)算MFI。

    1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

    所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 25軟件進(jìn)行單因素分析,采用鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,<0.05表示差異顯著,<0.01表示差異極顯著。采用Origin 2018軟件作圖,采用微生信在線平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)進(jìn)行秦川牛肉背最長(zhǎng)肌差異蛋白數(shù)據(jù)分析并作圖。采用SPSS 25軟件分別對(duì)差異蛋白表達(dá)量與剪切力、能量物質(zhì)含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,篩選出與嫩度相關(guān)的蛋白質(zhì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中ATP、ADP、AMP、NADH含量的變化

    采用高效液相色譜法測(cè)定了秦川牛背最長(zhǎng)肌不同貯藏期能量物質(zhì)含量。如表1所示,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),ATP的含量呈顯著下降趨勢(shì)(<0.05),由0 d時(shí)的(10.15f0.60)μmol/g下降至8 d時(shí)的(0.50f0.20)μmol/g,其中在0~2 d下降速率較快,在2~8 d下降速率較為緩慢,第8天時(shí)基本檢測(cè)不出ATP,ADP、AMP的含量在整個(gè)貯藏期(0~8 d)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。秦川牛宰后肌肉細(xì)胞中ATP進(jìn)行著不可逆的降解過(guò)程,由于ATP含量的減少,ADP、AMP含量隨之減少。貯藏過(guò)程中NADH含量變化可反映組織細(xì)胞中氧化還原和能量變化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中NADH含量逐漸降低,說(shuō)明宰后肌肉細(xì)胞發(fā)生變化,使細(xì)胞呼吸功能失調(diào),氧化磷酸化進(jìn)程受阻,引起NADH含量出現(xiàn)顯著下降的現(xiàn)象。

    表1 秦川牛背最長(zhǎng)肌不同貯藏時(shí)間下ATP、ADP、AMP、NADH含量變化Table 1 Changes in ATP, ADP, AMP and NADH contents in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle with storage time

    2.2 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程剪切力的變化

    嫩度是影響秦川牛肉口感的重要品質(zhì)屬性,也是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)欲的重要指標(biāo)。咀嚼破碎肉制品時(shí)口腔所受的抵抗力大小可稱(chēng)為肉制品的嫩度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以剪切力表征嫩度。如圖1所示,秦川牛肉在貯藏過(guò)程中剪切力總體呈先上升后下降的趨勢(shì)(<0.01),其下降幅度大于上升幅度。第0天時(shí)剪切力為(120.25f5.15)N,在第4天時(shí)達(dá)到最大值,為(157.94f2.53)N,第8天時(shí)又降至(93.41f5.08)N,通過(guò)以上剪切力的變化可以看出秦川牛背最長(zhǎng)肌在貯藏中的嫩度變化情況,在0~4 d時(shí)逐漸降低,第4天時(shí)到達(dá)最低點(diǎn),之后逐漸升高,直至第8天。

    圖1 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏期間剪切力變化Fig.1 Changes in shear force of longissimus dorsi muscle with storage time

    2.3 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏過(guò)程中pH值變化

    秦川牛背最長(zhǎng)肌在貯藏過(guò)程中pH值變化情況如圖2所示,宰后0 d時(shí)pH值為6.78f0.02,在0~2 d貯藏期內(nèi)下降速率較快,2~4 d貯藏期下降速度放緩后到達(dá)最低點(diǎn)5.37f0.03,4~8 d時(shí)呈緩慢上升趨勢(shì),8 d時(shí)上升至5.50f0.04。整體下降幅度大于上升幅度。無(wú)氧條件下,機(jī)體通過(guò)無(wú)氧糖酵解產(chǎn)能的同時(shí)產(chǎn)生乳酸;此外,宰后ATP水解產(chǎn)生磷酸,這些酸性物質(zhì)長(zhǎng)期積累并無(wú)法分解與轉(zhuǎn)運(yùn),使得肌肉組織的pH值迅速下降。

    圖2 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏期間pH值的變化Fig.2 Changes in pH in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle with storage time

    2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析及關(guān)鍵蛋白質(zhì)篩選結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)中采用4D-LFQ對(duì)貯藏0、4、8 d的樣品蛋白質(zhì)豐富度變化進(jìn)行定量分析,利用Maxquant(v1.6.6.0)軟件對(duì)所得的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜檢索,共檢索確定蛋白1 149個(gè),設(shè)置1.200 倍為差異顯著倍數(shù),共篩選出120個(gè)差異顯著的蛋白質(zhì),為進(jìn)一步確定數(shù)據(jù)的可信度,對(duì)差異蛋白進(jìn)行了聚類(lèi)分析與主成分分析。

    秦川牛背最長(zhǎng)肌差異蛋白豐富度層次聚類(lèi)分析如圖3A所示,各組的3個(gè)平行樣品均可聚為一類(lèi),說(shuō)明樣品重復(fù)性較好,且不同貯藏時(shí)間樣品差異明顯;同時(shí),4、8 d的樣品距離更近,與0 d樣品相區(qū)分。差異蛋白的主成分分析結(jié)果如圖3B所示,PC1、PC2的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到72.23%,因此這兩個(gè)主成分可較好地代表差異蛋白表達(dá)的信息。PC1能將0 d與其他樣品區(qū)分開(kāi),PC2能將4 d與8 d樣品區(qū)分開(kāi)。綜上可判斷,秦川牛背最長(zhǎng)肌差異蛋白0、4、8 d樣品重復(fù)性較好且有顯著差異,具有一定代表性和可信度。

    圖3 秦川牛肉背最長(zhǎng)肌差異蛋白整體數(shù)據(jù)分析結(jié)果Fig.3 Analysis of differential proteins between longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle stored for different periods

    采用SPSS 25軟件對(duì)差異蛋白表達(dá)量與剪切力進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,篩選出與嫩度變化相關(guān)的11種差異蛋白,如表2所示。

    表2 秦川牛背最長(zhǎng)肌與嫩度相關(guān)的差異蛋白Table 2 Differential proteins related to beef tenderness in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle

    2.5 差異蛋白GO注釋結(jié)果

    對(duì)秦川牛肉背最長(zhǎng)肌篩選出的差異蛋白進(jìn)行GO分析后,所涉及到的生物過(guò)程與細(xì)胞組分前10的條目情況如圖4所示,生物過(guò)程主要集中在氧化還原過(guò)程(ATP5F1D、NDUFA6、NDUFB5、SUCLA2)、線粒體組織(ATP5F1D、NDUFA6、NDUFB5)、NADH脫氫酶符合體組裝(NDUFA6、NDUFB5)、細(xì)胞呼吸(ATP5F1D、SUCLA2)等過(guò)程;細(xì)胞組分主要集中在催化復(fù)合物(NDUFA6、PPP3R1、NDUFB5、HNRNPK、PSMD13)、線粒體蛋白質(zhì)復(fù)合物(ATP5F1D、NDUFA6、NDUFB5、ATP5F1C)、細(xì)胞器內(nèi)膜(ATP5F1D、NDUFA6、NDUFB5、ATP5F1C)、肌纖維膜(PPP3R1、CAMK2D)等。

    圖4 秦川牛肉背最長(zhǎng)肌差異蛋白GO分析結(jié)果Fig.4 Gene ontology (GO) analysis of differential proteins in longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle

    2.6 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

    圖5是利用Cytoscape 3.6.1軟件和String 10.0數(shù)據(jù)庫(kù)制作的差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。此網(wǎng)絡(luò)圖聚類(lèi)系數(shù)為0.691,蛋白質(zhì)相互作用富集值為1.39h10。如圖5所示,ATP5D、ATP5C1、SUCLA2、SUCLG1、NDUFB5、NDUFA6的相互作用較為強(qiáng)烈,通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)在氧化還原過(guò)程,線粒體組織條目有較密切互作關(guān)系,分析發(fā)現(xiàn)以上6種蛋白質(zhì)組成的集團(tuán)均參與調(diào)解宰后能量代謝,最終通過(guò)ATP含量和pH值變化影響嫩度變化;CAMK2D與PPP3R1的相關(guān)作用較為強(qiáng)烈,分析發(fā)現(xiàn)兩者具有協(xié)同關(guān)系,共同參與細(xì)胞凋亡,促進(jìn)MFI的增大,肌原纖維受到破壞,最終使得嫩度降低;CTSD、HNRNPK、PSMD13暫未與其他蛋白發(fā)現(xiàn)相互作用。

    圖5 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Interaction network between differential proteins

    2.7 pH值、能量物質(zhì)含量及相關(guān)差異蛋白對(duì)嫩度的影響

    利用SPSS 25軟件對(duì)表2中11種蛋白質(zhì)的表達(dá)量與能量物質(zhì)含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,篩選出6種與能量變化相關(guān)的差異蛋白質(zhì),結(jié)果如表3所示,它們分別為ATP5F1D、ATP5F1C、NDUFA6、NDUFA6、SUCLA2、SUCG1。

    表3 差異蛋白質(zhì)表達(dá)量與能量物質(zhì)含量的相關(guān)性Table 3 Correlation between expression of differential proteins and energy substance contents

    表2中ATP5F1D是ATP合酶的亞基δ,ATP5F1C是ATP合酶亞基γ,這兩種蛋白質(zhì)參與ATP合成酶的組裝,是ATP合酶5個(gè)亞基中的2個(gè),對(duì)ATP合酶催化活性有重要作用,承擔(dān)著離子傳遞的作用。ATP含量合酶參與ATP的合成與消耗,所以ATP合酶直接影響機(jī)體細(xì)胞的供能和耗能,其表達(dá)量也會(huì)直接反映細(xì)胞中能量需求情況和三羧酸循環(huán)產(chǎn)能的情況。由表3可知,ATP5F1D、ATP5F1C表達(dá)量與能量基礎(chǔ)物質(zhì)ATP含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)。表2中NDUFA6為NADH脫氫酶的附件亞基。NADH脫氫酶參與線粒體內(nèi)膜上的呼吸作用,對(duì)電子從NADH傳遞給輔酶Q有催化作用,NDUFA6表達(dá)量與能量基礎(chǔ)物質(zhì)ATP含量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),與NADH含量呈極顯著正相關(guān)(<0.01)。ATP5F1D和NDUFA6在0~4 d的貯藏過(guò)程中均有高水平的表達(dá),ATP5F1D上調(diào)1.819 倍,NDUFA6上調(diào)1.467 倍。兩者均是糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵酶的組件,其高水平的表達(dá)說(shuō)明機(jī)體細(xì)胞在切斷氧氣供應(yīng)時(shí),能提高參與產(chǎn)能的酶含量,利用無(wú)氧糖酵解過(guò)程產(chǎn)能,在此過(guò)程中大量產(chǎn)生乳酸,使得肌肉pH值下降。

    琥珀酰輔酶A合成酶在檸檬酸循環(huán)中發(fā)揮作用,在琥珀酸硫激酶的催化下,琥珀酰輔酶A高能鍵水解生成琥珀酸,同時(shí)使GDP磷酸化生成GTP,GTP再與ADP作用生成ATP。表2中SUCLA2作為琥珀酸-CoA連接酶[ADP形成]亞基β,提供酶的核苷酸特異性,并與底物琥珀酸結(jié)合,而輔酶A和磷酸的結(jié)合位點(diǎn)在α亞基。而篩選出SUCG1就是琥珀酸-CoA連接酶[ADP形成]亞基α。通過(guò)表3也可以看出,SUCLA2的表達(dá)量與ATP、NADH含量呈極顯著正相關(guān)(<0.01),與ADP、AMP顯著正相關(guān)(<0.05);SUCG1表達(dá)量與ATP含量呈含量顯著正相關(guān)(<0.05)。表2中NDUFB5與NDUFA6同為NADH脫氫酶的附件亞基,在磷酸氧化過(guò)程中有著同等作用,從表3中也可以看出NDUFB5的表達(dá)量與ATP、NADH含量均呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。從表2可以看出,SUCLA2的表達(dá)量在0~8 d調(diào)整0.762 倍,NDUFB5的表達(dá)量在4~8 d調(diào)整0.497 倍,SUCG1的表達(dá)量在4~8 d調(diào)整0.742 倍。SUCLA2、NDUFB5、NDUFA6是在三羧酸循環(huán)、呼吸電子鏈傳遞、通過(guò)化學(xué)滲透耦合進(jìn)行ATP合成、解偶聯(lián)蛋白質(zhì)中起關(guān)鍵作用的蛋白,在4~8 d的貯藏期內(nèi)均有下調(diào)趨勢(shì),說(shuō)明無(wú)氧糖酵解過(guò)程可能會(huì)受到抑制,能量和乳酸的生成量相應(yīng)減少。

    秦川牛屠宰后血液流動(dòng)停止,肌肉細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)以上蛋白表達(dá)量,啟動(dòng)糖酵解過(guò)程產(chǎn)能,本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,0~4 d時(shí)秦川牛肉的ATP的含量減少至(1.20f0.45)μmol/g,為初始狀態(tài)的11.82%,在能量物質(zhì)ATP下降到宰前初始含量的20%以下時(shí),肌纖維發(fā)生交聯(lián),肌肉會(huì)出現(xiàn)僵直現(xiàn)象,由圖1可知,在0~4 d貯藏期秦川牛肉剪切力也隨之上升,4 d后能量物質(zhì)含量下降速率有所減慢,對(duì)肌肉收縮的影響可能會(huì)減小。無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生能量的同時(shí)產(chǎn)生乳酸;此外宰后ATP水解產(chǎn)生磷酸,這些酸性物質(zhì),使得肌肉組織的pH值迅速下降。4 d時(shí)pH值為5.37f0.03,低pH值改變了質(zhì)子的穩(wěn)態(tài),降低了肌原纖維蛋白之間的靜電斥力,導(dǎo)致肌肉纖維不可逆?zhèn)认蚴湛s(肌節(jié)延伸),使得肉嫩度變差;低pH值使纖維蛋白暴露出更多水解位點(diǎn),有助于水解酶的水解作用;低pH值會(huì)降低溶酶體膜的穩(wěn)定性,使得肌肉細(xì)胞釋放內(nèi)源水解酶,同時(shí)pH值的降低會(huì)使肌肉細(xì)胞處于酸性環(huán)境,打破細(xì)胞中的離子平衡,促進(jìn)鈣離子的釋放,Ca濃度的提高會(huì)激活鈣蛋白酶,降解纖維蛋白,促使嫩度升高,但pH值的降低也會(huì)使得-鈣激活酶發(fā)生自溶現(xiàn)象,降低酶活性,降低肌原纖維蛋白的水解速率;也有研究表明pH值小于5.8時(shí),組織酶D對(duì)水解鴕鳥(niǎo)纖維有促進(jìn)作用,由此可判斷pH值會(huì)影響到內(nèi)源酶的催化活性,對(duì)肌原纖維蛋白的降解速率產(chǎn)生一定影響。通過(guò)圖6也可以看出,剪切力和ATP含量、pH值均呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。綜上可推測(cè),0~4 d能量物質(zhì)含量的減少和pH值的降低會(huì)使得肌肉的僵直,肌肉嫩度降低,4~8 d能量物質(zhì)含量變化較小,對(duì)肌肉的影響也會(huì)相應(yīng)降低,長(zhǎng)期低pH值下的各種途徑綜合作用對(duì)嫩度提高的速率和嫩度提高的程度均有影響。

    圖6 秦川牛背最長(zhǎng)肌能量物質(zhì)含量、pH值和剪切力之間的相關(guān)系數(shù)Fig.6 Correlation coefficients between energy substance contents, pH and shear force

    2.8 與MFI相關(guān)的差異蛋白對(duì)宰后秦川牛肉嫩度變化的影響

    秦川牛肉在貯藏過(guò)程中MFI變化情況如圖7所示,在整個(gè)貯藏過(guò)程中MFI呈顯著上升趨勢(shì)(<0.05),由0 d時(shí)28.50f5.1持續(xù)增長(zhǎng)至8 d時(shí)的99.98f1.20,變化了250.81%。此結(jié)果與李升升對(duì)牦牛平滑肌嫩度形成機(jī)理研究中的MFI增加趨勢(shì)一致。

    圖7 秦川牛背最長(zhǎng)肌不同貯藏時(shí)間MFI變化情況Fig.7 Changes in MFI of longissimus muscle of Qinchuan cattle with storage time

    利用SPSS 25軟件將表2中11種與嫩度相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量與與MFI進(jìn)行相關(guān)性分析,篩選出5種(CTSD、PSMD13、PPP3R1、CAMK2D、HNRNPK)與MFI有關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì),相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示。

    表4 秦川牛背最長(zhǎng)肌貯藏期間剪切力、MFI與差異蛋白含量相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients between shear force, MFI and differential protein contents

    CTSD為組織蛋白酶D,位于溶酶體,pH值降低等因素會(huì)影響溶酶體膜穩(wěn)定性,使得CTSD被釋放,后經(jīng)過(guò)ADAM30D切割后可激活活性,在蛋白質(zhì)的降解與細(xì)胞凋亡中起作用,CTSD在0~8 d中的表達(dá)量上調(diào)1.303 倍(表2),CTSD表達(dá)量與剪切力呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),與MFI呈顯著正相關(guān)(<0.05),CTSD的高表達(dá)可能會(huì)出現(xiàn)肌肉細(xì)胞更高水平的自噬。PSMD13是26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基13,26S蛋白酶體非ATP酶可以去除可能損害細(xì)胞功能的錯(cuò)誤折疊或受損的蛋白質(zhì),還可以通過(guò)去除不再需要的功能蛋白質(zhì),維持蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡,同時(shí)參與細(xì)胞凋亡的進(jìn)程,PDMD13在0~8 d中上調(diào)1.336 倍(表2),PSMD13表達(dá)量與剪切力呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01),與MFI呈顯著正相關(guān)(<0.05),PSMD13表達(dá)量發(fā)生變化會(huì)影響到細(xì)胞凋亡和受損蛋白質(zhì)去除。HNRNPK是與mRNA結(jié)合的主要蛋白質(zhì),可能在核內(nèi)不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)的核代謝中通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活和抑制發(fā)揮作用,在糖基化中起促進(jìn)作用,作為抑癌基因/的轉(zhuǎn)錄輔激活因子,在/和/誘導(dǎo)中起作用;在轉(zhuǎn)錄抑制方面,它通過(guò)與/誘導(dǎo)的非編碼RNA(-)相互作用發(fā)揮作用,這種相互作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所發(fā)生的,HNRNPK在0~8 d調(diào)整0.722 倍(表2),HNRNPK表達(dá)量與剪切力呈顯著正相關(guān)(<0.05),與MFI呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),HNRNPK在貯藏期內(nèi)的異常表達(dá),會(huì)直接影響到肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

    研究中發(fā)現(xiàn)了兩種關(guān)鍵蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中具有協(xié)同作用。PPP3R1是鈣調(diào)磷酸酶B亞基1型,是一種鈣調(diào)節(jié)蛋白刺激的蛋白磷酸酶,提供細(xì)胞對(duì)Ca的敏感性,在4~8 d上調(diào)1.309 倍,提高了細(xì)胞對(duì)鈣離子的敏感性。CAMK2D是鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶II型亞基δ,CAMK2D通過(guò)靶向鈣離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與細(xì)胞鈣離子內(nèi)流、肌漿網(wǎng)鈣釋放、肌漿網(wǎng)鈣攝取,影響細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)和興奮收縮偶聯(lián)的調(diào)節(jié),CAMK2D表達(dá)量在4~8 d上調(diào)1.506 倍。由表4可以看出,PPP3R1表達(dá)量與剪切力呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01),與MFI呈極顯著正相關(guān)(<0.01);CAMK2D表達(dá)量與剪切力呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),與MFI呈顯著正相關(guān)(<0.05)。初步判斷PPP3R1和CAMK2D在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中具有協(xié)同作用,CAMK2D促進(jìn)細(xì)胞對(duì)Ca的吸收,提高細(xì)胞中Ca的濃度;PPP3R1可提高細(xì)胞對(duì)鈣離子的敏感性,Ca超負(fù)荷的積累是觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素,這兩種蛋白同時(shí)在4~8 d時(shí)高表達(dá),共同作用促使細(xì)胞凋亡進(jìn)程的發(fā)生,降低肌原纖維結(jié)構(gòu)強(qiáng)度,使得嫩度提高。

    MFI可直接反映肌纖維的降解程度,增大原因是由于Z線蛋白的降解和肌原纖維細(xì)胞凋亡。宰后無(wú)氧糖酵解導(dǎo)致pH值降低,使得細(xì)胞離子失衡,鈣離子濃度升高;降低溶酶體膜與細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,釋放并激活內(nèi)源酶,CTSD、PSMD13、PPP3R1、CAMK2D、HNRNPK 5種參與細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)水解的蛋白豐富度發(fā)生了改變,加快了肌原纖維蛋白的水解與細(xì)胞凋亡的發(fā)生,促使MFI升高了250.81%,降低了肌原纖維骨架強(qiáng)度,使得秦川牛背最長(zhǎng)肌嫩度升高。

    2.9 能量物質(zhì)、pH值、MFI對(duì)秦川牛肉背最長(zhǎng)肌嫩度變化不同時(shí)間段產(chǎn)生影響的分析

    秦川牛宰后能量和pH值變化較為迅速,對(duì)肌纖維收縮的影響較早,0~4 d時(shí)肌肉僵直對(duì)嫩度變化影響較大,4~8 d時(shí)隨著能量物質(zhì)趨于穩(wěn)定,對(duì)肌肉收縮的影響減小,對(duì)肌肉嫩度的影響也會(huì)隨之降低。低pH值與5種參與細(xì)胞凋亡有關(guān)的內(nèi)源酶相互作用使得MFI升高,是長(zhǎng)期積累的過(guò)程,當(dāng)MFI升高到一定程度,肌原纖維骨架強(qiáng)度顯著降低時(shí),才會(huì)使得肌肉嫩度升高,由圖1剪切力數(shù)據(jù)可以看出MFI作用主要集中在4~8 d時(shí),所以MFI作用具有滯后性。

    3 結(jié) 論

    秦川牛肉在貯藏過(guò)程中6種蛋白(ATP5F1D、ATP5F1C、NDUFB5、NDUFA6、SUCLA2、SUCG1)通過(guò)呼吸電子鏈傳遞、通過(guò)化學(xué)滲透耦合進(jìn)行ATP合成、解偶聯(lián)蛋白質(zhì)等途徑影響宰后糖酵解過(guò)程,ATP含量降至初始狀態(tài)(0 d)的11.82%,引起肌纖維發(fā)生交聯(lián),肌肉會(huì)出現(xiàn)僵直,造成肌肉剪切力增大,嫩度下降。能量物質(zhì)含量宰后變化較快且后期穩(wěn)定,所以對(duì)肌肉嫩度影響主要集中在0~4 d時(shí)。宰后酸性物質(zhì)的積累造成肌肉pH值下降,導(dǎo)致肌原纖維蛋白之間的靜電斥力減小,影響了肌肉收縮;參與細(xì)胞鈣離子濃度、促使肌原纖維受體暴露、調(diào)節(jié)內(nèi)源酶活性等過(guò)程使得嫩度升高。5種蛋白(PPP3R1、CAMK2D、HNRNPK、PSMD13、CTSD)通過(guò)肌纖維膜、膜蛋白復(fù)合物、細(xì)胞器內(nèi)膜、鈣信號(hào)通路調(diào)控肌纖維細(xì)胞的凋亡和蛋白的水解,造成肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞,使得MFI逐漸升高,肌原纖維骨架強(qiáng)度降低,促使肌肉嫩度升高。長(zhǎng)期低pH值和5種與細(xì)胞凋亡和蛋白水解有關(guān)的內(nèi)源酶相互作用下的MFI升高是逐漸積累的過(guò)程,作用時(shí)間滯后,從剪切力數(shù)據(jù)可以看出,MFI途徑對(duì)嫩度降低的影響主要集中在4 d后。

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