3種乳制品對(duì)低免疫力模型斑馬魚免疫功能的影響

史 珅，李昊虬，王 龍，李 楠，譚圣杰，劉 華，彭桂英，李亞蘭，張 沖，F(xiàn)ENG HAOTIAN,*

（1.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029）

飲奶在我國(guó)歷史悠久，是國(guó)人日常膳食的重要組成部分?！?021中國(guó)奶商指數(shù)報(bào)告》顯示，中國(guó)堅(jiān)持每天攝入乳制品的人群規(guī)模約為3.6億 人，仍有超過(guò)10億 人尚未形成喝奶的習(xí)慣，但是國(guó)家衛(wèi)生健康委于2020年發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎防治營(yíng)養(yǎng)膳食指導(dǎo)》提出，科學(xué)合理的營(yíng)養(yǎng)膳食能有效改善營(yíng)養(yǎng)狀況、增強(qiáng)抵抗力，有助于新型冠狀病毒感染的肺炎防控與救治，倡導(dǎo)國(guó)人盡量保證每天“300 g奶及奶制品”以及“吃各種各樣的奶及其制品”，可見(jiàn)乳及乳制品對(duì)維持國(guó)民健康的重要意義。王磊等的研究表明乳蛋白包括酪蛋白和乳清蛋白，其中牛乳中的乳清蛋白包括-乳球蛋白、-乳白蛋白、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）、乳鐵蛋白等生物活性蛋白質(zhì)，不僅均衡了氨基酸的組成結(jié)構(gòu)、易于吸收，還具有抑菌、緩解機(jī)體炎癥、改善腸道健康、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生理功效。此外，牛乳中低聚糖、溶菌酶、細(xì)胞因子等免疫活性物質(zhì)可以直接或間接激活免疫系統(tǒng)，在改善睡眠、預(yù)防過(guò)敏和哮喘、預(yù)防和改善骨質(zhì)疏松等方面發(fā)揮重要作用。乳制品是以奶為基本原料，利用加熱、發(fā)酵、干燥或混合其他物質(zhì)等方式制成的液態(tài)或固態(tài)食品，包括超高溫滅菌乳、發(fā)酵乳、冰淇淋、奶粉、奶酪等形式?，F(xiàn)代研究表明，乳制品能夠提供人體必需的VB、VA、鈣等營(yíng)養(yǎng)素，且其營(yíng)養(yǎng)素的吸收利用率高于其他食品，有助于提高人體免疫力。除此之外，不同的加工工藝和貯存條件能夠影響牛乳及乳制品中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，但是對(duì)其發(fā)揮免疫功效的影響尚不清楚。

斑馬魚是一種新型的模式生物，具有個(gè)體小、繁殖快、與人類基因同源性高等優(yōu)點(diǎn)。斑馬魚的免疫系統(tǒng)分為天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)，其天然免疫系統(tǒng)相關(guān)基因組與人類具有高度保守性，包括免疫細(xì)胞、免疫分子以及免疫應(yīng)答方式。近年來(lái)，利用熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚模型來(lái)評(píng)價(jià)產(chǎn)品增強(qiáng)免疫功能的研究報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，斑馬魚已然成為研究天然免疫系統(tǒng)的常用動(dòng)物模型。因此，本研究采用靜脈注射酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液建立斑馬魚免疫功能損傷模型，通過(guò)分析巨噬細(xì)胞數(shù)量、巨噬細(xì)胞吞噬功能和T淋巴細(xì)胞數(shù)量，探討3種常見(jiàn)加工方式乳制品（低溫酸奶、常溫純牛奶和冷凍酸奶冰淇淋）對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫功能的影響，以期為消費(fèi)者提供更加營(yíng)養(yǎng)美味的乳制品。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

本研究選取了3種品系的斑馬魚開展實(shí)驗(yàn)，分別為轉(zhuǎn)基因巨噬細(xì)胞熒光斑馬魚（品系代號(hào)：Tg（coro1a:EGFP）hkz04tTg/+）、野生型AB品系斑馬魚、轉(zhuǎn)基因T淋巴細(xì)胞熒光斑馬魚（品系代號(hào)：Tg（rag2:DsRed）zf411Tg），均由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司提供。斑馬魚養(yǎng)殖以自然成對(duì)交配繁殖方式，按照實(shí)驗(yàn)需要選取同品系斑馬魚雌雄比例1∶2放置于產(chǎn)卵缸，每次交配準(zhǔn)備4～5 對(duì)成年斑馬魚，采用隔板將雌雄斑馬魚隔開，次日光照前抽離隔板，使其自由受精，從抽離隔板開始計(jì)時(shí)，至抽離隔板2 h后收集受精卵，平均每對(duì)能產(chǎn)200～300 枚胚胎。在受精后6 h和24 h對(duì)死亡胚胎進(jìn)行清理移除，并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為450～550 μS/cm；pH值為6.5～8.5；硬度為50～100 mg/L CaCO），飼養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與評(píng)估協(xié)會(huì)要求（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理小組許可證號(hào)：001458）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（2012-0171）。

全脂滅菌純牛奶（常溫純牛奶），執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB 25190ü2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 滅菌乳》，由內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；活菌冰淇淋（冷凍酸奶冰淇淋），執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)9.Q/NYLC 0014S《冷凍酸奶冰淇淋》，由內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；全脂發(fā)酵酸奶（低溫酸奶），執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB 19302ü2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》，為市售某品牌杯裝增強(qiáng)免疫力功能保健食品酸奶，作為功能對(duì)照使用。

酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液（以下簡(jiǎn)稱“長(zhǎng)春瑞濱”）杭州民生藥業(yè)有限公司；過(guò)碳酸鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；熒光微球 中國(guó)Sigma-Aldrich公司。

斑馬魚培養(yǎng)水（養(yǎng)魚用水）為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng) 北京愛(ài)生科技有限公司；SZX7解剖顯微鏡 日本OLYMPUS公司；CCD相機(jī)上海土森視覺(jué)科技有限公司；AZ100電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡 日本Nikon公司；CP214精密電子天平美國(guó)OHAUS公司；IM300顯微注射儀、PC-10拉針儀日本Narishige公司。

1.3 方法

1.3.1 乳制品的生產(chǎn)工藝流程

常溫純牛奶：收奶→過(guò)濾→冷卻貯存→（脫氣→均質(zhì)→）預(yù)殺菌→（脫氣→均質(zhì)→）超高溫滅菌→冷卻灌裝→包裝→出廠。

冷凍酸奶冰淇淋：首先制作酸奶基料和雪糕基料，酸奶基料：奶粉水合→混料→循環(huán)→定容→預(yù)熱→脫氣→均質(zhì)→殺菌→降溫→接種→發(fā)酵；雪糕基料：混料→循環(huán)→定容→預(yù)熱→脫氣→均質(zhì)→殺菌→降溫→接種。然后將酸奶基料和雪糕基料混合、乳化、降溫后得到冷凍酸奶冰淇淋成品，包裝后出廠。

1.3.2 營(yíng)養(yǎng)成分分析方法

蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照GB 5009.5ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》規(guī)定的方法測(cè)定；脂肪含量按照GB 5009.6ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》規(guī)定的方法測(cè)定；碳水化合物含量按照GB/Z 21922ü2008《食品營(yíng)養(yǎng)成分基本術(shù)語(yǔ)》規(guī)定的方法測(cè)定；鈣含量按照GB 5009.92ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測(cè)定》規(guī)定的方法測(cè)定；活性乳酸菌數(shù)量按照GB 4789.35ü2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》規(guī)定的方法測(cè)定。營(yíng)養(yǎng)素參考值（nutrient reference values，NRV）是食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽上比較食品營(yíng)養(yǎng)成分含量的參考標(biāo)準(zhǔn)，是消費(fèi)者選擇食品時(shí)的一種營(yíng)養(yǎng)參照尺度，NRV計(jì)算如公式（1）所示。

式中：為100 g食物中某營(yíng)養(yǎng)素質(zhì)量/g，RNI為食物營(yíng)養(yǎng)素推薦攝入量（recommended nutrient intake）/g。

1.3.3 免疫低下斑馬魚模型制備

將質(zhì)量濃度為10 mg/mL酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液用新鮮的斑馬魚培養(yǎng)水配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的應(yīng)用液備用。斑馬魚胚胎發(fā)育至受精后3 d自然脫膜后，挑選發(fā)育正常已開口攝食的斑馬魚，通過(guò)顯微注射的方式靜脈注射質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL長(zhǎng)春瑞濱10 nL建立斑馬魚免疫低下模型，表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞數(shù)量減少、巨噬細(xì)胞吞噬功能減弱和T淋巴細(xì)胞減少。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給樣方法

按照隨機(jī)分組法將受精后3 d發(fā)育正常的斑馬魚隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、低溫酸奶組、常溫純牛奶組、冷凍酸奶冰淇淋組，每組30 尾，斑馬魚培養(yǎng)水體積為20 mL，每組均加入0.5 mg質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%過(guò)碳酸鈉增氧。根據(jù)保健食品人體日推薦劑量等效換算，低溫酸奶組、常溫純牛奶組、冷凍酸奶冰淇淋組分別給予質(zhì)量濃度為8 333 μg/mL低溫酸奶、70.4 μg/mL常溫牛奶、33 333 μg/mL冷凍酸奶冰淇淋各3 mL，分別相當(dāng)于200 g低溫酸奶人體每日推薦量、250 mL常溫純牛奶人體每日食用量和50 g冷凍酸奶冰淇淋人體每日食用量。將給樣后的燒杯放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每間隔24 h換一次培養(yǎng)液。

1.3.5 對(duì)巨噬細(xì)胞數(shù)量減少的保護(hù)作用的測(cè)定

選用受精后3 d轉(zhuǎn)基因巨噬細(xì)胞熒光斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，乳制品連續(xù)處理4 d后，每組隨機(jī)選取10 尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照，利用圖像處理軟件NIDS-Element’s進(jìn)行圖像分析，統(tǒng)計(jì)斑馬魚泄殖孔至尾部靜脈中巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度總和（），以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果分別評(píng)價(jià)不同乳制品對(duì)巨噬細(xì)胞數(shù)量減少的改善作用，計(jì)算如公式（2）所示。

1.3.6 對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的保護(hù)作用的測(cè)定

選用受精后3 d野生型AB品系斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將熒光微球作為異物，0.4 mg/mL長(zhǎng)春瑞濱和熒光微球按體積比1∶1制成混合液靜脈注射受精后3 d的斑馬魚，注射體積為10 nL/尾，建立免疫功能損傷模型同時(shí)以異物引發(fā)巨噬細(xì)胞吞噬行為。乳制品連續(xù)處理4 d后，每組隨機(jī)選取10 尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照，用Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)斑馬魚體內(nèi)剩余熒光顆粒的數(shù)量（），以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果分別評(píng)價(jià)不同乳制品對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的改善作用，計(jì)算如公式（3）所示。

1.3.7 對(duì)T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的保護(hù)作用的測(cè)定

選用受精后4 d轉(zhuǎn)基因T淋巴細(xì)胞熒光斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，乳制品連續(xù)處理1 d后，每組隨機(jī)選取10 尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照，利用圖像處理軟件NIDS-Element’s進(jìn)行圖像分析，統(tǒng)計(jì)斑馬魚T細(xì)胞熒光強(qiáng)度（），以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果分別評(píng)價(jià)不同乳制品對(duì)T細(xì)胞數(shù)量減少的改善作用，計(jì)算如公式（4）所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立檢驗(yàn)，＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種奶制品營(yíng)養(yǎng)成分和活性菌群成分分析

2.1.1 常溫純牛奶檢測(cè)結(jié)果

常溫純牛奶的主要營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)結(jié)果如表1所示。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3.32f0.03）%，NRV為5%，優(yōu)于滅菌乳蛋白質(zhì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 25190ü2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 滅菌乳》基線（2.9%），即每包250 mL常溫純牛奶滿足12.5%的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素推薦攝入量；脂肪含量為（3.98f0.08）g/100 g，NRV為6%，優(yōu)于滅菌乳脂肪GB 25190ü2010基線（3.1%），即每包250 mL常溫純牛奶滿足15%的脂肪營(yíng)養(yǎng)素推薦攝入量；碳水化合物含量為（4.93f0.19）g/100 g，NRV為2%，即每包250 mL常溫純牛奶提供的碳水化合物的量約合推薦攝入量的5%；鈣含量為（118.60f2.29）mg/100 g，NRV為13%，即每包250 mL常溫牛奶滿足32.5%的鈣營(yíng)養(yǎng)素推薦攝入量。

表1 常溫純牛奶的營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)結(jié)果（n＝5）Table 1 Results of determination of nutritional components in normal temperature milk (n = 5)

2.1.2 冷凍酸奶冰淇淋檢測(cè)結(jié)果

冷凍酸奶冰淇淋的營(yíng)養(yǎng)成分和活性菌群檢測(cè)結(jié)果如表2所示。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3.25f0.02）%，NRV為5%，即每份50 g冷凍酸奶冰淇淋滿足2.5%的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素推薦攝入量；脂肪含量為（8.78f0.17）g/100 g，NRV為10%，即每份50 g冷凍酸奶冰淇淋滿足5%的脂肪營(yíng)養(yǎng)素推薦攝入量；碳水化合物含量為（25.14f0.37）g/100 g，NRV為10%，即每份50 g冷凍酸奶冰淇淋提供的碳水化合物的量約合推薦攝入量的5%。對(duì)產(chǎn)品中4種不同活性乳酸菌（副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌）的總活菌數(shù)在貨架期內(nèi)進(jìn)行了兩次檢測(cè)，第1個(gè)月檢測(cè)乳酸菌數(shù)量為3.0h10CFU/g，18個(gè)月后活性乳酸菌數(shù)量為2.0h10CFU/g，達(dá)到GB 19302ü2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》中≥1h10CFU/g的標(biāo)準(zhǔn)20 倍以上。

表2 冷凍酸奶冰淇淋的營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)結(jié)果（n＝5）Table 2 Results of determination of nutritional components in frozen yogurt (n = 5)

2.2 3種奶制品對(duì)低免疫力斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量減少的保護(hù)作用

由圖1可知，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組巨噬細(xì)胞數(shù)量高度顯著降低（＜0.001），說(shuō)明免疫功能損傷的巨噬細(xì)胞數(shù)量減少模型建立成功。與模型對(duì)照組比較，低溫酸奶、常溫純牛奶和冷凍酸奶冰淇淋對(duì)斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量減少均表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用，3種乳制品對(duì)斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量減少的保護(hù)作用分別達(dá)到47%（＜0.001）、85%（＜0.001）和32%（＜0.05）。常溫純牛奶組的巨噬細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到正常組水平（＞0.05），并顯著優(yōu)于低溫酸奶組（＜0.05）。冷凍酸奶冰淇淋組的巨噬細(xì)胞數(shù)量與低溫酸奶組比較無(wú)顯著性差異（＞0.05）。

圖1 不同乳制品對(duì)低免疫力斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量減少的改善作用Fig.1 Ameliorative effects of different dairy products on macrophage reduction in zebrafish

2.3 3種奶制品對(duì)低免疫力斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能的保護(hù)作用

由圖2可知，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組斑馬魚體內(nèi)殘留熒光顆粒的數(shù)量高度顯著降低（＜0.001），表明免疫功能損傷的巨噬細(xì)胞吞噬功能減弱模型建立。與模型對(duì)照組比較，常溫純牛奶和冷凍酸奶冰淇淋對(duì)低免疫力斑馬魚的巨噬細(xì)胞吞噬功能有顯著改善，這兩種乳制品對(duì)低免疫力斑馬魚的巨噬細(xì)胞吞噬功能的改善作用分別為66%（＜0.05）和70%（＜0.05）。低溫酸奶對(duì)斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬作用有改善趨勢(shì)，但與低免疫力模型對(duì)照組比較未見(jiàn)顯著差異（＞0.05）。

圖2 不同乳制品對(duì)低免疫力斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能的改善作用Fig.2 Promoting effect of different dairy products on macrophage phagocytosis in zebrafish

2.4 3種奶制品對(duì)低免疫力斑馬魚T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的保護(hù)作用

由圖3可知，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組T細(xì)胞數(shù)量高度顯著降低（＜0.001），表明免疫功能損傷的T細(xì)胞數(shù)量減少模型成功建立。與模型對(duì)照組比較，低溫酸奶、常溫純牛奶和冷凍酸奶冰淇淋對(duì)低免疫力斑馬魚的T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少均顯示出顯著保護(hù)作用，并恢復(fù)到與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異水平（＞0.05），這3種乳制品對(duì)低免疫力斑馬魚的T細(xì)胞數(shù)量減少的改善作用分別為89%（＜0.01）、127%（＜0.01）和140%（＜0.001）。

圖3 不同乳制品對(duì)低免疫力斑馬魚T細(xì)胞數(shù)量減少的改善作用Fig.3 Ameliorative effects of different dairy products on T cell reduction in zebrafish

3 討 論

長(zhǎng)春瑞濱是一種半合成的長(zhǎng)春花生物堿，具有廣譜抗腫瘤活性，且毒性低，能夠通過(guò)干擾細(xì)胞有絲分裂期微管的聚集而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。研究表明，大劑量長(zhǎng)春瑞濱骨髓抑制明顯，導(dǎo)致血小板、紅細(xì)胞和白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等）數(shù)目減少，最終誘導(dǎo)免疫力低下。巨噬細(xì)胞為人體天然免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，具有強(qiáng)大的識(shí)別、吞噬、清除病原體及細(xì)胞組織殘?bào)w的功能。作為免疫應(yīng)答的第一道防線，可通過(guò)識(shí)別清除病原體、殺傷靶細(xì)胞、抗原提呈、免疫調(diào)節(jié)等功能維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。T細(xì)胞可特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合并直接殺死靶細(xì)胞，輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，也可通過(guò)釋放細(xì)胞因子強(qiáng)化免疫效應(yīng)。斑馬魚的免疫系統(tǒng)與人類具有高度相似性，在受精后的18 h左右，前體巨噬細(xì)胞在中胚層被最早發(fā)現(xiàn)，并遷移至卵黃囊，受精后24 h在造血區(qū)前段分化成巨噬細(xì)胞，然后通過(guò)血液循環(huán)散布在全身。斑馬魚的前體T細(xì)胞最早在腎臟骨髓里被發(fā)現(xiàn)，不斷遷移至胸腺并在此分化，成熟后分布于各大組織。本研究中，靜脈注射長(zhǎng)春瑞濱處理導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因巨噬細(xì)胞熒光斑馬魚的巨噬細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱，巨噬細(xì)胞吞噬紅色熒光微球異物的速率降低，以及轉(zhuǎn)基因T淋巴細(xì)胞熒光斑馬魚的T淋巴細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱，從而直接指征斑馬魚免疫功能受損。而給予常溫純牛奶、低溫酸奶和冷凍酸奶冰淇淋后，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞數(shù)目的增加以及巨噬細(xì)胞吞噬能力的增強(qiáng)，表明其增強(qiáng)了低免疫力斑馬魚的免疫功能。

低溫酸奶中含有豐富的活性乳酸菌，研究表明，乳酸菌對(duì)全身免疫系統(tǒng)的調(diào)控大多通過(guò)參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫中的體液免疫和細(xì)胞免疫進(jìn)行的，也有部分通過(guò)參與調(diào)控天然免疫中的固有免疫屏障、固有免疫分子和固有免疫細(xì)胞來(lái)進(jìn)行的。在細(xì)胞免疫中，乳酸菌可以提高巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的活性，同時(shí)在不同的免疫微環(huán)境下可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化為不同的表型，在調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞方面，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠促進(jìn)輔助性T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2，并且在均衡新生兒輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）1和Th2方面起到重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低溫酸奶具有增強(qiáng)免疫力的功效，顯著提高低免疫力斑馬魚的巨噬細(xì)胞（＜0.001）和T淋巴細(xì)胞數(shù)量（＜0.01）。與該保健食品酸奶可增強(qiáng)免疫力功能的宣稱一致，同時(shí)顯示本研究中的實(shí)驗(yàn)方法具有一定的穩(wěn)定性和可靠性，也給其他乳制品的免疫功能評(píng)估提供參考。

本研究中的常溫牛奶樣品含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和鈣，可能與其免疫功能有一定的必然聯(lián)系。牛乳中含有免疫球蛋白、乳鐵蛋白等優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，免疫球蛋白（IgG、IgA和IgM等）作為一種維持機(jī)體免疫力的重要蛋白，可與過(guò)敏原、病原微生物以及細(xì)菌結(jié)合，中和毒素，使其喪失感染侵襲宿主細(xì)胞的能力，并介導(dǎo)補(bǔ)體活化、免疫調(diào)節(jié)等免疫反應(yīng)，在增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、防止細(xì)菌和病毒入侵、活化補(bǔ)體等方面發(fā)揮重要作用；乳鐵蛋白可以抑制并殺傷病原微生物，還可與病原體的表面蛋白結(jié)合，發(fā)揮抗病毒作用，阻止病毒入侵。此外，牛乳中還含有大量酶和生物活性肽，大都具有抗菌以及抗病毒的活性，在體內(nèi)起到免疫調(diào)節(jié)的作用。牛奶中通常含有3%～5%的脂質(zhì)，其中包括甘油酯、類脂和游離脂肪酸等，約有98%以上的脂肪酸是以結(jié)合態(tài)甘油酯或類脂形態(tài)存在，較少部分則是以游離脂肪酸的形式存在，牛奶中的脂質(zhì)成分被乳脂球膜包裹，以乳脂球的形式穩(wěn)定分散。并且，牛奶中富含多不飽和脂肪酸，如共軛亞油酸、-3多不飽和脂肪酸在心血管疾病和癌癥的預(yù)防中發(fā)揮重要作用，中短鏈脂肪酸對(duì)腸道健康有益，支鏈脂肪酸又具有抗炎作用。牛奶中的另一個(gè)主要營(yíng)養(yǎng)成分是碳水化合物，其中除了代表性的乳糖，還有一些活性多糖和低聚糖的存在，有研究發(fā)現(xiàn)牛乳中含有和人乳中類似的可參與免疫反應(yīng)的低聚糖，參與機(jī)體免疫系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)支持和活化。鈣與人體的免疫力存在密不可分的關(guān)系，機(jī)體低鈣情況下，可能通過(guò)降低弗林蛋白酶（Furin）mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致特定人群的血清補(bǔ)體C3水平降低，從而使免疫力降低，增加上呼吸道感染的危險(xiǎn)。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是46 kDa大小的Ca結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常駐蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度、增強(qiáng)抗原遞呈、清除凋亡細(xì)胞、影響小鼠的Th1/Th2平衡、參與腫瘤免疫應(yīng)答、佐劑效應(yīng)等方式，實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能。牛奶中含有乳礦物鹽形式的乳鈣，可以為機(jī)體免疫系統(tǒng)提供鈣源，從而維持并增強(qiáng)正常免疫功能。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示常溫純牛奶含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和鈣等營(yíng)養(yǎng)素，并具有增強(qiáng)免疫力的功能，表現(xiàn)為能顯著增加低免疫力斑馬魚的巨噬細(xì)胞數(shù)量和T細(xì)胞數(shù)量，能顯著改善巨噬細(xì)胞的吞噬功能，并能夠使巨噬細(xì)胞數(shù)量和T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)到正常水平，且常溫純牛奶對(duì)低免疫力斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加效果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)中作為參照的“增強(qiáng)免疫力”功能保健食品低溫酸奶樣品。

冷凍酸奶冰淇淋是以酸奶為主要原料之一的乳制品，除了具有牛奶豐富的營(yíng)養(yǎng)成分以外，還包含副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌4種優(yōu)勢(shì)菌種，并且其冷凍貯藏條件較普通冷藏條件更有利于保持酸奶的性狀、營(yíng)養(yǎng)成分和菌種活性。副干酪乳桿菌具有抑菌和增強(qiáng)免疫力的功效，可顯著提高腹瀉小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，通過(guò)提高轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平，同時(shí)降低IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-17和IL-23等炎癥因子水平，以及調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)維持人體消化系統(tǒng)的免疫穩(wěn)態(tài)。保加利亞乳桿菌具有免疫激活和免疫調(diào)節(jié)的作用，主要通過(guò)提高免疫細(xì)胞的活性起到提高免疫力的功效，并能提升單核細(xì)胞活性和吞噬作用，誘導(dǎo)其產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。研究還發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌的胞外多糖具有通過(guò)調(diào)節(jié)免疫力發(fā)揮對(duì)人體腫瘤細(xì)胞的顯著抑制作用。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)（delayed type hypersensitivity，DTH）、免疫臟器指數(shù)、血清溶血素等細(xì)胞免疫和體液免疫特征指標(biāo)均有提升作用，發(fā)揮協(xié)同增效作用。嗜熱鏈球菌可有效提高血清中IgG、IgM的含量，改善脾淋巴細(xì)胞增殖，提升巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高自然殺傷細(xì)胞殺傷活性。嗜酸乳桿菌可以在腸道定殖，激活巨噬細(xì)胞，誘發(fā)特異性免疫和非特異性免疫，提高淋巴細(xì)胞增殖活性。嗜酸乳桿菌胞外多糖可以提高小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，促進(jìn)溶血空斑形成，并且通過(guò)胞壁肽聚糖影響腸道上皮細(xì)胞病理形態(tài)，促進(jìn)小腸黏膜分泌分泌性免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA），降低干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）及TNF-α的表達(dá)，增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性，促進(jìn)小腸黏膜的發(fā)揮免疫調(diào)控作用。本研究中，含有上述4種菌株的冷凍酸奶冰淇淋能顯著提高低免疫力斑馬魚的巨噬細(xì)胞數(shù)量和T細(xì)胞數(shù)量，并具有改善巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用，與各菌株的相關(guān)研究結(jié)果一致。

活性益生菌對(duì)腸道微生態(tài)的平衡和改善，以及對(duì)機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)作用已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，甚至對(duì)于過(guò)敏性鼻炎、自身免疫性疾病和低免疫力機(jī)體的保護(hù)作用也多見(jiàn)報(bào)道。冰淇淋作為一種常見(jiàn)休閑食品不僅具有獨(dú)特的口感和性狀，更重要的是其冷凍低溫的加工和貯藏方式保障了乳制品中益生菌的活性及胃腸利用率，在未來(lái)益生菌類功能食品的應(yīng)用開發(fā)中值得關(guān)注。以上結(jié)果顯示，3 款乳制品均能增強(qiáng)免疫功能，為乳制品的免疫功能方向研究和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但進(jìn)一步的作用機(jī)制和應(yīng)用特性仍需深入研究。