茶多糖-茶多酚對小鼠腸道氧化應激的改善與作用機制

韋 錚，賀 燕，黃先智，沈以紅，丁曉雯,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400700；2.西南大學科技處，重慶 400700）

不良飲食、環(huán)境等多方面因素的影響會導致機體內氧化還原系統(tǒng)失衡。-半乳糖是經(jīng)典的氧化應激造模劑，該物質經(jīng)醛糖還原酶作用形成半乳糖醇，在體內堆積而導致機體產生過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而引起機體出現(xiàn)氧化應激反應，過量的ROS不僅會誘導機體內生物大分子損傷，而且會引起糖尿病、白內障等并發(fā)癥的發(fā)生。Toll樣受體4（toll-like receptors，TLR4）/p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）/核因子-E2相關因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是機體內主要的抗氧化信號通路，TLR4是微生物成分引起樹突細胞活化的橋梁，p38 MAPK是MAPK的亞類之一，p38 MAPK通路在ROS的作用下被激活，磷酸化形成p-p38，進一步刺激Nrf2與Kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）分離，Nrf2進入細胞核后與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）相結合，激活抗氧化酶系統(tǒng)和谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)。這兩個系統(tǒng)的存在能夠清除機體產生的ROS，以防止ROS對機體細胞產生損傷，保持機體氧化還原平衡，免受氧化應激損害。

茶是我國最普遍的飲品之一，其含有的活性成分茶多酚具有降血糖、調節(jié)免疫、抗氧化等功能，該物質是茶葉中研究最多的成分。茶多糖是茶葉的另一活性成分，是一種與蛋白質、大量礦質元素結合的酸性糖蛋白?，F(xiàn)有研究證明茶多糖也具有類似茶多酚的功效，本實驗室前期已通過體外實驗證明，本實驗所用茶多糖-茶多酚混合功能成分（tea extract rich in polysaccharides and polyphenols，TEPP）具有抗氧化作用，但是該物質對腸道氧化應激損傷是否具有改善作用與機制的研究相對較少。本實驗主要通過給小鼠腹腔注射-半乳糖以建立腸道氧化應激損傷模型，然后灌胃不同劑量的TEPP，從TLR4/p38 MAPK/Nrf2信號通路（圖1）角度探究TEPP對-半乳糖誘導的小鼠腸道氧化應激的改善作用與機制。如今，消費者對于天然抗氧化劑的需求逐漸提高，茶多糖-茶多酚作為天然成分，對其相關功能的研究將為產品的開發(fā)以及機體抗氧化機理等提供理論依據(jù)。

圖1 TLR4/p38 MAPK/Nrf2通路[13-15]Fig.1 TLR4/p38 MAPK/Nrf2 pathway[13-15]

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

基礎飼料，SPF級昆明種小鼠（雄）84只，4 周齡，平均體質量為20 g左右，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK（渝）2018 0003）提供。TEPP購自湖南華城生物資源股份有限公司，經(jīng)測定含56.9%（質量分數(shù)，下同）茶多糖、19.4%茶多酚、13.2%灰分、9.6%水分、0.1%蛋白質。

總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、ROS、GR、HO-1酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海優(yōu)選生物科技有限公司。DNA ladder抽提試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒北京百泰克生物技術有限公司；反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTMII（Til RNaseH Plus）試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Synergy H1型酶標儀 美國基因有限公司；T100T型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；qTOWER3G型實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）儀 德國耶拿公司；ALPAAI-4LSC型高速離心機 德國Christ公司；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司；5880 R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠的造模與分組

將84只昆明種雄性小鼠（體質量18～22 g）隨機分籠（每籠3～4只）適應性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)條件：室溫（溫度（23f2）℃、相對濕度40%～60%），12 h光照（9∶00～21∶00）/12 h黑夜（21∶00～9∶00）晝夜交替，基礎飼料，自由進食飲水。適應性飼養(yǎng)1 周后，用苦味酸標記小鼠，分出12只作為正常組，腹腔注射0.1 mL/10 g生理鹽水；剩余的小鼠每天同一時間段腹腔注射0.1 mL/10 g的質量分數(shù)10%-半乳糖（用0.9%滅菌生理鹽水配制）進行造模，自由進食飲水。連續(xù)注射45 d后頜下取血，測定造模組和正常組小鼠血清的丙二醛（malondialdehyde，MDA）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、-乳酸（-lactic acid，-LAC）含量是否存在顯著性差異，如果存在，表示造模成功，不然繼續(xù)注射直到造模成功，以一周為周期進行造模判斷，然后進行后續(xù)實驗。

將小鼠分成未經(jīng)過造模的正常組（灌胃生理鹽水）和造模成功的模型組（灌胃生理鹽水）、陽性對照組（灌胃200 mg/kg還原型谷胱甘肽）、茶多酚組（灌胃50 mg/kg茶多酚，該劑量與高劑量組的茶多酚含量相同）、低劑量組（灌胃40 mg/kgTEPP）、中劑量組（灌胃100 mg/kgTEPP）、高劑量組（灌胃250 mg/kgTEPP）。對所有小鼠進行為期45 d的灌胃，每天同一時間段灌胃1 次，灌胃體積為0.1 mL/10 g。

1.3.2 實驗樣本的采集與制備

灌胃45 d后，小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血，取血后的小鼠頸椎脫位處死，打開腹腔，取腸道，用冰冷的生理鹽水沖洗去除其表面血水，取出結腸的腸道內容物，液氮速凍，于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｇ腥】漳c用錫箔紙包好放在－80 ℃的冰箱中保存，以上操作均于無菌操作臺中進行。

腸組織按照試劑盒說明書上的方法，以（臟器）∶（生理鹽水）=1∶9的比例加入生理鹽水用勻漿機均漿，－4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 空腸組織中T-AOC、ROS濃度、GR活力、HO-1活力的測定

均按ELISA試劑盒說明書的方法進行測定。

1.3.4 空腸組織中、、、、mRNA表達量的測定

按照RNA提取試劑盒提供的方法提取空腸組織總RNA，再根據(jù)反轉錄試劑盒說明書提供的方法將RNA反轉為cDNA，再進行PCR擴增。取上述反轉錄產物1 μL作為反應模板、SYBR Green 5 μL、HO 5 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL，總體系11.6 μL，進行qPCR。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，如表1所示。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

qPCR反應條件：95 ℃、4 min預變性；95 ℃、15 s變性，60 ℃、30 s退火，共39個循環(huán)。以-actin作內參基因，分別測定空腸組織中、、、、mRNA的相對表達量，結果以2表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結果用平均值±標準差表示，采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和鄧肯檢驗進行差異顯著性分析（＜0.05為差異顯著），使用Prism 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 TEPP對實驗小鼠空腸組織T-AOC、ROS濃度的影響

T-AOC用于判斷機體總抗氧化能力，同時也是全面反映酶和非酶抗氧化物的抗氧化能力的一個指標。高濃度的ROS會引起氧化應激反應，影響細胞核的形態(tài)和大小，損傷DNA堿基片段，導致細胞死亡。不同劑量的TEPP對實驗小鼠腸道T-AOC、ROS濃度的影響見圖2。

圖2 TEPP對小鼠腸道T-AOC（A）、ROS濃度（B）的影響Fig.2 Effect of TEPP on T-AOC (A) and ROS content (B) in the intestine of mice

由圖2可知，相比正常組，模型組小鼠腸道T-AOC下降了43.1%（＜0.05），ROS濃度升高了96.9%（＜0.05），說明模型組小鼠體內氧化還原平衡受到破壞，造模是成功的；陽性組T-AOC、ROS濃度恢復到了正常水平（＞0.05）；與模型組相比，茶多酚組的T-AOC上升了54.6%，ROS濃度降低了56.6%；高劑量組的T-AOC質量濃度上升了約2.2 倍，ROS濃度降低了72.8%，其余各劑量的TEPP也均使T-AOC有所上升而使ROS濃度降低，有明顯的改善氧化應激損傷的作用。與茶多酚組相比，高劑量組的T-AOC上升了47.1%，ROS濃度降低了37.3%，低、中、高劑量組之間的T-AOC和ROS濃度均存在顯著性差異（＜0.05），說明TEPP能夠提高小鼠腸道總抗氧化能力，降低ROS濃度，緩解氧化應激反應。

2.2 TEPP對實驗小鼠空腸組織中GR、HO-1活力的影響

Nrf2/ARE是重要的內源性抗氧化信號傳導通路，其下游信號包括兩個氧化還原系統(tǒng)。HO-1是抗氧化酶系統(tǒng)中的一員，是機體內抗氧化防御和調節(jié)鐵平衡的關鍵物質；GR是谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)的一員，通過將氧化型谷胱甘肽轉變成還原型谷胱甘肽而參與機體氧化應激損傷的調節(jié)。不同劑量的TEPP對實驗小鼠腸組織GR、HO-1活力的影響結果見圖3。

圖3 TEPP對小鼠腸道GR、HO-1活力的影響Fig.3 Effect of TEPP on GR and HO-1 activity in the intestine of mice

由圖3可見，與正常組比，模型組的GR、HO-1活力分別降低了48.3%、43.1%（＜0.05），說明氧化應激損傷了小鼠空腸組織的氧化還原調節(jié)系統(tǒng)；陽性組的上述指標恢復至正常水平（＞0.05）。與陽性組相比，茶多酚組的GR、HO-1活力分別升高了24.0%、9.6%（＜0.05）；高劑量組的GR、HO-1活力分別約為正常組的2 倍和1.5 倍（＜0.05），Zhao Yi等探究了鐵皮石斛多糖（dendrobium officinale polysaccharides，DOP）的抗氧化和胃癌預防作用，結果顯示與正常組比，9.6 g/kg高劑量的DOP使機體Nrf2、HO-1蛋白表達量增加了約2 倍，證明了DOP能夠通過激活Nrf2途徑和HO-1起到抗氧化作用，與本實驗結果一致。

與模型組相比，茶多酚組的GR、HO-1活力分別上升了約1.5、0.9 倍（＜0.05）；高劑量組的上述指標分別上升了約2.8、1.7 倍（＜0.05），相較于茶多酚組分別升高了51.4%、39.5%（＜0.05），表明實驗劑量范圍內，TEPP更能提升腸道抗氧化酶系統(tǒng)的活力。

2.3 TEPP對空腸組織TLR4、p38 mRNA表達量的影響

TLR4與炎性細胞因子和氧化應激密切相關，它通過MyD88和含Toll-白細胞介素1受體域的銜接子誘導干擾素-β啟動細胞內信號轉導，并被認為是多種疾病的調節(jié)劑。p38為MAPK的亞單位，磷酸化產物可激活Nrf2-keap1的解離，進一步激活Nrf2/ARE通路及其下游信號。不同劑量的TEPP對實驗小鼠空腸組織、mRNA表達量的影響結果見圖4。

圖4 TEPP對小鼠腸道中TLR4（A）、p38（B）mRNA表達量的影響Fig.4 Effect of TEPP on the mRNA expression of TLR4 (A) and p38 (B)in the intestine of mice

由圖4可知，與正常組相比，模型組的mRNA表達量升高了26.0%，mRNA表達量升高了約1.5 倍（＜0.05），說明氧化應激反應激活了TLR4/p38通路；陽性組使、的mRNA表達量恢復到正常水平（＞0.05）；與正常組相比，高劑量組、的mRNA表達量分別降低了17.8%、51.2%（＜0.05）。Fan Jingjing等研究顯示2 mg/mL的發(fā)酵人參以390 mg/（kggd）的劑量進行灌胃后，使小鼠肝臟組織中、mRNA表達量下降至正常組以下，表明發(fā)酵人參能夠調控TLR4相關信號通路。本實驗的研究結果顯示，TEPP能減弱氧化應激導致的mRNA的高表達，抑制MAPK磷酸化，證明其能夠通過TLR4/p38通路對氧化應激反應進行調節(jié)。

與模型組相比，茶多酚組、mRNA表達量分別降低了6.9%、28.8%（＜0.05），但未恢復到正常水平；高劑量TEPP可使、mRNA表達量分別降低39.1%、82.4%（＜0.05），低劑量TEPP對、mRNA表達量的影響與茶多酚組之間無顯著性差異（＞0.05）；中劑量、高劑量組、mRNA表達量無顯著性差異（＞0.05），說明在實驗劑量范圍內，TEPP對、mRNA表達量的抑制存在量-效關系，且劑量在100 mg/kg時，對、mRNA表達的抑制作用達到飽和。與茶多酚組相比，高劑量組、mRNA表達量分別降低了34.6%、75.3%（＜0.05），說明TEPP更能對TLR4/p38通路有抑制作用。

2.4 TEPP對空腸組織Nrf2、GR、HO-1 mRNA表達量的影響

通過觸發(fā)其下游靶基因，激活下游氧化還原系統(tǒng)相關基因的表達，是各種抗氧化劑和抗炎細胞因子的主要調節(jié)劑基因。不同劑量的TEPP對實驗小鼠空腸組織、、mRNA表達量的影響結果見圖5。

圖5 TEPP對小鼠腸道中Nrf2（A）、GR（B）、HO-1（C）mRNA表達的影響Fig.5 Effect of TEPP on the mRNA expression of Nrf2 (A), GR (B)and HO-1 (C) in the intestine of mice

由圖5可見，與正常組對比，模型組、、的mRNA表達量分別降低了32.8%、77.1%、31.1%（＜0.05），說明氧化應激反應破壞了Nrf2及其下游氧化還原系統(tǒng)的平衡。陽性組使上述損傷恢復到了正常水平（＞0.05）；TEPP高劑量組的上述指標均高于正常組。Huang Qincheng等實驗結果顯示，95 mg/kg VE使機體腸組織中、mRNA表達量上升且超過正常組，證明VE是通過調節(jié)Nrf2途徑來調節(jié)生物體氧化作用的，與本實驗結果類似。

與模型組相比，茶多酚組、、的mRNA表達量分別升高了21.9%、1.2 倍、16.2%（＜0.05）；高劑量組的上述指標分別升高了83.6%、8.3 倍、96.3%（＜0.05）。與茶多酚組相比，高劑量組的、、mRNA表達量分別升高了50.6%、3.2 倍、69.0%（＜0.05），低劑量組與茶多酚組上述指標間無顯著性差異（＞0.05），說明TEPP對腸道氧化應激反應的改善作用具有量-效關系，能通過調節(jié)Nrf2通路對-半乳糖引起的腸道氧化應激作用進行改善與修復。

3 討 論

TLRs是模式識別受體之一，能夠特異性識別信號分子，TLR4主要是內毒素的識別受體，兩者相結合可啟動下游信號，激活MAPK相關亞基的磷酸化，例如p38 MAPK的磷酸化能夠在某種程度上反映機體氧化應激狀態(tài)。Dong Na等研究顯示黃氏多糖能夠通過抑制內毒素刺激引起的p38 MAPK、ERK1/2 MAPK磷酸化來抑制趨化因子的產生，而改善空腸絨毛形態(tài)。氧化應激反應會引起腸道屏障損傷，導致大量腸道細菌和內毒素侵入組織和循環(huán)，促發(fā)各種腸道疾病。本實驗研究結果同樣證明，TEPP能夠通過減弱mRNA的表達，抑制MAPK磷酸化來起到抗氧化作用。

Nrf2/ARE通路是機體內源性抗氧化防御機制之一，在穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf2與其抑制劑蛋白Keap1相互結合保留在細胞質中，當細胞受到應激反應時，Nrf2與Keap1發(fā)生解離，進入細胞核，與核內Maf蛋白形成二聚體后與ARE結合，轉錄活化下游包括HO-1的抗氧化酶系統(tǒng)和包括GR的谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)，抗氧化劑的存在能夠上調下游信號物質。谷胱甘肽是細胞自衛(wèi)過程中必不可少的一員，谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)對維持細胞氧化還原狀態(tài)平衡起著至關重要的作用，保持機體內谷胱甘肽處于高水平，氧化型谷胱甘肽處于低水平，維持體內適當還原態(tài)環(huán)境。血紅素對真核生物血紅蛋白和肌紅蛋白的氧結合過程以及細胞代謝至關重要。HO-1可將血紅素代謝成膽綠素、一氧化碳和亞鐵離子，可以在病理生理條件下保持細胞和組織的體內穩(wěn)態(tài)。膽綠素及其還原產物膽紅素對羥自由基、超氧陰離子自由基等自由基有一定的清除作用。Shan Yingying等研究表明五味子多糖能通過上調和下游基因表達，并下調表達，而抑制氧化應激作用，證明了其機制與Nrf2/ARE和TLR4的調節(jié)密切相關，本實驗結果與此一致。

-半乳糖是現(xiàn)今較為公認的用于建立氧化應激模型的藥物，本實驗結果顯示，實驗所設計的劑量的TEPP能夠提高腸組織T-AOC和GR、HO-1活力，降低ROS質量濃度，降低、mRNA的表達，提高、、mRNA的表達，證明了TEPP具有抗氧化作用，且對腸組織氧化應激反應具有改善作用，這種抗氧化作用主要是通過p38 MAPK/Nrf2途徑實現(xiàn)的。同時，高劑量組與茶多酚組對比結果表明，在實驗劑量范圍內，TEPP的抗氧化效果優(yōu)于茶多酚單獨效果。結果為功能性食品的開發(fā)、化妝品的研發(fā)等提供部分理論依據(jù)，但在化妝品應用中需進一步對皮膚耐受等因素進行探究?，F(xiàn)有研究顯示茶多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖等單糖構成，茶多酚主要化學成分為兒茶素類、黃酮類、花青素類、酚酸類4大類物質，茶葉種類、加工方式、提取工藝對茶多糖的組成結構、茶多酚的組成均存在影響，同時不同品種地區(qū)的茶葉、不同比例的茶多糖及茶多酚產生的降血糖功效強弱各不相同，本實驗所用TEPP中茶多酚及茶多糖的具體組成結構及不同配比的茶多糖-茶多酚對腸氧化損傷改善效果仍需進一步研究。茶多糖、茶多酚存在降血糖血脂、改善炎癥、調節(jié)腸道菌群、抗氧化等功效，本實驗僅證明了在抗氧化方面，TEPP在實驗劑量范圍內略優(yōu)于茶多酚，對其他功效是否具有相同效果及其是否會產生副作用仍需考證。且本實驗所采用的并非純品的茶多糖及茶多酚的混合物，因此，不同品種、不同加工方式、不同提取工藝、不同比例的混合物對于各功效的影響同樣需要更深入的研究。

4 結 論

本實驗結果顯示，與模型組相比，TEPP高劑量組的T-AOC上升了約2.2 倍，GR、HO-1活力分別上升了約2.8、1.7 倍，ROS濃度降低了72.8%，、的mRNA表達量分別降低了39.1%、82.4%，、、的mRNA表達量分別升高了83.6%、8.3 倍、96.3%，且都存在顯著差異（＜0.05），證明了在本實驗劑量范圍內，TEPP能夠通過TLR4/p38/Nrf2通路改善-半乳糖誘導的小鼠腸道的氧化應激反應。