海藻酸鈉腸溶包被氧化鋅微球的制備

曹清貽，李寶霞，肖美添，陳嘉偉

（華僑大學(xué)化工學(xué)院化學(xué)工程與制藥工程專業(yè)，福建 廈門 361021）

鋅是動物必需的微量元素之一，參與300多種酶的合成，與動物腸道發(fā)育和免疫功能密切相關(guān)。目前的研究認(rèn)為氧化鋅是鋅可以抵抗腸道疾病的唯一無機(jī)形式[1]。許多研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，在斷奶仔豬日糧中添加一定劑量的氧化鋅可以降低腹瀉的發(fā)生率，提高仔豬的生長性能[2-3]。但仔豬日糧中的氧化鋅很容易被胃里的酸性胃液分解，大部分氧化鋅轉(zhuǎn)化為Zn2+，隨糞便排到環(huán)境中，只有10%～25%的氧化鋅能到達(dá)腸道，被仔豬吸收[4]。所以仔豬日糧中必須添加高劑量的氧化鋅（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2～3 g/kg）才能有效抑制仔豬腹瀉[2-3]。鋅在土壤中的過量積累會導(dǎo)致土壤質(zhì)量惡化，對植物產(chǎn)生毒性，并可能危害動物和人類健康[5-7]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部的《飼料添加劑安全使用規(guī)范》（農(nóng)業(yè)部公告第2625號），仔豬斷奶后前2周允許添加的氧化鋅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高不超過1.6 g/kg，相比2009年頒布的添加標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.25 g/kg顯著降低[8]。因此，研制符合規(guī)范要求的氧化鋅添加劑迫在眉睫。

對氧化鋅進(jìn)行包被處理，包衣層能夠保護(hù)氧化鋅不被胃液降解，而在腸道釋放并被仔豬吸收，可以有效提高氧化鋅的利用率，顯著降低飼料中氧化鋅的添加量[9-12]。

海藻酸鈉（SA）是褐藻中發(fā)現(xiàn)的一種天然無毒多糖[13]。它具有成本低、生物相容性好和可降解等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥物載體，它具有pH 敏感性，在高pH時(shí)易溶解[14-45]。殼聚糖（CTS）是一種廣泛應(yīng)用于胃腸道給藥載體的生物聚合物[16]。它具有良好的生物相容性和生物降解性，且易于改性，常用于輸送藥物和生物活性化合物[15]。SA 與CTS可在溫和條件下瞬間膠凝，形成聚合膜膠囊[17]；還可與2 價(jià)陽離子如Ca2+、Ba2+等（除Mg2+）交聯(lián)反應(yīng)形成“蛋格”結(jié)構(gòu)而瞬時(shí)凝膠化，從而形成凝膠微球[18]。SA屬于腸溶性囊材，所以CTS-SA微膠囊具有一定的耐酸性和腸溶性[23]。SA 微球已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和制藥工業(yè)[13]。

徐文俊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTS-SA微囊能夠顯著降低微囊在胃液中的釋放度，在模擬胃液中處理2 h，微囊的釋放率不超過22%，而在模擬腸液中，4 h后微囊的累計(jì)釋放率達(dá)到87%，6 h后可完全釋放[19]。還有許多實(shí)驗(yàn)證明，CTS-SA 包被微球可以減少藥物在模擬胃液中的釋放，但可以加速藥物在模擬腸液中的釋放[20-22]。

本研究采用SA、CTS、氯化鈣作為包被材料制取腸溶包被氧化鋅微球，以期獲得以SA和CTS作為載體制取包被氧化鋅的優(yōu)化配方及工藝條件，為降低仔豬飼料中氧化鋅添加量提供有效方法和替代產(chǎn)品。CTS-SA包被氧化鋅腸溶微球

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氧化鋅，無水氯化鈣，CTS，乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA），磷酸二氫鉀，氫氧化納，分析純；SA，化學(xué)純。

電子天平，HZK-FA210S；pH 計(jì)，ST2100；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S；智能崩解儀，ZB-1E。

1.2 微球制備方法

采用銳孔凝固浴法制備CTS-SA包被氧化鋅腸溶微球[23]。將SA（1～5 g）融入100 g 熱水中，用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min，使SA 完全溶解。將氧化鋅（10～30 g）加入到已溶解的SA 溶液中，恒溫均勻攪拌15 min，然后用注射器將混合物滴入到氯化鈣溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～5%）中，使其攪拌交聯(lián)2 h后固化，再進(jìn)行抽濾之后分離微球。之后將微球轉(zhuǎn)移到CTS 溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%～0.5%）中，繼續(xù)攪拌交聯(lián)2 h后抽濾，分離微球并用蒸餾水洗滌，干燥至恒量，得到包被微球。

實(shí)驗(yàn)過程中以SA、氯化鈣、CTS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、3%、0.25%，氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%作為基本的實(shí)驗(yàn)條件，改變單一條件制備一系列微球。

1.3 氧化鋅含量分析

采用GB/T4372.1－2014 中的Na2EDTA 滴定法來測定微球中氧化鋅含量[24]。

1.4 微球的體外釋放

氧化鋅的體外釋放參照《中國藥典（2010版）》附錄XD釋放度測定法中腸溶制劑項(xiàng)下方法一的要求，對微球進(jìn)行體外釋放研究[25]。將1 g 微球放入模擬胃液中，溶出介質(zhì)溫度定在(37±0.5)℃，每隔一定的時(shí)間取樣5 mL，用微孔濾膜過濾，并補(bǔ)入等量模擬胃液原液。2 h 后將上述微球放入模擬腸液中，每隔一定的時(shí)間取樣3 mL，用微孔濾膜過濾，并補(bǔ)入等量模擬腸液，繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)2 h。

模擬胃液。在清水中，滴加鹽酸，至溶液pH為1.5，得到溶液500 mL。

模擬腸液。稱量6.8 g KH2PO4于500 mL 的清水中，用NaOH溶液將溶液調(diào)成pH為6.8。

1.5 微球的質(zhì)量評價(jià)

采用光學(xué)顯微鏡對微球形態(tài)的觀察。

測定粒徑大小采用顯微計(jì)數(shù)法，在光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)測定3個(gè)微球的大小，得到微球的平均粒徑。

根據(jù)《藥典》附錄中“微囊、微球與脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則”部分關(guān)于2個(gè)概念的定義可知[24]：

包封率=系統(tǒng)中包封的藥物質(zhì)量/系統(tǒng)中包封與未包封的總質(zhì)量；

載藥量=微球中所含藥物質(zhì)量/微球的總質(zhì)量；

收率=微球的總質(zhì)量/總投加質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 SA含量的影響

固定氯化鈣、CTS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、0.25%，氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，制備SA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%的微球。所得微球形貌見圖1。

圖1 SA含量對微球形貌的影響Fig1Effectof SAconcentrations onmorphologyof microspheres

由圖1可知，當(dāng)SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，微球成橢圓狀，可能是因?yàn)榈秃康腟A 的黏度比較小，而導(dǎo)致微球的變形。而當(dāng)SA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，微球不成球狀接近水滴狀，可能是SA含量過高時(shí)其黏度比較大，物料乳化不均勻。所以不再進(jìn)行SA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)的其它因素（載藥量、包封率、體外釋放量等）的實(shí)驗(yàn)。

SA 含量對微球的體外釋放程度的影響如圖2所示。

圖2 SA含量對微球的體外釋放程度的影響Fig 2 Effect of SA content on in vitro release of microspheres

微球在模擬胃液中2 h 內(nèi)不崩解。由圖2 可知，在進(jìn)入模擬腸液2 min內(nèi)就開始溶解。當(dāng)微球中SA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，微球溶解率增加緩慢，50 min后趨于平衡，微球溶解完畢，總體溶解率很低；當(dāng)微球中SA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，微球溶解率在20～30 min 時(shí)增加迅速，50 min 趨于平衡，微球完全溶解完畢。因此SA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)的微球在模擬腸液中的釋放度較好。

SA含量對微球的特性的影響見表1。

表1 SA含量對微球的特性的影響Tab 1 Effect of SA content on properties of microspheres

由表1 可知，當(dāng)SA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%增至5%時(shí)，微球的粒徑分布逐步變寬。，SA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%時(shí)，SA 微球在模擬胃液中均不溶。SA 的含量對微球在腸液中完全釋放的時(shí)間幾乎沒有影響。所以當(dāng)SA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3%左右時(shí)制得的微球較為理想。

2.2 氯化鈣含量的影響

固定SA、CTS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、0.25%，氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，制備氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%和5%的微球。氯化鈣含量對微球的體外釋放程度的影響見圖3。

微球在模擬胃液中2 h內(nèi)不崩解。由圖3可知，進(jìn)入模擬腸液2 min 內(nèi)就開始溶解，且在20～30 min直接溶解率增速最大。當(dāng)氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，微球溶解率在40 min 之后趨于平衡，50 min后微球溶解完畢，在40 min 之后曲線下滑的原因可能是隨著時(shí)間的延長氧化鋅逐漸沉淀從而導(dǎo)致溶液含量降低；當(dāng)氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%或5%時(shí)，微球溶解率均在40 min后趨于平衡，且微球分別在60 min 和70 min 后完全溶解完畢。因此氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)的微球在模擬腸液中的完全釋放釋放時(shí)間較5%的短，且兩者載藥量相差不大。

圖3 氯化鈣含量對微球體外釋放的影響Fig 3 Effect of CaCl2 concentrations on in vitro release of microspheres

氯化鈣含量對微球的特性的影響見表2。

表2 氯化鈣含量對微球的特性的影響Tab 2 Effect of CaCl2 content on properties of microspheres

由表2 可知，當(dāng)氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%增至3%時(shí)，微球包封率明顯增加，這可能是氯化鈣的含量適當(dāng)?shù)纳仙龑宦?lián)反應(yīng)的發(fā)生有正向作用；但隨著氯化鈣含量的持續(xù)上升，包封率沒有明顯增加。氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%時(shí)，微球在模擬胃液中均不溶。氯化鈣含量對微球在模擬腸液中的釋放時(shí)間影響不大，但當(dāng)氯化鈣含量相對較高時(shí)，其對微球性質(zhì)有一定影響，所以之后的實(shí)驗(yàn)可以選擇氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%、4%和4.5%做進(jìn)一步考察。

2.3 CTS含量的影響

固定SA、氯化鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為3%，氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，制備CTS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.25%和0.5%的微球。CTS 含量對微球的體外釋放程度的影響見圖4。

圖4 CTS含量對微球的體外釋放程度的影響Fig 4 Effect of CTS content on in vitro release of microspheres

微球在模擬胃液中2 h內(nèi)不崩解。由圖4可知，進(jìn)入模擬腸液2 min 內(nèi)就開始溶解，在20～30 min之間溶解率增速最快。當(dāng)CTS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 時(shí)，微球溶解率在40 min 之后趨于平衡，溶解完畢。在50 min 之后曲線下滑的原因可能是隨著時(shí)間的延長，氧化鋅逐漸沉淀從而導(dǎo)致溶液中含量降低，且氧化鋅釋放量較低，包封率較低；當(dāng)CTS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%時(shí)，微球溶解率在60 min后趨于平衡，微球溶解完畢；當(dāng)CTS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，微溶解率在80 min 后趨于平衡，溶解完畢。因此CTS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%時(shí)的微球在模擬腸液中的釋放量較好。

CTS含量對微球特性的影響見表3。

表3 CTS含量對微球的特性的影響Tab 3 Effect of CTS content on properties of microspheres

由表3可知，若原料配方含CTS，則微球的包封率明顯高于不含CTS 的。當(dāng)微球的CTS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.25%升至0.5%時(shí)，包封率下降，這可能是CTS含量過高，導(dǎo)致CTS與SA發(fā)生聚集，因此包封率下降。CTS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.25%、0.5%時(shí)，微球在模擬胃液中均不溶。隨著CTS含量的增加，微球在模擬腸液中完全釋放所需要的時(shí)間明顯增加。因此，當(dāng)CTS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.25%左右時(shí)，可以制得比較理想的微球。之后做進(jìn)一步考察實(shí)驗(yàn)時(shí)可以選擇CTS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%和0.3%。

2.4 氧化鋅投加量的影響

固定SA、氯化鈣、CTS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、3%、0.25%。氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%和30%微球。氧化鋅投加量對微球的體外釋放程度的影響如圖5所示。

圖5 氧化鋅含量對微球的體外釋放的影響Fig 5 Effect of ZnO content on in vitro release of microspheres

微球在模擬胃液中2 h 內(nèi)不崩解。由圖5 可知，進(jìn)入模擬腸液2 min 內(nèi)開始溶解，溶解率在20～30 min之間增加迅速。當(dāng)氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)，微球在60 min之后溶解完畢，在60 min之后曲線略有下滑的原因可能是隨著時(shí)間的延長，氧化鋅逐漸沉淀從而導(dǎo)致溶液中含量降低；當(dāng)投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，微球溶解率在30～60 min仍然繼續(xù)增加，60min 后趨于平衡，微球溶解完畢；當(dāng)投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，微球溶解率在30 min 之后增加緩慢，70 min 后趨于平衡，溶解完畢。因此，氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)的微球在模擬腸液中的釋放量最好。

氧化鋅投加量對微球特性的影響見表4。

由表4可知，隨著氧化鋅投加量的上升，微球粒徑顯著增大，包封率下降，在模擬腸液中完全釋放的時(shí)間變長。由實(shí)驗(yàn)可知，氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%時(shí)，在模擬胃液中均不溶。之后的實(shí)驗(yàn)可以選擇選擇氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15%和25%做進(jìn)一步考察。

3 結(jié) 論

以氧化鋅為主要藥物，SA 為載藥載體，制備SA 腸溶包被氧化鋅微球。通過單因素考察得到的優(yōu)化配方為：SA、氯化鈣、CTS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、3%、0.25%，氧化鋅投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。在些條件下所制得的微球微球形態(tài)圓整、粒徑分布均勻、包封率相對較高，且體外釋放溶出的實(shí)驗(yàn)證明微球在模擬胃酸中釋放量小于5%，可以有效避免氧化鋅在模擬胃液中被分解；在pH 為6.8 的模擬腸液中，所制得微球在0.5 h 內(nèi)的釋藥量大于80%，能達(dá)到藥物的快速釋放與產(chǎn)生作用的目的。