代謝組學(xué)在奶牛上的應(yīng)用研究進(jìn)展

李廳廳，程雋如，曾令湖，于農(nóng)淇，鄢勝飛，梁莎莎，朱遠(yuǎn)致，黃健，譚正準(zhǔn)，李輝，盧瑛，覃廣勝

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（廣西）水牛遺傳與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；2.廣西大學(xué)，南寧 530001）

1 代謝組學(xué)概述

代謝組學(xué)是指通過利用多種分析方法對(duì)特定生物樣品（如血液、唾液、尿液、細(xì)胞或組織提取液等）中的小分子代謝物進(jìn)行定性、定量分析。能夠動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)由內(nèi)外因素引起的機(jī)體中代謝物的變化，全面系統(tǒng)地研究生物體代謝特征。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門新興學(xué)科，被譽(yù)為組學(xué)三部曲的頂點(diǎn)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[1]。人類基因組由超過25萬(wàn)個(gè)基因組成，而這些基因編碼了約20萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)錄物和超過一百萬(wàn)種蛋白質(zhì)，相比之下，代謝組僅由約3 000種代謝物組成。這意味著與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析相比，代謝組學(xué)分析可以更加快速高效地進(jìn)行[2]。此外，作為細(xì)胞新陳代謝的最終產(chǎn)物，代謝物可能比基因或蛋白質(zhì)的研究更具信息性。因?yàn)闄C(jī)體代謝水平反映的是蛋白質(zhì)發(fā)揮作用之后的下游事件，基因的激活、mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)合成不一定對(duì)應(yīng)改變的細(xì)胞功能狀態(tài)，而代謝水平揭示了生物系統(tǒng)及其細(xì)胞的實(shí)際功能狀態(tài)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴我們可能發(fā)生什么，而代謝組學(xué)則告訴我們已經(jīng)發(fā)生了什么[3]。

代謝組學(xué)分為非靶向代謝組學(xué)與靶向代謝組學(xué)兩個(gè)板塊。非靶向代謝組學(xué)是指無(wú)偏向性的對(duì)生物樣品中所有小分子代謝物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，旨在檢測(cè)出盡可能多的代謝物，從而對(duì)機(jī)體代謝特征有更加全面的了解。但是它會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，需要進(jìn)行復(fù)雜的生物信息學(xué)分析。并且，還受到提取和分析方法等多重因素的影響，只能獲得半定量的結(jié)果。而靶向代謝組學(xué)是分析特定的某一類代謝物，特別針對(duì)一種或幾種途徑的代謝產(chǎn)物，通過制備目標(biāo)代謝物濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果。相比之下，靶向代謝組學(xué)比非靶向代謝組學(xué)具有更高的靈敏度和特異性，可用以驗(yàn)證和擴(kuò)展非靶向分析的結(jié)果。

代謝組學(xué)發(fā)展至今雖只有將近20年的歷史，但目前已經(jīng)成為現(xiàn)代科學(xué)的研究熱點(diǎn)，2008年首次出現(xiàn)在奶牛上的應(yīng)用報(bào)道[4]。代謝組學(xué)技術(shù)最初著眼于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，通過檢測(cè)特定生理狀態(tài)（各種疾病、藥物處理和環(huán)境暴露等）下的代謝表型變化，從而篩選出生物標(biāo)志物。最近幾年，代謝組學(xué)迅速發(fā)展，由于信息學(xué)和分析技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展以及正交生物學(xué)方法的整合，已能夠了解代謝物在系統(tǒng)水平上的作用，幫助研究人員更加全面深入地洞察各種生理?xiàng)l件或異常過程的潛在發(fā)展機(jī)制[5]。

2 代謝組學(xué)在奶牛上的應(yīng)用

2.1 代謝組學(xué)在奶牛疾病中的應(yīng)用

代謝組學(xué)技術(shù)可以全面了解奶牛疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，準(zhǔn)確檢測(cè)出參與疾病發(fā)生的代謝物和代謝通路，從而幫助進(jìn)一步針對(duì)性地研究其預(yù)防和治療方案。目前代謝組學(xué)技術(shù)在奶牛疾病中的研究主要集中在腐蹄病、營(yíng)養(yǎng)代謝疾病和繁殖障礙疾病這幾個(gè)方面。

隨著奶牛養(yǎng)殖的集約化發(fā)展，腐蹄病已經(jīng)成為危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的三大普通病之一，特別在我國(guó)南方、中部省份的高溫高濕季節(jié)多發(fā)。奶牛代謝病為高產(chǎn)奶牛多發(fā)病，當(dāng)日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給及其代謝過程的某些方面或某一環(huán)節(jié)發(fā)生問題導(dǎo)致代謝機(jī)能發(fā)生障礙而引起[6]。奶牛常見的營(yíng)養(yǎng)代謝病例如酮病、低鈣血癥、脂肪肝、產(chǎn)乳熱、犢牛血紅蛋白尿癥等[7]，營(yíng)養(yǎng)代謝病發(fā)病緩慢，呈慢性消耗，發(fā)病率較高并且早期診斷困難。所以代謝組學(xué)技術(shù)在奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝疾病的早期診斷及病因分析上占據(jù)一席之地。奶牛繁殖障礙疾病位居奶牛三大常見病之首[8]，患病率在20%～40%，是導(dǎo)致奶牛過早淘汰的主要因素。表1列舉了近年來(lái)代謝組學(xué)技術(shù)在奶牛疾病進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大量可用于定性的疾病相關(guān)生物標(biāo)志物?？梢钥闯觯么x組學(xué)技術(shù)對(duì)奶牛疾病定性出大量與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物?？梢灶A(yù)見，該項(xiàng)技術(shù)有望在奶牛的疾病診斷、治療檢測(cè)和病理研究方面施展拳腳。

表1 代謝組學(xué)在奶牛疾病方面的研究

2.2 代謝組學(xué)在奶牛營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在奶牛營(yíng)養(yǎng)上研究主要在奶牛健康以及改善乳品質(zhì)這兩個(gè)方面。奶牛圍產(chǎn)前期由于胎兒對(duì)瘤胃的機(jī)械性壓迫導(dǎo)致瘤胃容積變小，并且在生殖激素、瘦素、神經(jīng)肽等代謝信號(hào)的作用下導(dǎo)致奶牛干物質(zhì)的采食量下降，所以無(wú)法滿足胎兒發(fā)育和產(chǎn)后泌乳的能量需求[18]。由于能量輸出加劇和干物質(zhì)采食量不足，極易造成奶牛能量負(fù)平衡（negative energy balance,NEB），NEB誘發(fā)的糖脂代謝異常是圍產(chǎn)期奶牛面臨的主要問題[19]。因此，關(guān)于圍產(chǎn)期奶牛營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的研究從未停止。

圍產(chǎn)期奶牛飼糧中補(bǔ)充葉酸有利于提高奶牛產(chǎn)奶量，由于葉酸能補(bǔ)充調(diào)節(jié)免疫和乳腺炎的相關(guān)基因，因此，Khan[20]等建議將葉酸用于圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎的防治研究。Wei[21]等采用GC-TOF/MS對(duì)飼糧中添加生物素（Biotin，BIO）和煙酰胺（Nicotinamide，NAM）的圍產(chǎn)期奶牛血清代謝譜進(jìn)行研究，結(jié)果表明添加BIO和NAM均可促進(jìn)氨基酸代謝，而添加NAM能通過降低圍產(chǎn)期奶牛不飽和脂肪酸的合成而降低血液脂肪酸含量，并且對(duì)緩解圍產(chǎn)期奶牛氧化應(yīng)激有重要作用。Yang[22]等對(duì)泌乳期間飼糧中添加共軛亞油酸（Conjugate Linoleic Acids，sCLA）的奶牛肌肉和血清中的代謝組學(xué)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充CLA可導(dǎo)致肌肉和血清甘油磷脂、鞘磷脂濃度發(fā)生變化。Xu[23]等通過LC-QQQ-MS檢測(cè)NEB狀態(tài)下奶牛泌乳早期的牛奶代謝譜，利用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與能量平衡相關(guān)的前15個(gè)最相關(guān)變量，建立能量平衡正向選擇回歸的簡(jiǎn)化線性模型，結(jié)果表明乳脂產(chǎn)量、甘氨酸、膽堿和肉堿是估計(jì)能量平衡的重要變量。Sun[24]等通過GC-TOF/MS對(duì)飼喂苜蓿干草和玉米秸稈的泌乳奶牛瘤胃液、牛奶、血清和尿液的代謝組學(xué)分析表明，兩種營(yíng)養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物和代謝途徑發(fā)生了顯著變化，并且飼喂玉米秸稈奶牛的氮利用率較低。Wang[25]等通過代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究娟珊牛和荷斯坦牛高、低剩余采食量（Residual feed intake，RFI）背后的代謝機(jī)制，得到3個(gè)重要的代謝途徑并在基因-代謝物相互作用網(wǎng)絡(luò)中鑒定出一個(gè)與兩種代謝物（-α-酮戊二酸和琥珀酸）相關(guān)的基因（2-hydroxyacyl-CoA lyase 1(+HACL1)），為高RFI和低RFI荷斯坦牛和娟珊牛提供了新的代謝途徑和代謝-基因表達(dá)譜。

奶牛的健康狀況直接影響其產(chǎn)奶性能，利用代謝組學(xué)方法研究奶牛在飼糧調(diào)控下的牛奶化學(xué)成分變化是乳品質(zhì)改善的研究思路之一。Rocchetti[26]等研究奶牛食用霉菌毒素污染的玉米青貯飼料對(duì)牛奶代謝譜的影響，結(jié)果表明，抗氧化分子（谷胱甘肽）在牛奶樣品中大量積累，原因可能是奶牛飼糧中霉菌毒素引起機(jī)體的氧化應(yīng)激而造成。由于奶牛自然放牧的飼養(yǎng)方式更加符合動(dòng)物福利的要求，放牧的奶源比TMR舍飼的奶源更加受到消費(fèi)者的青睞，因此，Callaghan[27]等采用1H NMR非靶向代謝組學(xué)分析放牧（多年生黑麥草、白三葉）和TMR舍飼的奶牛瘤胃和牛奶代謝譜，結(jié)果顯示馬尿酸在放牧飼養(yǎng)奶牛的牛奶中濃度顯著升高，所以馬尿酸可以作為不同牧草來(lái)源牛奶的潛在生物標(biāo)志物。乳脂率低綜合征（Mlik fat depression，MFD）嚴(yán)重影響牛奶品質(zhì)。Zeng[28]研究在飼糧調(diào)控下奶牛瘤胃代謝組-微生物組相互作用對(duì)奶牛MFD的影響，結(jié)果表明顆粒型高淀粉TMR飼糧縮短奶牛反芻時(shí)間，改變了瘤胃發(fā)酵類型，導(dǎo)致瘤胃微生物區(qū)系和代謝產(chǎn)物組成發(fā)生變化，引起MFD。雖然高谷物的TMR飼糧有利于改善奶牛圍產(chǎn)期的NEB，但是也會(huì)引發(fā)一些副作用，所以奶牛圍產(chǎn)期的精細(xì)化飼養(yǎng)管理尤為重要。

2.3 代謝組學(xué)在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用

短期熱應(yīng)激對(duì)荷斯坦牛的血液代謝物以及生理狀態(tài)（直腸溫度、心率）和牛奶的miRNA表達(dá)有負(fù)面影響[29]。Gu[30]等采用血清代謝組學(xué)方法研究了慢性熱應(yīng)激條件下荷斯坦牛和雜交水牛的耐熱差異，生理指標(biāo)和血清代謝譜均表明，雜交水牛比荷斯坦牛的耐熱性更強(qiáng)，這為熱帶和亞熱帶地區(qū)水牛奶業(yè)的發(fā)展提供了可行性。Wang[31]等利用非靶向液相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)方法研究不同體況評(píng)分（BCS）的產(chǎn)犢奶牛血漿代謝圖譜，鑒定出7個(gè)重要的差異代謝物，包括6個(gè)不同的LysoPCs和1個(gè)PE，此外，這7種代謝物與奶牛的脂質(zhì)代謝、炎癥和過度肥胖（HBCS）密切相關(guān)。王世成[5]等建立了高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)研究牛奶代謝組學(xué)方法，研究了注射氯霉素后牛奶的內(nèi)源性代謝物的變化，結(jié)果顯示，單羥基十八碳二烯酸（HODE）可作為注射氯霉素后奶牛體內(nèi)代謝應(yīng)激產(chǎn)生的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。羅芳[32]等利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF MS）技術(shù)篩選表征奶牛產(chǎn)后異食沙土的生物標(biāo)志物，從奶牛（n=29,T=13、C=16）血漿中表征出11種生物標(biāo)志物，為研究奶牛產(chǎn)后異食沙土的預(yù)防提供了新的方法和思路。代謝組學(xué)方法還用于鑒定合成和半合成激素的非法使用，這些代謝圖譜可為牛雌二醇及其衍生物給藥或黃體酮給藥提供依據(jù)，在后續(xù)的試驗(yàn)中闡明了這種潛在的生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)為二肽[33,34]。

此外，代謝組學(xué)在乳品質(zhì)量控制及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)估方面也表現(xiàn)出良好的適用性[35]，Wu[36]等利用GC-TOF/MS和超高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）平臺(tái)鑒定出與經(jīng)產(chǎn)荷斯坦牛產(chǎn)奶量和乳蛋白相關(guān)的差異代謝物，其中馬尿酸、煙酰胺和壬二酸可能是與奶牛產(chǎn)奶相關(guān)的關(guān)鍵代謝物。Pu[37]等利用非靶向和靶向代謝組學(xué)分析了云南省不同海拔對(duì)水牛奶乳清中的差異代謝物的影響并進(jìn)行了評(píng)價(jià)，得出在低海拔（912m）地區(qū)的水牛奶的生物功能成分豐富，更適合生產(chǎn)氨基酸、維生素B6和碳水化合物含量較高的功能性乳品，而在高海拔（1865m）地區(qū)的水牛奶則適合作為生產(chǎn)游離脂肪酸含量高的乳制品原料乳。Xue[38]等通過瘤胃宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)，并結(jié)合血清代謝組學(xué)分析乳蛋白產(chǎn)量（Milk Protein yield,MPY）在瘤胃微生物和宿主水平上的潛在調(diào)控機(jī)制，同時(shí)利用瘤胃代謝組學(xué)進(jìn)行表型（MPY）關(guān)聯(lián)分析，為精確喂養(yǎng)改善牛奶質(zhì)量和產(chǎn)量的研究提供了新思路。

2.4 代謝組學(xué)在奶牛繁殖中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在奶牛繁殖領(lǐng)域的應(yīng)用也有報(bào)道，目前主要應(yīng)用于對(duì)公牛繁殖效率和精液質(zhì)量的評(píng)估。Kumar[39]通過質(zhì)子核磁共振在奶牛精漿和血液中各鑒定出4種代謝物，用作公牛繁殖力的生物標(biāo)記。同樣，奶牛精子代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)22種不同代謝物和4個(gè)代謝途徑與公牛生育力有關(guān)。Velho[40]研究得出精漿代謝物2-氧戊二酸和果糖可作為公牛繁殖力的潛在生物標(biāo)記。在實(shí)際生產(chǎn)中，如何用最簡(jiǎn)便的方法評(píng)估精液質(zhì)量始終是一個(gè)問題。Argaman[41]采集了荷斯坦公牛冬夏兩季精液精子，使用精子質(zhì)量分析儀評(píng)估精液的生理和結(jié)構(gòu)特征，通過氣相色譜鑒定及定量精液脂質(zhì)成分，結(jié)果表明，夏季高溫導(dǎo)致精液質(zhì)量變差，脂質(zhì)成分改變，包括飽和脂肪酸增高，不飽和脂肪酸、膽固醇降低。鑒于精液質(zhì)量和脂質(zhì)變化的強(qiáng)相關(guān)性，他們建議使用脂類成分來(lái)預(yù)測(cè)精液質(zhì)量。

相較于雄性動(dòng)物，雌性動(dòng)物代謝組學(xué)的應(yīng)用更為廣泛，Bender[42]等人發(fā)現(xiàn)牛卵泡液中較高水平短鏈脂肪酸（SFA）可能是泌乳母牛生育力低于青年母牛的原因。而在奶牛卵泡液中，高生育力奶牛含有更多的不飽和脂肪酸，低生育力奶牛飽和脂肪酸含量更高。隨著研究的深入，代謝組學(xué)還用于奶牛卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量評(píng)估、胚胎性別鑒定等。李迪[43]利用SVM成功建立水牛胚胎發(fā)育潛能預(yù)測(cè)模型，成功預(yù)測(cè)率達(dá)到100%，在指導(dǎo)挑選高質(zhì)量的胚胎和提高胚胎移植成功率上有較大的價(jià)值，有待推廣利用。Matoba[44]認(rèn)為L(zhǎng)-丙氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸和尿素可作為評(píng)估牛卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的標(biāo)志物。Gimeno[45]嘗試從體外培養(yǎng)胚胎的培養(yǎng)基中利用UHPLC-MS/MS預(yù)測(cè)受體妊娠和胎兒出生的潛能，發(fā)現(xiàn)易懷孕的胚胎消耗更多氨基酸和檸檬酸，消耗較少的脂質(zhì)和順烏頭酸。Rubessa[46]運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)表明，植入前的胚胎代謝可顯示出與胚胎性別相關(guān)的特征，他們使用了一種新的、非侵入性的方法來(lái)評(píng)估移植前胚胎的性別，發(fā)現(xiàn)在胚胎培養(yǎng)的早期階段，培養(yǎng)基纈氨酸濃度是良好的指標(biāo)（準(zhǔn)確度為66.7%），而在后期階段，丙酮酸耗竭是評(píng)估胚胎性別的最佳標(biāo)志物（準(zhǔn)確度為64%）。IVF、ET技術(shù)對(duì)于提高母畜繁殖效率尤為重要，而基于代謝組學(xué)的研究信息為其進(jìn)一步發(fā)展提供了重要依據(jù)。

3 總結(jié)與展望

代謝組學(xué)技術(shù)在奶牛上的應(yīng)用主要是：生物標(biāo)志物篩選和生物機(jī)制發(fā)現(xiàn)兩個(gè)方面，在奶牛疾病預(yù)測(cè)、營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、繁殖和生產(chǎn)管理上均有涉及，而且為了更深入地了解生物機(jī)制，近幾年還出現(xiàn)了奶牛多組學(xué)的研究。但是在確定生物學(xué)過程背后的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制及其在奶牛生產(chǎn)性能、福利和健康中的作用方面仍有待進(jìn)一步深入研究。多組學(xué)與其他“大數(shù)據(jù)”的結(jié)合（例如將使用與互聯(lián)網(wǎng)通信的遠(yuǎn)程傳感器測(cè)量的生理和行為數(shù)據(jù)用于監(jiān)測(cè)奶牛發(fā)情、跛足或反芻）應(yīng)該成為未來(lái)奶牛的代謝組學(xué)發(fā)展趨勢(shì)。