基于核磁共振技術(shù)對亞麻籽油進(jìn)行脂肪酸組成檢測與品質(zhì)鑒別

李 剛，康 樂，何建昇，張 松

(山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，太原 030012)

亞麻籽油是從亞麻籽中提取的食用油，其富含α-亞麻酸[1]，具有很高的營養(yǎng)價值[2]。亞麻籽生性喜寒耐寒，適合生長在我國西部、北部高寒干旱地區(qū)。亞麻籽是山西省北部地區(qū)特產(chǎn)[3]，山西省興縣峁底村亞麻籽油壓榨技藝和神池梁榨亞麻籽油技藝被評為山西省省級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。植物油中脂肪酸檢測常用的方法氣相色譜(GC)法[4-6]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[7-9]前處理煩瑣，檢測成本較高，實驗過程復(fù)雜，耗時較長，而基于核磁共振技術(shù)檢測植物油脂肪酸，樣品無需預(yù)處理，可以實現(xiàn)快速檢測[10-17]。

山西省市場上正規(guī)廠家生產(chǎn)的亞麻籽油，壓榨原料為純亞麻籽，而某些小油坊在原料中可能會摻入壓榨工藝類似的黃芥、油菜籽等油料，降低了亞麻籽油的品質(zhì)。為此，本文首先采用GC-MS分析了純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油的脂肪酸組成，確認(rèn)摻雜亞麻籽油除含有亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸外，還含有單不飽和脂肪酸花生一烯酸和芥酸。再運用核磁共振譜儀確認(rèn)花生一烯酸和芥酸1H NMR和13C NMR特征峰，從而可快速判別亞麻籽油是否摻雜，為亞麻籽油品質(zhì)鑒別提供參考。最后采用1H NMR法計算亞麻籽油中脂肪酸含量，并與國標(biāo)GC法進(jìn)行了對比。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

亞麻籽油：從山西北部亞麻籽油生產(chǎn)廠家采集了3種不同品牌的亞麻籽油，編號分別為L1、L2、L3；從小油坊中采集了3種亞麻籽油，編號分別為M1、M2、M3。

花生一烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號為2390-09-2，100 mg)，美國NU-CHEK公司；芥酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號為1120-34-9，100 mg)，美國Accustandard公司；異辛烷(分析純)，天津市申泰化學(xué)試劑公司；甲醇(色譜純)，美國奧泰科技有限公司；無水硫酸鈉，天津市天大化工實驗廠；氫氧化鉀(分析純)、硫酸氫鈉(優(yōu)級純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氘代氯仿(CDCl3，氘代率99.8%，批號174611)，百靈威科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Bruker 600 MHz AVANCEⅢ NMR Spectrometer、Bruker 400 MHz AVANCEⅢ NMR with Autosampler 、5 mm核磁管，德國布魯克公司；Thermo TSQ 8000 Evo GC-MS；ZKAT-20M色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；Agilent 7890B GC； Agilent DB-wax色譜柱(30 m×320 μm×0.5 μm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 GC-MS分析

樣品前處理：稱取60.00 mg油樣于具塞試管中，加入4 mL異辛烷溶解，必要時可以微熱使樣品溶解，再加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鉀甲醇溶液，蓋上玻璃塞猛烈振搖30 s后靜置澄清。向試管中加入約1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖，待鹽沉淀后，將上層溶液移至上機(jī)瓶中待測。

GC-MS條件：升溫程序為初始柱溫60℃，以4℃/min升至250℃，保持15 min；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1；離子源(EI)溫度250℃；質(zhì)量掃描范圍33～500 u；溶劑延遲時間4 min。

1.2.21H NMR分析

樣品前處理：取5 μL樣品于離心管中，加入600 μL含四甲基硅烷(TMS)的CDCl3(氘代率99.8%)，用渦旋混勻儀充分混勻，轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管待測。

儀器測試條件：溫度300 K；頻率600.13 MHz；氫譜寬度12 335.5 Hz；掃描12次；延遲時間d1 20 s；譜圖處理時以TMS定位，數(shù)據(jù)采用Mestrenova軟件處理。

1.2.313C NMR分析

樣品前處理：處理方法同1.2.2，標(biāo)準(zhǔn)品取樣30 μL，亞麻籽油取樣80 μL。

儀器測試條件：溫度295.8 K；頻率400 MHz；氫譜寬度102 700 Hz；掃描32次；延遲時間d1 2 s；譜圖處理時以TMS定位，數(shù)據(jù)采用Mestrenova軟件處理。

1.2.4 GC分析

GC分析參考文獻(xiàn)[4]。樣品前處理：處理方法同1.2.1。

GC條件：升溫程序為柱溫60℃，以4℃/min升至250℃，保持15 min；進(jìn)樣口溫度220℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1；進(jìn)樣量1 μL。采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果分析

2.1 純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油脂肪酸組成的確認(rèn)

運用GC-MS分別對6個樣品進(jìn)行測試，得到純亞麻籽油(L1、L2、L3)和摻雜亞麻籽油(M1、M2、M3)的總離子色譜圖(由于純亞麻籽油譜圖各峰都一致，只是強(qiáng)度不同，定性分析時任選一譜圖即可；摻雜亞麻籽油譜圖選擇同理。下同)，如圖1所示。

由圖1可見，正規(guī)廠家生產(chǎn)的純亞麻籽油中主要含有棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸( C18∶1)、亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3)，而小油坊生產(chǎn)的亞麻籽油中除上述脂肪酸外，還含有花生一烯酸(C20∶1)和芥酸(C22∶1)。通過實際調(diào)研和查閱文獻(xiàn)[18]可知，摻雜亞麻籽油中花生一烯酸和芥酸主要是由當(dāng)?shù)禺a(chǎn)的黃芥、油菜籽等油料混入產(chǎn)生的。

圖1 純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油的GC-MS總離子色譜圖

2.2 亞麻籽油1H NMR圖譜及特征峰歸屬

純亞麻籽油1H NMR譜圖如圖2所示。為方便確認(rèn)摻雜亞麻籽油特征峰及對亞麻籽油中脂肪酸進(jìn)行定量分析，根據(jù)食用油核磁共振特性及相關(guān)資料[19]，對純亞麻籽油1H NMR特征峰進(jìn)行歸屬，結(jié)果見表1。

圖2 純亞麻籽油1H NMR譜圖

表1 純亞麻籽油1H NMR特征峰歸屬

2.3 摻雜亞麻籽油中花生一烯酸和芥酸1H NMR特征峰的確認(rèn)

花生一烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和芥酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR譜圖如圖3所示，譜圖中特征峰的歸屬如表2所示。由表2 可見，花生一烯酸甲酯和芥酸甲酯的1H NMR譜圖中特征峰為烯丙基質(zhì)子氫，化學(xué)位移(δ)在1.99～2.03之間。

圖3 花生一烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和芥酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 1H NMR譜圖

表2 花生一烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和芥酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品1H NMR特征峰的歸屬

測定了純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油1H NMR譜圖，并重點比較了二者在化學(xué)位移為1.98～2.04區(qū)間的1H NMR特征峰，結(jié)果如圖4所示。

圖4 純亞麻籽油與摻雜亞麻籽油在化學(xué)位移為1.98～2.04的1H NMR譜圖

由圖4可見， b峰與f峰、c峰與g峰 、d峰與h峰重疊，且在純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油中都存在，而a峰和e峰只在摻雜亞麻籽油中出現(xiàn)，對比表2，可確認(rèn)摻雜亞麻籽油中a峰為花生一烯酸特征峰，e峰為芥酸特征峰。

2.4 摻雜亞麻籽油中芥酸和花生一烯酸13C NMR特征峰的確認(rèn)

花生一烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和芥酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品13C NMR譜圖如圖5所示，譜圖中雙鍵位置特征峰的歸屬如表3所示。

圖5 花生一烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和芥酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的13C NMR譜圖

表3 花生一烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品和芥酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的13C NMR譜圖中雙鍵位置特征峰的歸屬

由表3可見，花生一烯酸和芥酸的13C NMR特征峰的化學(xué)位移在129附近，與脂肪酸碳鏈中13C NMR雙鍵譜峰多出現(xiàn)在化學(xué)位移129.8～130.1區(qū)域[20]的研究結(jié)果一致。測定了純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油的13C NMR譜圖，并重點對比了二者在化學(xué)位移129.8～130.1區(qū)間的13C NMR特征峰，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，p、q、r、s 4個峰只在摻雜亞麻籽油中出現(xiàn)，再與表3對比，可確認(rèn)摻雜亞麻籽油中p、q峰為花生一烯酸的特征峰，r、s峰為芥酸的特征峰。

圖6 純亞麻籽油與摻亞麻籽油在化學(xué)位移為129.8～130.1區(qū)間的13C NMR譜圖

綜上，基于核磁共振技術(shù)，根據(jù)1H NMR中a峰和13C NMR中p、q峰可以判定亞麻籽油中是否含有花生一烯酸，根據(jù)1H NMR中e峰和13C NMR中r、s峰可以判定亞麻籽油中是否含有芥酸，從而可以快速鑒別亞麻籽油中是否摻雜。

2.5 亞麻籽油中脂肪酸的定量分析

對亞麻籽油1H NMR特征峰準(zhǔn)確歸屬后，參考文獻(xiàn)[19]按式(1)～式(4)定量計算亞麻籽油中亞麻酸、亞油酸、單不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸的含量。

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：Y3為亞麻酸含量；Y2為亞油酸含量；A、B、E、G分別對應(yīng)表1中相應(yīng)譜峰的積分值；Y1為油酸、花生一烯酸等單不飽和脂肪酸的含量；Y0為棕櫚酸和硬脂酸等飽和脂肪酸的含量。為提高1H NMR法定量計算各脂肪酸的準(zhǔn)確性，通過取少量樣品，實驗中增大延遲時間d1實現(xiàn)。

表4和表5分別為采用GC法(按1.2.4方法)和1H NMR法測定的純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油的各脂肪酸含量。

表4 GC法純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油脂肪酸含量 %

由表4、表5可以看出：純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油中1H NMR法計算的亞麻酸含量與GC法一致，相對誤差均小于1%，結(jié)果準(zhǔn)確可靠；其他脂肪酸含量與GC法相比有一定誤差，僅可作為參考。純亞麻籽油中亞麻酸含量在50%以上，而摻雜亞麻籽油中亞麻酸含量顯著降低。以亞麻酸含量評價亞麻籽油的品質(zhì)，亞麻酸含量越高亞麻籽油品質(zhì)越好?；?H NMR技術(shù)計算亞麻籽油中亞麻酸含量可以鑒別亞麻籽油品質(zhì)。

表5 1H NMR法純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油脂肪酸含量 %

3 結(jié) 論

本實驗基于核磁共振技術(shù)對亞麻籽油脂肪酸組成進(jìn)行了檢測和品質(zhì)鑒別。運用GC-MS法分析了摻雜亞麻籽油比純亞麻籽油中多含有芥酸和花生一烯酸，再運用核磁共振譜儀確認(rèn)摻雜亞麻籽油中花生一烯酸、芥酸的1H NMR和13C NMR特征峰，作為純亞麻籽油和摻雜亞麻籽油快速判別的方法。采用1H NMR法定量計算亞麻籽油中脂肪酸含量，并運用GC法對比其準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，1H NMR法計算的亞麻酸含量準(zhǔn)確可靠，以此可定量分析亞麻籽油的亞麻酸含量，并鑒別其品質(zhì)。基于NMR技術(shù)對亞麻籽油脂肪酸組成進(jìn)行檢測，可快速鑒別亞麻籽油品質(zhì)。