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    枸杞粉及其多糖對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠免疫及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

    2022-07-02 03:49:26閆亞美李曉鶯曹有龍曾曉雄
    食品科學(xué) 2022年11期
    關(guān)鍵詞:盲腸枸杞結(jié)腸

    羅 青,祿 璐,*,閆亞美,米 佳,李曉鶯,曹有龍,曾曉雄*

    (1.國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心,寧夏 銀川 750002;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210018)

    枸杞(L.)系茄科枸杞屬落葉灌木,是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用資源,富含多糖、類(lèi)胡蘿卜素、酚胺類(lèi)物質(zhì)及多種微量元素,在抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、提高免疫力、預(yù)防神經(jīng)損傷等方面均有較好效果。目前研究表明,枸杞在調(diào)節(jié)腸道菌群方面也具有積極作用。枸杞子粉對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌株有促進(jìn)作用,且益生元效應(yīng)與枸杞多糖(L.polysaccharides,LBP)、多酚含量密切相關(guān)。LBP能夠促進(jìn)細(xì)胞因子上調(diào),修護(hù)肝損傷,同時(shí)促進(jìn)小鼠與免疫相關(guān)的有益菌群相對(duì)豐度增加,從而調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群。

    近年來(lái),腸道菌群對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的重要貢獻(xiàn)已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。腸道菌群失衡與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),并通過(guò)刺激免疫反應(yīng)和保持上皮屏障來(lái)維持體內(nèi)平衡,因此,腸道菌群穩(wěn)態(tài)對(duì)免疫系統(tǒng)和腸道的發(fā)育和維持有重要作用。植物多糖可改善B和T巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖功能,提高白細(xì)胞吞噬能力,抑制脾組織細(xì)胞凋亡,促進(jìn)脾組織白細(xì)胞介素(interleukin-1β,IL-1β)基因表達(dá),從而增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能,同時(shí)促進(jìn)消化酶活性,調(diào)節(jié)腸道菌群組成、維護(hù)腸道微生態(tài)健康。但枸杞噴霧干燥粉作為普通食品單一食用或與LBP復(fù)配作為功能性食品對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用研究鮮有報(bào)道。

    環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)作為目前世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的抗腫瘤藥物及免疫抑制劑,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)破壞機(jī)體正常的免疫細(xì)胞,啟動(dòng)炎癥與抗炎反應(yīng),同時(shí)常伴有胃腸道不良反應(yīng)。研究表明,CTX可以改變腸道菌群的組成,多糖則可調(diào)節(jié)被CTX影響的腸道菌群的組成,從而調(diào)節(jié)宿主免疫。

    本研究以CTX致免疫低下的小鼠為模型,探尋枸杞粉(L.powder,LB)、LBP及其復(fù)配物對(duì)小鼠免疫力及腸道菌群穩(wěn)態(tài)的影響,為枸杞噴霧干燥粉、LBP及其復(fù)配物作為功能性食品等多用途的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、材料與試劑

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為BALB/c雄性小鼠,4 周齡,體質(zhì)量(20.0f0.5)g,購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物設(shè)施公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合南京動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的指導(dǎo)方針,小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)的動(dòng)物房?jī)?nèi)(溫度24~25℃、相對(duì)濕度70%~75%,照明方案為12 h/12 h光暗循環(huán)),由高壓滅菌處理的飲用水和飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。

    LB由國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心自制(中國(guó)銀川),利用枸杞鮮果經(jīng)清洗、打漿、均質(zhì)、噴霧干燥獲得,經(jīng)檢測(cè)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.3%;LBP(食品級(jí))購(gòu)自寧夏沃福百瑞枸杞產(chǎn)業(yè)股份有限公司,經(jīng)檢測(cè)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.8%;根據(jù)前期實(shí)驗(yàn),LB與LBP復(fù)配按照2∶1(/)混合均勻,獲得復(fù)配物(LB+LBP)。

    鹽酸左旋咪唑(levamisole hydrochloride,LH)、CTX 上海瑞恩生物技術(shù)有限公司;血清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)ELISA試劑盒、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)ELISA試劑盒 深圳欣博盛科技有限公司;TIANamp Stool DNA提取試劑盒 北京天根生物科技有限公司;MiniBEST universal RNA提取試劑盒、PrimeScript RT master mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TaKaRa生物工程有限公司;其他分析純?cè)噭┵?gòu)自上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    6890N氣相色譜儀、火焰離子化檢測(cè)器、HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 mh0.25 mmh0.25 μm) 美國(guó)Agilent公司;QuantStudio 6熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司。

    1.3 方法

    1.3.1 小鼠處理與分組

    將60只小鼠隨機(jī)分為6 組(=10),自由飲水飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。除了正常對(duì)照(NC)組的10只小鼠不作處理,其他組小鼠在第8、9、10天腹腔內(nèi)注射80 mg/(kggd)的CTX,建立CTX誘導(dǎo)的免疫抑制模型,枸杞噴霧干燥粉組(LB)、LBP組、LB與LBP復(fù)配(LB+LBP)組及LH組(作為陽(yáng)性對(duì)照)第11~20天按表1每日進(jìn)行灌胃處理。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察干預(yù)后小鼠的神志、精神、食欲、活動(dòng)等體征,每2 d測(cè)定一次體質(zhì)量以及食物消耗量(即采食量),計(jì)算體質(zhì)量增長(zhǎng)比和采食量,并于第21天早上股動(dòng)脈采血,收集血樣后,用頸椎脫位法處死小鼠,血液經(jīng)3 000 r/min離心15 min(4 ℃)后收集血清于4 ℃冰箱存放。收集肝臟、盲腸內(nèi)容物、結(jié)腸和糞便在無(wú)菌離心管中,并在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)期間小鼠飼養(yǎng)采取自由攝食、飲水的原則,并保持自然光照和籠內(nèi)衛(wèi)生清潔。

    表1 實(shí)驗(yàn)分組及灌胃處理Table 1 Experimental grouping and intragastrical administration

    1.3.2 體質(zhì)量增長(zhǎng)比的測(cè)定

    體質(zhì)量增長(zhǎng)比通過(guò)式(1)計(jì)算。

    式中:為上次體質(zhì)量/g;為本次所測(cè)體質(zhì)量/g。

    1.3.3 臟器指數(shù)的測(cè)定

    胸腺和脾臟采集后稱(chēng)質(zhì)量,按以下公式(2)~(3)計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)。

    1.3.4 血清細(xì)胞因子質(zhì)量濃度測(cè)定

    股動(dòng)脈采血,3 000 r/min離心15 min(4 ℃)制備血清,即獲得淋巴細(xì)胞懸液,每孔加7.5h10個(gè)/mL的淋巴細(xì)胞懸液1 mL和刺激原質(zhì)量濃度4 μg/mL刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)稀釋液1 mL,置于37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h,2 500 r/min離心5 min,收集細(xì)胞上清液(血清)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,采用ELISA法測(cè)定小鼠血清IL-1β、TNF-α、IFN-γ及IgA質(zhì)量濃度。

    1.3.5 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)分析

    將結(jié)腸用10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋。石蠟切片(厚度5 μm)用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。結(jié)腸組織經(jīng)脫水、包埋、切片及HE染色處理后,在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理情況,并采集圖像。

    1.3.6 結(jié)腸組織RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR分析

    采用MiniBEST universal RNA提取試劑盒,從20 mg結(jié)腸樣本中提取總RNA,檢測(cè)RNA的濃度和純度。隨后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑將500 ng的RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(37 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min后,85 ℃反應(yīng)5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活),-80 ℃儲(chǔ)存。準(zhǔn)備10 μL的反應(yīng)體系(1 μL引物、4 μL的cDNA和5 μL的SYBR Green Fast Mix試劑),使用QuantStudio 6熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為內(nèi)參,目標(biāo)基因(、、、、、、、和)的相對(duì)表達(dá)量采用2計(jì)算。

    1.3.7 盲腸內(nèi)容物和糞便中短鏈脂肪酸含量的測(cè)定

    取50 mg盲腸內(nèi)容物或糞便與250 μL去離子水混合,以0.2 mol/L鹽酸配制濃度為25 mmol/L的2-乙基丁酸溶液作為內(nèi)標(biāo),將150 μL的盲腸內(nèi)容物漿液與150 μL的內(nèi)標(biāo)溶液混合后,8 000 r/min離心5 min,取上清過(guò)膜備用。參照Ding Yu等方法,利用氣相色譜法測(cè)定短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的含量。

    1.3.8 腸道菌群分析

    采用高通量測(cè)序技術(shù)分析LB及LBP對(duì)小鼠腸道菌群的影響。根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠糞便樣品的基因組DNA,所有DNA樣品干冰儲(chǔ)存并運(yùn)送到杭州聯(lián)川生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序工作。使用的引物擴(kuò)增引物序列為Primer F:341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)及Primer R:805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’),對(duì)16S rDNA(V3+V4)可變區(qū)進(jìn)行PCR。根據(jù)雙端序列的重疊區(qū),將R1、R2序列拼接成長(zhǎng)的標(biāo)簽序列,并使用cutadapter軟件去除小段序列以及引物序列。然后過(guò)濾低質(zhì)量序列,采用Vsearch(v2.3.4)軟件過(guò)濾嵌合體。使用DADA2算法進(jìn)行降噪后,得到特征表和特征序列,分析腸道菌群多樣性、多樣性及組成。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析,<0.05表示差異顯著。在腸道菌群分析中,多樣性和多樣性通過(guò)抽平(將所有樣本的序列數(shù)抽取至最少序列樣本的序列數(shù))的方式來(lái)進(jìn)行歸一化,物種注釋使用相對(duì)豐度來(lái)進(jìn)行歸一化處理,由R(v3.5.2)軟件包繪制圖形。物種注釋采用QIIME2ruNJINO的插件featureclassifier進(jìn)行序列比對(duì),比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為SILVA和NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù),以SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果為準(zhǔn)。采用Tukey HSD檢驗(yàn)計(jì)算兩組間相對(duì)豐度的差異(<0.05)。利用PICRUSt軟件分析來(lái)解釋京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代謝通路,采用STAMP(v2.1.3)軟件通過(guò)Welsh’s檢驗(yàn)(<0.05)對(duì)差異KEGG代謝通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同處理對(duì)小鼠體質(zhì)量和采食量的影響

    如圖1所示,MC組小鼠在用CTX處理后,體質(zhì)量和日采食量均明顯下降,說(shuō)明造模成功。第9天后,MC組的小鼠體質(zhì)量和日采食量呈現(xiàn)逐漸恢復(fù)的趨勢(shì),但增長(zhǎng)緩慢,而LB、LBP及LB+LBP組,小鼠體質(zhì)量和采食量逐漸趨于NC組和LH組,說(shuō)明LB、LBP及復(fù)配物均可較好地恢復(fù)小鼠體質(zhì)量和采食量,LBP和LB+LBP干預(yù),比LB干預(yù)更能有效地恢復(fù)小鼠的體質(zhì)量。Xia Hui等研究表明服用LBP對(duì)健康成年男性的體質(zhì)量及體質(zhì)量指數(shù)并無(wú)顯著影響,但可顯著降低血清甘油三酯和高密度脂蛋白指數(shù)。因此,推測(cè)可能是通過(guò)LBP提高機(jī)體免疫力從而恢復(fù)采食量和體質(zhì)量。

    圖1 LB、LBP和LB+LBP處理對(duì)小鼠體質(zhì)量(A)和日采食量(B)的影響Fig.1 Effects of LB, LBP and LB + LBP on body mass (A) and feed intake (B) of mice

    2.2 不同處理對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

    胸腺和脾臟是機(jī)體的主要免疫器官,其質(zhì)量的改變可以反映受試藥物對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激作用,因此,胸腺和脾臟指數(shù)被認(rèn)為是反映免疫功能的重要指標(biāo)。由圖2可知,與NC組相比,MC組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著下降(<0.05),說(shuō)明CTX可以誘導(dǎo)小鼠免疫低下。與MC組比較,LB、LBP和LB+LBP組的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高(<0.05),說(shuō)明LB、LBP和LB+LBP混合干預(yù)均對(duì)CTX所致的小鼠脾臟、胸腺損傷有一定的改善作用。與LB干預(yù)相比,LBP和LB+LBP混合干預(yù)能更有效地改善小鼠脾臟和胸腺損傷,且與NC組相比無(wú)顯著性差異(>0.05)。其中LB+LBP組對(duì)小鼠脾臟損傷的恢復(fù)效果比LBP組好,但對(duì)于胸腺指數(shù),LB組和LB+LBP組之間沒(méi)有顯著差異(>0.05)。

    圖2 LB、LBP和LBLBP處理對(duì)小鼠脾臟指數(shù)(A)和胸腺指數(shù)(B)的影響Fig.2 Effects of LB, LBP and LB + LBP on spleen index (A) and thymus index (B) of mice

    2.3 不同處理對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子和IgA產(chǎn)生量的影響

    細(xì)胞因子大多是一些小分子可溶性蛋白質(zhì),通過(guò)刺激免疫細(xì)胞及某些非免疫細(xì)胞合成釋放,可以直接參與多種免疫功能。此外,研究表明巨噬細(xì)胞可通過(guò)各種受體與多糖或糖蛋白結(jié)合,從而分泌細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α以殺死腫瘤細(xì)胞。通常CTX的誘導(dǎo)可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)白細(xì)胞比例失衡,增加中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞比例,減少淋巴細(xì)胞比例。如圖3所示,與NC組相比,MC組小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和免疫球蛋白IgA的質(zhì)量濃度顯著下降(<0.05);與MC組比較,LB、LBP、LB+LBP組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IgA質(zhì)量濃度均顯著上調(diào)(<0.05),與Ding Yu等發(fā)現(xiàn)利用LBP可促進(jìn)免疫低下小鼠細(xì)胞因子分泌的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LB、LBP及LB+LBP均可促進(jìn)CTX致免疫抑制型小鼠分泌細(xì)胞因子,從而增強(qiáng)小鼠非特異性免疫應(yīng)答。還有學(xué)者通過(guò)將枸杞與脫脂乳均質(zhì)添加在小鼠的日常飲食中來(lái)促進(jìn)小鼠T細(xì)胞增殖,從而提高小鼠免疫應(yīng)答,降低流感感染率。

    圖3 LB、LBP和LBLBP處理對(duì)血清中細(xì)胞因子TNF-α(A)、IFN-γ(B)、IL-1β(C)和IgA(D)質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effects of LB, LBP and LB + LBP on serum levels of TNF-α(A),IFN-γ (B), IL-1β (C) and IgA (D)

    2.4 不同處理對(duì)小鼠結(jié)腸組織的影響

    光學(xué)顯微鏡下小鼠結(jié)腸組織形態(tài)如圖4所示。NC組小鼠結(jié)腸組織具有完整的結(jié)腸黏膜、隱窩、皺褶,且結(jié)構(gòu)整齊,排列緊密。而MC組結(jié)腸黏膜損傷較嚴(yán)重,伴有隱窩增生、上皮細(xì)胞損傷和基底淋巴聚集現(xiàn)象。而通過(guò)LB、LBP、LB+LBP和LH的干預(yù),結(jié)腸組織形態(tài)恢復(fù)較好,幾乎接近NC組,且LBP和LB+LBP組杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯增加,杯狀細(xì)胞可促進(jìn)分泌黏蛋白,形成黏膜屏障。因此,LB、LBP和LB+LBP干預(yù)可明顯改善CTX誘導(dǎo)的結(jié)腸組織損傷,進(jìn)而改善腸道屏障功能。

    圖4 LB、LBP和LBLBP處理組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察(×20)Fig.4 Histopathological observation of colon sections of mice treated with LB, LBP and LB + LBP (× 20)

    2.5 不同處理對(duì)小鼠結(jié)腸相關(guān)基因表達(dá)的影響

    如圖5所示,與NC組相比,CTX可顯著降低結(jié)腸中、、、、、、和的表達(dá)水平(<0.05)。與MC組相比,LB干預(yù)顯著提高了結(jié)腸中細(xì)胞因子的表達(dá)量(<0.05),LBP干預(yù)顯著提高了、及SCFAs受體的表達(dá)量(<0.05);LB+LBP干預(yù)顯著提高了、、和的表達(dá)量;LH干預(yù)顯著提高了、、、、的表達(dá)量。緊密連接蛋白和表達(dá)水平的降低與屏障功能障礙和腸上皮細(xì)胞旁通透性的增加密切相關(guān),對(duì)維持腸道屏障功能具有重要作用。MUC2是一種黏蛋白,由結(jié)腸杯狀細(xì)胞產(chǎn)生,在細(xì)菌攻擊時(shí)可保護(hù)宿主組織免于暴露。以上結(jié)果表明,LBP作為枸杞中的重要的活性成分比LB更有效提高結(jié)腸中上述基因的表達(dá),且LB+LBP混合干預(yù)對(duì)、、和的提高作用優(yōu)于單獨(dú)LBP干預(yù),推測(cè)LB和LBP在提高結(jié)腸相關(guān)基因表達(dá)方面可能存在協(xié)同效應(yīng)。

    圖5 LB、LBP和LBLBP處理對(duì)小鼠結(jié)腸中基因ZO-1(A)、Occludin(B)、Claudin-1(C)、MUC2(D)、GPR41(E)、GPR43(F)、TNF-α(G)、IFN-γ(H)和IL-6(I)相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of LB, LBP and LB + LBP on relative expression levels of ZO-1 (A), Occludin (B), Claudin-1 (C), MUC2 (D), GPR41 (E), GPR43 (F),TNF-α (G), IFN-γ (H) and IL-6 (I) in the colon of mice

    2.6 不同處理對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs的影響

    SCFAs是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物,在維持腸道正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能方面發(fā)揮著重要的作用。如表2所示,與NC組相比,MC組的盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs的含量均明顯下降。與MC組相比,LB、LBP、LB+LBP和LH干預(yù)后,小鼠盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs含量得到了不同程度的提高。與MC組相比,LB干預(yù)整體上顯著提高了盲腸內(nèi)容物和糞便中各SCFAs和總SCFAs含量(<0.05);LBP干預(yù)顯著提高了盲腸內(nèi)容物中丙酸、正丁酸、正戊酸和異戊酸的含量以及糞便中乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、異戊酸和總SCFAs的含量(<0.05);LB+LBP干預(yù)顯著提高了盲腸內(nèi)容物中丙酸、正丁酸、正戊酸和異戊酸的含量以及糞便中丙酸、正戊酸、異戊酸和總SCFAs的含量(<0.05),因此,LB對(duì)促進(jìn)小鼠腸道菌群代謝具有顯著的積極作用。研究表明,SCFAs可以在各種細(xì)胞途徑中充當(dāng)信號(hào)分子,乙酸、丙酸和丁酸與SCFAs受體GPR41、GPR43和GPR109A密切相關(guān),GPR41和GPR43可激活上皮細(xì)胞的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和p38促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路,促進(jìn)趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此,LB、LBP、LB+LBP可能通過(guò)激活免疫相關(guān)途徑從而促進(jìn)腸道菌群產(chǎn)生SCFAs。

    表2 小鼠盲腸和糞便中SCFAs含量Table 2 Effects of LB, LBP and LB + LBP on contents of SCFAs in cecum and feces of mice

    2.7 不同處理對(duì)CTX誘導(dǎo)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

    2.7.1 腸道菌群多樣性分析

    多樣性指數(shù)可評(píng)估腸道菌群的豐富性和多樣性。如圖6A~C所示,與NC組相比,MC組中Chao1指數(shù)顯著降低(<0.05),而與MC組相比,除了LB組的Simpson指數(shù)不存在顯著差異外,LB、LBP組和LB+LBP組的Chao1、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著升高(<0.05),說(shuō)明LB、LBP和LB+LBP處理均可提高腸道菌群多樣性。多樣性可度量不同樣本間菌群組成的相似度。如圖6D、E所示,MC組腸道菌群組成與其他各組存在明顯差異,說(shuō)明CTX誘導(dǎo)免疫抑制小鼠,其腸道菌群組成發(fā)生了明顯變化,NC、LB、LBP、LB+LBP和LH組樣本間的距離相近,表明通過(guò)LB、LBP和LB+LBP干預(yù)可促進(jìn)免疫抑制小鼠腸道菌群恢復(fù)正常。

    圖6 小鼠腸道菌群α多樣性和β多樣性分析Fig.6 Alpha-diversity index and β-diversity index analysis of gut microbiota

    2.7.2 小鼠腸道菌群組成分析

    如圖7所示,所有組的小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)組成,占菌落總數(shù)的90%以上,其次是-變形菌門(mén)(Epsilonbacteraeota)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)。與MC組相比,LB、LBP和LB+LBP干預(yù)能夠顯著增加Bacteroidetes相對(duì)豐度(<0.05),同時(shí)顯著減少Firmicutes、Epsilonbacteraeota和Proteobacteria的相對(duì)豐度(<0.05),與Ding Yu、聶啟興、Tian Baoming、Huang Kaiyin等的研究結(jié)果一致,表明LB、LBP、LB+LBP干預(yù)可顯著降低Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)比例。LBP可能是降低F/B比例的主要功效成分。

    圖7 小鼠腸道菌群門(mén)水平上的相對(duì)豐度分布和主要門(mén)的相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of gut microbiota at phylum level and relative abundance of major phyla

    在科水平上,檢測(cè)出小鼠的腸道菌群主要由12個(gè)菌科組成,如圖8A所示,其中Muribaculaceae的相對(duì)豐度最高。與NC組相比,MC組小鼠腸道菌群中Muribaculaceae和Prevotellaceae的相對(duì)豐度顯著降低(<0.05),Lachnospiraceae、Helicobacteraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales_unclaasified、Desulfovibrionaceae、Deferribacteraceae的相對(duì)豐度顯著增加(<0.05)。與MC組相比,LB、LBP、LB+LBP及LH干預(yù)后可顯著增加Muribaculaceae的相對(duì)豐度(<0.05),略增加Prevotellaceae的相對(duì)豐度,同時(shí)顯著抑制Lachnospiraceae、Helicobacteraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales_unclaasified(除LBP組)、Desulfovibrionaceae、Deferribacteraceae相對(duì)豐度(<0.05)(圖8B~I(xiàn))。目前研究認(rèn)為,Prevotellaceae是腸道內(nèi)促SCFAs產(chǎn)生的菌屬,也是腸道微生物水解膳食纖維的關(guān)鍵成員,其相對(duì)豐度與TGF-β3有關(guān),而TGF-β3是一種能調(diào)節(jié)腸道屏障功能的細(xì)胞因子,對(duì)于腸道菌群的健康恢復(fù)具有重要作用。Desulfovibrionaceae可產(chǎn)生細(xì)胞毒性化合物硫化氫,破壞腸上皮細(xì)胞并誘導(dǎo)黏膜啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。Huang Kaiyin等采用CTX誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型致使小鼠結(jié)腸內(nèi)Muribaculaceae、Saccharimonadaceae、Peptococcaceae相對(duì)豐度下調(diào),而Rikenellaceae、Lactobacillaceae、Helicobacteraceae、Bacteroidaceae、Marinifilaceae、Deferribacteraceae、Tannerellaceae、Enterobacteriaceae、Streptococcaceae的相對(duì)豐度均上調(diào);Ding Yu等通過(guò)LBP的干預(yù)也可顯著提高CTX誘導(dǎo)的小鼠腸道中Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Deferribacteraceae、Desulfovibrionaceae、Anaeroplasmataceae的相對(duì)豐度,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。

    圖8 科水平上腸道微生物相對(duì)豐度與主要科水平的比較分析Fig.8 Relative abundance of gut microbiota at family level and comparative analysis of relative abundance of major families

    如圖9所示,在由CTX誘導(dǎo)改變小鼠腸道菌群組成中,可被LB、LBP、LB+LBP調(diào)節(jié)的菌屬包括11種_unclassified、7種、2種、1種、1種、2種_unclassified,其中18種菌屬相對(duì)豐度增加(_unclassified、),6種菌屬相對(duì)豐度減少(、、、_unclassified)。本實(shí)驗(yàn)從小鼠糞便中檢測(cè)出眾多可被LB、LBP、LB+LBP調(diào)節(jié)的Muribaculaceae細(xì)菌群,研究表明,Muribaculaceae屬于擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),在小鼠腸道菌群中占主導(dǎo)地位,由于它們的培養(yǎng)時(shí)間較晚,家族分類(lèi)還不明確,其相對(duì)豐度與丙酸含量有很強(qiáng)的相關(guān)性,是Spalax鼠長(zhǎng)壽相關(guān)的主要細(xì)菌類(lèi)群。此外,相較于LBP干預(yù),LB、LB+LBP干預(yù)能夠降低產(chǎn)毒素Clostridiales相對(duì)豐度,增加有益菌的相對(duì)豐度,LB+LBP干預(yù)則可降低厭氧菌的相對(duì)豐度。Clostridiales的分布、表達(dá)與腹瀉型胃腸疾病患者的腸道菌組成、SCFAs水平密切相關(guān),是腸易激綜合征潛在的生物標(biāo)志物。、在正常小鼠體內(nèi)碳水化合物代謝的表達(dá)較高,在高膳食膽固醇導(dǎo)致小鼠脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化的實(shí)驗(yàn)中,腸道、和在不同階段明顯聚集,且相對(duì)豐度依次增加。因此,LB、LB+LBP還調(diào)節(jié)了與糖脂代謝相關(guān)菌群的相對(duì)豐度。

    圖9 小鼠腸道菌群組成Fig.9 Composition of gut microbiota

    采用PICRUSt軟件進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析,與NC組相比,MC組小鼠由于CTX誘導(dǎo)共有29 條通路(22 條富集,7 條缺失)發(fā)生改變。CTX處理導(dǎo)致富集的通路經(jīng)過(guò)LB、LBP、LB+LBP干預(yù)后明顯減少,如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境適應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄、異種生物降解和代謝等,CTX處理導(dǎo)致缺失的通路經(jīng)過(guò)LB、LBP、LB+LBP干預(yù)后富集,如免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、能量代謝、氨基酸代謝等,此外,碳水化合物代謝和脂代謝也都富集。因此,通過(guò)LB、LBP、LB+LBP干預(yù)不僅逆轉(zhuǎn)了由CTX處理改變的腸道菌群代謝功能異常,并使其趨于NC組,還調(diào)節(jié)了碳水化合物代謝和脂代謝,表明LB、LBP及LB+LBP在調(diào)節(jié)糖脂代謝菌群具有潛在功效。

    3 結(jié) 論

    LB、LBP及其復(fù)配物(LB+LBP)均可不同程度地恢復(fù)免疫抑制小鼠的體質(zhì)量和采食量,改善小鼠的脾臟和胸腺損傷,有效促進(jìn)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IgA的分泌,調(diào)節(jié)結(jié)腸中免疫相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生,顯著調(diào)節(jié)_unclassified、、、、、等菌的相對(duì)豐度(<0.05),逆轉(zhuǎn)腸道菌群代謝功能異常,并使其趨于正常。但相較于LBP,LB、LB+LBP還可降低產(chǎn)毒素Clostridiales相對(duì)豐度,增加有益菌的相對(duì)豐度,LB+LBP還可降低厭氧菌的相對(duì)豐度,是潛在益生元的良好來(lái)源。本研究結(jié)果將為開(kāi)拓多元化枸杞產(chǎn)品及研發(fā)功效針對(duì)性的枸杞健康產(chǎn)品和提供理論依據(jù)。

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