生物炭對土壤氮循環(huán)及其功能微生物的影響研究進(jìn)展

王翰琨，吳永波，劉俊萍，薛建輝

〔1.南京林業(yè)大學(xué)a.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，b.生物與環(huán)境學(xué)院，c.林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014〕

生物炭是指一類在完全或部分無氧的情況下，通過熱解炭化而產(chǎn)生的高度芳香化的難溶固體材料[1]。生物炭通常呈堿性[2]，具有較多的大孔隙、較高的比表面積[3]、多樣的表面官能團(tuán)[4]以及大量的不穩(wěn)定有機(jī)質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)[5]。生物炭可以作為土壤改良劑施用到土壤中，從而改變土壤理化性質(zhì)，包括陽離子交換量、酸堿度、土壤持水能力、容重、碳和養(yǎng)分含量等[6-7]，受到了眾多學(xué)者的關(guān)注[8-9]。

土壤氮循環(huán)是陸地生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)的重要組成部分，其主要過程包括生物固氮、氨化作用、氨揮發(fā)、硝化作用、硝態(tài)氮淋溶和反硝化作用等[10]，有些過程如生物固氮、硝化作用和反硝化作用等由特定的微生物功能基因所調(diào)控(圖1)。近年來，學(xué)者們開展了大量有關(guān)土壤氮循環(huán)及其功能微生物對施用生物炭的響應(yīng)研究。結(jié)果表明，生物炭通過改變土壤理化性質(zhì)，為固氮菌、硝化菌和反硝化菌的生長和繁殖提供良好的微環(huán)境[11]，最終影響土壤固氮作用[12]、硝化作用[13]和反硝化作用[14]。但由于不同研究采用的生物炭原料、裂解溫度、試驗(yàn)條件以及土壤類型等不同，其研究結(jié)果存在差異，且對土壤氮循環(huán)及其功能微生物的主要影響因素尚無定論。為此，筆者通過綜述近年來國內(nèi)外有關(guān)施用生物炭對土壤氮循環(huán)及其功能微生物影響的研究文獻(xiàn)，了解該領(lǐng)域相關(guān)研究的進(jìn)展和發(fā)展趨勢，為探討生物炭的合理使用以及生物炭調(diào)控土壤氮循環(huán)的過程與機(jī)制提供參考依據(jù)。

CYN/URE—氰酸酶/脲酶；AMO—氨單加氧酶；HAO—羥胺氧化還原酶；NXR—亞硝酸鹽氧化酶；NAR—硝酸鹽還原酶；NIR—亞硝酸鹽還原酶；NOR—NO還原酶；NOS—N2O還原酶；MoFe—固氮酶。

1 生物炭對土壤生物固氮作用及其功能微生物的影響

生物固氮是通過微生物將大氣中的氮?dú)?N2)轉(zhuǎn)化為氨(NH3)(圖1)，這些微生物也被稱為固氮微生物。固氮微生物含有編碼固氮酶的基因(包括nifH、nifK、nifD等)，其中nifH基因最為保守，常被選為研究固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的標(biāo)記基因[15]。固氮微生物主要分布在7個門共60多個屬中[16]，包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、廣古菌門(Euryarchaeota)。依據(jù)固氮微生物的生活和固氮方式可分為共生固氮菌[17]〔如根瘤菌屬(Rhizobium)、弗蘭克氏菌屬(Frankia)等〕、自生固氮菌〔如固氮菌屬(Azotobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、念珠藍(lán)細(xì)菌屬(Nostoc)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)等〕、聯(lián)合固氮[18]〔如假單胞菌屬(Psedomonas)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等〕。

固氮微生物群落結(jié)構(gòu)和固氮酶活性受到多種環(huán)境因素的影響，主要包括氧氣、微量元素鐵和鉬、養(yǎng)分有效性等。其中，前兩者是影響固氮微生物的核心因素，鐵和鉬是合成固氮酶的必需元素。固氮酶的蛋白質(zhì)對氧氣濃度極為敏感，其一旦暴露在空氣中，極易發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的失活[19]，因此絕大多數(shù)固氮微生物是在厭氧或低氧的條件下進(jìn)行固氮作用。

1.1 施用生物炭對土壤固氮作用的影響

生物炭添加到土壤后，通常會增強(qiáng)其生物固氮能力。施用生物炭對不同地區(qū)土壤生物固氮的影響見表1。AZEEM等[20]通過同位素示蹤技術(shù)研究生物炭對土壤共生固氮的影響，結(jié)果表明，施用生物炭提高了根瘤的生物固氮速率，且土壤固氮能力隨施用量的增加而增強(qiáng)。有研究認(rèn)為，生物炭施用會增強(qiáng)豆科植物的固氮能力[21-22]。NISHIO等[23]發(fā)現(xiàn)，在苜蓿發(fā)育早期添加生物炭后，其固氮能力提高15%，結(jié)瘤發(fā)育最大時的生物固氮能力可提高227%。孟穎等[12]通過盆栽試驗(yàn)結(jié)合土壤培養(yǎng)法，發(fā)現(xiàn)增大2種生物炭的施用量(0～60 g·kg-1)，土壤自生固氮能力均顯著增強(qiáng)。此外，生物炭對土壤固氮作用的影響因制備原料的不同而存在差異。相較于水稻秸稈生物炭，玉米秸稈生物炭對土壤固氮能力的促進(jìn)作用更強(qiáng)[12]。

表1 施用生物炭對不同地區(qū)土壤生物固氮的影響

1.2 施用生物炭對土壤固氮微生物的影響

生物炭可以改善土壤理化特性，提高共生固氮菌和自生固氮菌的數(shù)量[12,22,24]。越來越多的研究表明，生物炭的添加改變了土壤固氮微生物的數(shù)量和多樣性。DUCEY等[25]通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施用柳枝稷生物炭后，土壤nifH基因的拷貝數(shù)顯著升高，且升高幅度隨著施用量的增加而增大，在施用量w為10%時，基因豐度可增大3倍。與此同時，施用生物炭后，相比于對照土壤，土壤nifH基因的相對豐度也顯著升高，表明施用生物炭增大了土壤中固氮微生物的多樣性。ABUJABHAH等[26]研究表明，土壤固氮菌(包括根瘤菌屬和固氮螺菌屬等)相對豐度與桉樹生物炭的施用量呈正相關(guān)。盡管多數(shù)研究表明，施用生物炭可提高土壤的nifH基因豐度，提高固氮微生物的總生物量，但這種影響依賴于生物炭的裂解溫度、試驗(yàn)類型和覆蓋植物等[28]。低溫裂解(400 ℃)的生物炭更有利于土壤nifH基因豐度的增加，增幅可達(dá)88%；相較于野外試驗(yàn)條件，室內(nèi)培養(yǎng)條件下土壤nifH基因豐度對生物炭的正響應(yīng)更明顯。Meta分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)條件顯著影響土壤nifH基因豐度對生物炭的響應(yīng)，室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)中添加生物炭提高了nifH基因的豐度，盆栽試驗(yàn)中添加生物炭卻降低了nifH基因的豐度，且由于盆栽試驗(yàn)栽種的植物可形成根瘤，土壤中存在許多共生固氮菌?？梢?，添加生物炭可能促進(jìn)自生固氮菌的生長，但抑制共生固氮菌的生長，這種現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)理還不清楚[28]。值得注意的是，XIAO等[28]的研究并未考慮到試驗(yàn)類型不同可能帶來的差異，盆栽條件下土壤nifH基因豐度的降低是由于生物炭還是植物的作用，這點(diǎn)還不明確。因此在控制試驗(yàn)類型的條件下，進(jìn)一步探究生物炭對土壤自生固氮和共生固氮的影響及其內(nèi)在機(jī)制是必要的。

1.3 生物炭影響土壤固氮微生物的機(jī)制

1.3.1鐵、鉬等元素的有效性

鐵、鉬元素是固氮酶Mo-Fe蛋白的一種成分[29]，其有效性的高低直接影響固氮酶活性以及生物固氮，因此鐵、鉬可能是生物炭影響土壤固氮作用的關(guān)鍵因素。RONDON等[22]研究驗(yàn)證了這一假設(shè)，結(jié)果表明，鉬的有效性隨著生物炭的添加而增加，但鐵的有效性在生物炭添加前后未發(fā)生改變。此外，PEREZ等[30]研究認(rèn)為，土壤中碳有效性的高低也是影響固氮微生物群落豐度和活性的重要因素。生物炭施用可為土壤固氮微生物提供可利用碳源，從而促進(jìn)固氮微生物的生長。一些研究表明，土壤固氮菌群落豐度以及固氮酶活性與土壤碳含量存在顯著正相關(guān)性[22,25-26]，土壤SOC、DOC含量的升高是生物炭促進(jìn)生物固氮的原因之一。

1.3.2氧含量

生物炭具有較高的比表面積和孔隙率，能夠有效吸收和保留水分，進(jìn)而提高土壤含水率[3]，而含水率的增大有利于形成厭氧環(huán)境，提高固氮酶活性，進(jìn)而增強(qiáng)土壤的生物固氮能力[20]。此外，生物炭施用后土壤容重降低，土壤中增加的孔隙空間有利于根瘤的形成。

2 生物炭對土壤氨揮發(fā)的影響

通過固氮、氨化、水解等過程產(chǎn)生的銨態(tài)氮(NH4+)除了被植物吸收外，一部分通過硝化作用轉(zhuǎn)化為NO3-，一部分以氨的形式揮發(fā)到大氣中(圖1)，只有少部分保留在土壤中。可見，氨揮發(fā)是土壤氣態(tài)氮損失的重要途徑之一，氨揮發(fā)不僅降低了氮利用率，還會對水、大氣和土壤環(huán)境造成嚴(yán)重污染[31-32]。銨態(tài)氮在土壤生物系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)化是一個包括多種反應(yīng)的復(fù)雜動力學(xué)過程[33]，其中與氨揮發(fā)直接相關(guān)的化學(xué)平衡包括：NH4+(代換性)? NH4+(液相)? NH3(液相)? NH3(氣相)? NH3(大氣)。對土壤而言，土壤溶液是液相，土壤表層空氣是氣相，氨揮發(fā)發(fā)生在土壤表面。

土壤氨揮發(fā)的主要環(huán)境因素是土壤pH值和黏粒含量，土壤pH值升高對氨揮發(fā)有促進(jìn)作用[34]。這是因?yàn)閜H值決定了氨揮發(fā)的化學(xué)平衡，pH值升高(堿性環(huán)境下)有利于銨態(tài)氮向氨的轉(zhuǎn)化。與土壤pH值相反，土壤黏粒對氨揮發(fā)有抑制作用。FAN等[35]研究表明，黏粒含量較高的土壤氨揮發(fā)顯著小于黏粒含量較低的土壤，一是由于黏粒對NH4+具有較強(qiáng)的吸附作用，可抑制其向NH3的轉(zhuǎn)化；二是由于較高含量的黏粒能顯著降低土壤的通透性，不利于氨氣擴(kuò)散到大氣中。

2.1 施用生物炭對土壤氨揮發(fā)的影響

許多研究顯示，生物炭對土壤氨揮發(fā)具有抑制作用(表2)。

表2 施用生物炭對不同地區(qū)土壤氨揮發(fā)的影響

CHEN等[36]通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物炭的添加顯著減少了土壤氨揮發(fā)，且隨著施用量的提高(0～20%)，土壤氨氣的減排量增加。許云翔[37]通過觀測稻稈生物炭對太湖流域稻麥輪作農(nóng)田土壤氨揮發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)稻稈生物炭可顯著降低土壤氨揮發(fā)累積量，但隨著施用量的增大(0～22.5%)，土壤氨揮發(fā)累積量呈先下降后上升的趨勢，而最大施用量下的氨揮發(fā)累積量仍顯著小于對照。因此，中量生物炭的添加既可緩解土壤氨揮發(fā)，又可節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本。此外，不同原料制備的生物炭對土壤氨揮發(fā)的影響存在差異。MANDAL等[38]研究顯示，2種生物炭(垃圾和堅果殼)均顯著減緩2種土壤類型(酸性土和堿性土)的氨揮發(fā)，且前者對土壤氨揮發(fā)的減緩效果更明顯。鐘婷[39]也認(rèn)為，秸稈生物炭能顯著控制稻田土壤的氨揮發(fā)，可減緩20%以上的稻田土壤氨累積揮發(fā)。也有一些研究報道了生物炭對土壤氨揮發(fā)的促進(jìn)作用[40-42]。SHA等[43]認(rèn)為，在不同的土壤、生物炭和試驗(yàn)條件下，生物炭對土壤氨揮發(fā)的影響存在很大差異。一般而言，生物炭的施用能減緩?fù)寥腊睋]發(fā)，但生物炭添加到酸性土壤中可能會刺激土壤的氨揮發(fā)[42]。

2.2 生物炭影響土壤氨揮發(fā)的機(jī)制

2.2.1生物炭的吸附

生物炭因其孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)、比表面積巨大等特性，往往具有較強(qiáng)的吸附能力。HALE等[44]研究顯示，可可豆殼生物炭和玉米芯生物炭均對氨氣和銨態(tài)氮有較強(qiáng)的吸附能力。劉瑋晶等[45]通過室內(nèi)模擬試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物炭添加后，能顯著提高土壤對銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸附量，表明生物炭在提高土壤對無機(jī)態(tài)氮的吸附能力方面具有顯著的效果。生物炭對土壤銨態(tài)氮的吸附可抑制其向氨氣的轉(zhuǎn)化，同時生物炭吸附氨氣可削弱其擴(kuò)散到大氣中。

2.2.2土壤pH值

pH值是影響土壤氨揮發(fā)的重要因素之一。多數(shù)生物炭由于自身pH值較高，施用到土壤后會在一定程度上提高土壤pH值，進(jìn)而打破土壤環(huán)境的化學(xué)平衡，從而促進(jìn)土壤氨揮發(fā)，特別是酸性土壤[40]。CHEN等[36]認(rèn)為，生物炭通過pH值影響土壤氨揮發(fā)依賴于土壤本底酸堿度的高低，具體表現(xiàn)為：當(dāng)土壤為酸性時，施用生物炭往往能顯著提高土壤pH值(“石灰效應(yīng)”)，從而促進(jìn)土壤氨揮發(fā)；當(dāng)土壤為中性或微堿性時，施用生物炭降低土壤氨揮發(fā)；當(dāng)土壤為堿性時，施用生物炭不會顯著影響土壤氨揮發(fā)，此時土壤的銨態(tài)氮多數(shù)已經(jīng)通過氨揮發(fā)流失到大氣中。因此，適量施用木炭等孔隙較大或pH值較低的生物炭，更有利于減緩?fù)寥赖陌睋]發(fā)[43]。

3 生物炭對土壤硝化作用及其功能微生物的影響

硝化作用的過程一般分為2步，均在有氧條件下完成，首先是將銨態(tài)氮氧化為亞硝態(tài)氮，然后將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮(圖1)，這兩步也被稱為氨氧化和亞硝酸鹽氧化。氨氧化過程主要是由氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)完成，其含有調(diào)控氨單加氧酶(AMO)合成的amoA基因。根據(jù)16S rRNA測序結(jié)果，AOB主要屬于β變形菌綱的亞硝基單胞菌科(Nitrosomonadaceae)和γ變形菌綱的著色菌科(Chromatiaceae)，包括亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)等[46]。而目前發(fā)現(xiàn)的AOA均屬于奇古菌門，但AOA還存在許多未知菌種，對于AOA的認(rèn)知還處于起步階段。亞硝酸鹽氧化過程主要由亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB)完成。NOB主要分布在4個屬[47]，包括硝化球菌屬(Nitrococcus)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、硝化桿菌屬(nitrobacter)、硝化刺菌屬(Nitrospina)。

氧含量和pH值是影響硝化微生物群落組成的關(guān)鍵環(huán)境因素。土壤pH值能顯著影響土壤硝化作用，是影響氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的最重要因素之一[48]。氧氣是氨氧化反應(yīng)的基質(zhì)，由于AOA對氧氣的半飽和常數(shù)比AOB低[49]，因此氧氣濃度的高低會對氨氧化微生物的生態(tài)位分異造成影響。

3.1 施用生物炭對土壤硝化作用的影響

目前生物炭對土壤硝化作用的影響主要是根據(jù)土壤硝化速率確定，一些研究也根據(jù)土壤中硝酸鹽的變化量來評估[50]。從表3可知，野外條件和室內(nèi)培養(yǎng)條件下的試驗(yàn)結(jié)果均表明，生物炭施用對各地區(qū)的土壤硝化作用主要起促進(jìn)作用。PROMMER等[13]在歐洲溫帶地區(qū)可耕土壤進(jìn)行野外觀測試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施用生物炭后土壤硝化速率加快了3倍多，表明生物炭的施用促進(jìn)了土壤硝化作用。同樣地，SONG等[51]在黃河三角洲的盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物炭的施用促進(jìn)了該地區(qū)的土壤硝化速率。生物炭的理化性質(zhì)因制備工藝(裂解溫度和原料)存在差異，故施用后對土壤硝化作用的影響也可能不盡相同。PEREIRA等[52]在美國地中海地區(qū)的研究結(jié)果表明，杉木在較高溫條件下制備的生物炭更能促進(jìn)土壤硝化作用。由于低溫制備的生物炭易含有多環(huán)芳烴等毒性化合物，可能會抑制生物炭改良土壤中的硝化作用[53-54]。不同原料所制備的生物炭的理化性質(zhì)不同，施用后對土壤硝化速率的影響可能會截然相反[13,55]。生物炭的施用量也是學(xué)者關(guān)注的問題之一[51]。一般而言，土壤硝化速率隨著施用量的增多，呈先增大后減小的變化趨勢，因此生物炭的施用量不宜過多。此外，生物炭對土壤硝化作用的影響還強(qiáng)烈依賴于土壤類型。根據(jù)“石灰效應(yīng)”理論，生物炭對酸性土壤硝化作用的影響更為強(qiáng)烈[56-57]。

3.2 施用生物炭對土壤硝化微生物的影響

PROMMER等[13]研究表明，土壤氨氧化微生物群落豐度隨著生物炭的施用而增加，生物炭處理的土壤AOA和AOB含量均顯著高于對照。CHEN等[63]通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了一致的結(jié)果，即小麥秸稈生物炭的施用可顯著提高土壤AOA和AOB的基因拷貝數(shù)。此外，LUO等[58]研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭顯著增加了亞硝態(tài)氮氧化菌(NOB)的豐度，改變了NOB的群落組成，但不影響NOB的α多樣性?？梢?，生物炭對土壤硝化菌具有積極影響。SONG等[51]通過研究不同施用量的生物炭對土壤硝化菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)高施用量處理下的土壤AOA和AOB基因豐度反而小于低施用量處理，且基因豐度與硝化速率的變化趨勢相似。LIU等[59]研究表明，隨著生物炭施用量的增加(0～4%)，土壤中AOB和NOB的相對豐度降低，且amoA基因的拷貝數(shù)減?。坏S著施用量的增加(施用量為8%時)，amoA基因的拷貝數(shù)又有所增大。而ABUJABHAH等[26]卻認(rèn)為，生物炭施用量的增加使黑黏土(black clay loam)中硝化菌豐度提高，尤其是NOB的豐度。因此，生物炭的施用量對土壤硝化菌有顯著影響，確定合適的施用量對改善土壤硝化作用有著重要意義。不同原料制備的生物炭對土壤硝化微生物的影響存在差異。與小麥秸稈生物炭相反，花生殼生物炭的施用降低了土壤AOB的基因豐度[50,63]，這可能是由于花生殼生物炭中含有一些毒性化合物，抑制了硝化細(xì)菌數(shù)量的增長。另一項(xiàng)研究也顯示，不同生物炭對土壤AOB的基因豐度有著不同程度的抑制作用[52]。但一些研究卻發(fā)現(xiàn)，由于生物炭對抑制性化合物的吸附以及木炭的“石灰效應(yīng)”， 向森林土壤中添加野火木炭有利于AOB豐度的增加[57]。LUO等[58]研究也顯示，在生物炭+石灰石處理的樣品中，硝化螺旋菌Nitrospira(nxrB，NOB)的豐度增加，這與潛在的亞硝酸鹽氧化活性(PNO)、pH值和速效鉀含量顯著相關(guān)。此外，一些研究也認(rèn)為，解釋生物炭促進(jìn)土壤硝化微生物生長的主要理論之一是“石灰效應(yīng)”[57,64]。

生物炭處理的土壤中硝化微生物含量升高，但不同群體(AOA、AOB以及NOB)對硝化過程的相對重要性和貢獻(xiàn)是不同的。XU等[60]的盆栽試驗(yàn)表明，稻草生物炭的施用提高了氨氧化微生物的活性，且古生菌可能比細(xì)菌對生物炭增強(qiáng)硝化作用的貢獻(xiàn)更大，因?yàn)樯锾匡@著增加了古生菌amoA豐度的表達(dá)，而不是細(xì)菌amoA。但DUCEY等[25]通過6個月的培養(yǎng)試驗(yàn)，觀察到生物炭存在時土壤細(xì)菌amoA豐度更高。ZHANG等[65]也認(rèn)為，AOB對硝化作用的貢獻(xiàn)可能更大。SONG等[51]認(rèn)為，盡管在生物炭處理的土壤中AOB比AOA更豐富，但后者與硝化速率有更強(qiáng)的相關(guān)性，AOA是土壤硝化過程的重要參與者。一項(xiàng)近來的研究結(jié)果顯示，生物炭的短期施用增強(qiáng)了AOB中amoA的基因拷貝，AOB在新鮮生物炭影響土壤硝化作用的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，解釋了生物炭處理下硝化作用變化的6.1%；但在長期生物炭施用下，古生菌在土壤中的氨氧化原核生物中占主導(dǎo)地位，對土壤硝化作用更為重要[61]。到目前為止，AOA和AOB作為硝化作用第1步的調(diào)控者被廣泛研究，驅(qū)動土壤硝化第2步的NOB的作用卻被忽視，亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽是生物地球化學(xué)氮循環(huán)的一個重要過程[47]。一項(xiàng)研究表明，不同硝化菌(AOA、AOB、NOB)對茅臺酒糟生物炭的響應(yīng)存在差異，茅臺酒糟生物炭顯著降低了土壤AOA和NOB的相對豐度，但顯著提高了AOB的相對豐度；NOB是影響土壤氮含量的主要因素，而不是AOA和AOB，茅臺酒糟生物炭通過降低亞硝酸鹽氧化作用來改變氨氧化作用，從而影響黃土氮養(yǎng)分的有效性，施用量4%處理提高了氮肥保留率，降低了黃土氮浸出損失的風(fēng)險[62]。

3.3 生物炭影響土壤硝化微生物的機(jī)制

3.3.1土壤pH值

土壤pH值是影響硝化微生物的關(guān)鍵因素之一，與土壤硝化作用的變化密切相關(guān)。鮑俊丹等[66]通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，土壤最大硝化速率與土壤pH值呈顯著正相關(guān)關(guān)系，且酸性土壤不利于硝化菌的生長，其最佳pH值為6.6～8.0。生物炭自身為堿性，施加到土壤中將顯著提高土壤pH值，有利于土壤硝化菌的生長。XU等[60]研究表明，施用生物炭引起的土壤pH值變化是土壤微生物群落變化的主要解釋因子，占總變化的56.5%。土壤硝化微生物(如AOB和NOB)與土壤pH值之間存在顯著相關(guān)性[58,67]。施用生物炭對土壤硝化菌豐度的影響受限于土壤類型，在酸性土壤中，施用生物炭對硝化菌豐度的促進(jìn)效果更為顯著[28,68]。此外，土壤pH值是AOA和AOB發(fā)生生態(tài)位分化的重要原因。許多研究報道了生物炭施用后，土壤AOB的基因豐度大于AOA[25,51,65]。這是由于AOA在酸性環(huán)境中更為活躍，而堿性或中性環(huán)境更有利于AOB的生長[69-70]。以上研究表明，土壤pH值是生物炭施用背景下影響土壤硝化作用的重要驅(qū)動因素。

3.3.2氧含量

經(jīng)生物炭處理的土壤硝化速率的增加可能歸因于土壤氧氣狀態(tài)的改變，包括氧氣含量和土壤水分的相關(guān)變化，因?yàn)橄趸饔靡蕾囉谕寥姥鯕獾目衫眯?。土壤中空氣和水的平衡對硝化作用至關(guān)重要，硝化作用在60%的飽和孔隙度處達(dá)到峰值[71]，而生物炭的施加顯著改變了土壤的水分狀況[72]。PROMMER等[13]研究證明，生物炭存在大量可定植的孔隙，在這些孔隙中，AOA和AOB有足夠的氧氣和可用銨。目前，生物炭施用背景下，土壤含氧量與土壤硝化作用及其功能微生物的關(guān)系還鮮見報道，有待進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

4 生物炭對土壤反硝化作用及其功能微生物的影響

反硝化作用被認(rèn)為是土壤中NO3-在厭氧條件下，通過一系列反硝化微生物的作用，漸次還原成NO2-、NO、N2O、N2的生物學(xué)過程[16](圖1)，這4步過程需要的還原酶依次為：(1)nar基因編碼的硝酸鹽還原酶；(2)nir基因編碼的亞硝酸鹽還原酶；(3)nor基因編碼的一氧化氮還原酶；(4)nos基因編碼的氧化亞氮還原酶。反硝化微生物廣泛分布于細(xì)菌、真菌和古生菌中，包括假單胞菌科(Pseudomonaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、鹽桿菌科(Halobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、噬纖維菌科(Cytophagaceae)等。

反硝化作用受土壤含氧量、pH值、碳有效性等多種環(huán)境因子的影響。反硝化作用是一個厭氧過程，氧氣的存在能夠抑制硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的合成，進(jìn)而不利于整個反硝化作用的進(jìn)行。此外，土壤含氧量不同也會導(dǎo)致反硝化氣體產(chǎn)物組成的差異，低含氧量的環(huán)境有利于氧化亞氮向氮?dú)獾倪€原[73]。土壤pH值是影響反硝化作用的重要因素之一，酸性環(huán)境下反硝化速率慢。大多數(shù)反硝化作用是通過異養(yǎng)微生物進(jìn)行的，因此高度依賴于碳源。且碳源分解的同時產(chǎn)生CO2，有利于低氧環(huán)境的形成[74]。

4.1 施用生物炭對土壤反硝化作用的影響

越來越多的研究表明，施用生物炭可緩解土壤N2O的排放(表4)。ZHANG等[75]研究認(rèn)為，對我國中部平原石灰性土壤施用小麥秸稈生物炭后，N2O 排放量減少10.7%～41.8%，且隨著施用量(0～40 t·hm-2)的增加，排放量降幅增大。FUNGO等[76]將桉木生物炭與土壤混合并培養(yǎng)20 d后發(fā)現(xiàn)，施用2%生物炭可使土壤N2O排放量減少52%～78%，將生物炭施用量從2%提高到4%，土壤N2O累積排放量進(jìn)一步減少，但無顯著差異。SONG等[77]通過24個月的田間試驗(yàn)研究施用生物炭對亞熱帶人工林土壤N2O排放的影響，結(jié)果表明，施用竹葉生物炭顯著降低土壤N2O排放量，且降低速率與生物炭施用量呈正相關(guān)。KHAN等[78]和BEAULIEU等[79]研究也表明，生物炭施用量的提高有利于其緩解土壤N2O的排放。BRASSARD等[80]對76種生物炭的特性進(jìn)行匯編和比較后發(fā)現(xiàn)，氮含量較低、C/N比高的生物炭更適合用于緩解土壤N2O的排放。CAYUELA等[81]也報道了相似的結(jié)果：生物炭的C/N比<10時，促進(jìn)土壤N2O的排放；C/N比為10～30時，N2O 的排放會發(fā)生顯著改變；C/N比>30時，N2O排放減少。但總體而言，施用生物炭減少了土壤中54%的N2O排放。并且，生物炭對N2O排放的影響也會由于生物炭原料、熱解條件不同產(chǎn)生顯著差異。如施用木炭、有機(jī)垃圾生物炭會減少N2O的排放，而施用污泥炭則會促進(jìn)N2O的排放；裂解溫度越高，N2O排放量降幅越大[81]。AMELOOT等[82]也報道了相似的結(jié)果，控制環(huán)境、施用量和土壤相同條件下，施用350 ℃制備的豬糞和柳木生物炭使N2O排放分別減少19%和36%，而700 ℃制備的豬糞和柳木生物炭使N2O排放分別減少60%和67%。另一項(xiàng)研究結(jié)果卻顯示，盡管施用生物炭減少了30.92%的土壤N2O排放，但這種影響受到生物炭原料、施用量和土壤特性(質(zhì)地、pH值)的干擾[83]。

相比于單獨(dú)施用生物炭，生物炭與肥料的聯(lián)合施用對土壤反硝化作用的影響截然不同。WEI等[85]對生物炭與施肥(氮肥)共同影響土壤氮損失的研究表明，當(dāng)施氮肥量小于 60 kg·hm-2時，生物炭的施用使農(nóng)田土壤N2O排放量降低8.23%；當(dāng)施氮肥量大于 60 kg·hm-2時，施用生物炭使土壤N2O排放量增加18%～26%。CHEN等[86]研究表明，施肥(尿素)土壤中加入稻殼生物炭，將導(dǎo)致N2O排放量高于單獨(dú)施肥土壤，增加49%。這可能是由于生物炭中的活性碳促進(jìn)了土壤碳對微生物氮的礦化，從而導(dǎo)致N2O排放增加。LIN等[87]通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)研究了生物炭與尿素對土壤N2O排放的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)45 d后，4%生物炭與尿素處理下的土壤N2O累計排放量為17.89 mg·kg-1，是單獨(dú)施肥處理的3.56倍。

4.2 施用生物炭對土壤反硝化微生物的影響

反硝化作用是氧化亞氮排放的重要途徑，受微生物功能基因的調(diào)控[16]。NO3-還原為NO2-主要由narG和napA基因調(diào)控。一項(xiàng)研究表明,生物炭的施用使土壤narG基因豐度平均提高13.7%[28]。HE等[61]研究也表明，施用生物炭顯著提高了narG基因的拷貝數(shù)。但缺乏施用生物炭如何影響napA基因表達(dá)的相關(guān)研究。nirK和nirS是調(diào)控NO2-還原為NO的關(guān)鍵基因，且被視為測量土壤反硝化作用的標(biāo)記基因[88]。研究表明，生物炭的施用顯著增加了nirS、nirK、nosZ基因的拷貝數(shù)[61]以及基因的豐度[11,28]。SHI等[84]研究顯示，施用生物炭顯著降低了nirS和nirK基因的拷貝數(shù)，卻顯著增加了nosZ基因的拷貝數(shù)。這可能是不同試驗(yàn)中采用的覆蓋植物類型、生物炭性質(zhì)等存在差異所致[27,59-60]。

盡管施用生物炭后土壤N2O排放受到抑制，但nirS、nirK以及nosZ等基因的總和不能用于指示N2O 的排放，因?yàn)槊總€基因參與反硝化作用的步驟不同，對反硝化作用的貢獻(xiàn)也存在差異。一些研究發(fā)現(xiàn)，nirK與nirS豐度比值與N2O排放量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，且含有nirK和nirS基因的反硝化菌缺乏減少N2O濃度的遺傳能力[89]，因此它們被認(rèn)為是反硝化過程中N2O排放的主要貢獻(xiàn)者[84]。盡管多數(shù)研究結(jié)果顯示，生物炭促進(jìn)了土壤反硝化微生物功能基因的拷貝，但生物炭的施用最終減緩了土壤N2O的排放，生物炭的施用減小了nirS+nirK/nosZ比值[67,88]，表明nosZ豐度的增長與土壤N2O排放減少更為相關(guān)。此外，XIAO等[28]的研究結(jié)果顯示，nosZ基因豐度與N2O排放量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。XU等[60]通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物炭增加了nosZ基因的拷貝數(shù)，而對nirK和nirS的基因豐度沒有顯著影響，表明生物炭增強(qiáng)的nosZ基因轉(zhuǎn)錄可能是土壤N2O排放減少的主要原因。VAN ZWIETEN等[90]也認(rèn)為，土壤N2O排放減少主要是由于nosZ基因豐度對生物炭的響應(yīng)所致。生物炭通過促進(jìn)N2O還原微生物的活性增強(qiáng)和生長，進(jìn)而影響N2O的最終排放，這個觀點(diǎn)被越來越多的學(xué)者認(rèn)同[14,63,91-92]。

4.3 生物炭影響土壤反硝化微生物的機(jī)制

4.3.1土壤氧含量

土壤反硝化作用是在厭氧或者低氧的條件下進(jìn)行的[93]，因此土壤氧氣含量是控制反硝化速率的重要因素[94]。HARTER等[14,91]認(rèn)為，由于生物炭含有較高的孔隙率，施加到土壤后能有效改善土壤的透氣性，可降低參與反硝化過程的微生物活性，進(jìn)而抑制土壤反硝化作用。YANAI等[95]也報道了相似的結(jié)果，在土壤含水量達(dá)78%的黏土中添加10%的生物炭，可使N2O排放量減少89%。研究人員認(rèn)為，這種減少是由于生物炭表面可能吸收了水分，從而改善了土壤透氣性，抑制了N2O的排放。LéVESQUE等[96]通過338 d的培養(yǎng)試驗(yàn)，研究了施用5%木炭對黏土溫室氣體排放的影響，結(jié)果表明，生物炭的施用顯著降低了土壤N2O的排放。相比于高孔隙的生物炭，低孔隙的生物炭施用后，土壤N2O的排放量更多。此外，生物炭可形成對氧氣高度敏感的N2O還原酶所需的局部厭氧微場所[97]，有利于N2O向N2的轉(zhuǎn)化。

4.3.2土壤pH值

除土壤氧含量外，土壤pH值也是影響土壤反硝化作用的重要因素。IMEK等[98]認(rèn)為，當(dāng)土壤pH值高于7時，更有利于土壤反硝化作用的最后一步，此時N2作為反硝化作用的產(chǎn)物，比N2O更重要。多數(shù)研究結(jié)果表明，由于生物炭的“石灰效應(yīng)”，其對土壤pH值的增大有助于N2O還原酶活性的提高，促進(jìn)反硝化作用的完全反應(yīng)(轉(zhuǎn)化為N2)[90,99]。PEREIRA等[52]也認(rèn)為，生物炭的添加顯著增加了土壤pH值，有利于N2O還原微生物的生長。添加生物炭將顯著提高土壤pH值，改善土壤酸環(huán)境和相關(guān)的反硝化功能基因，從而減弱土壤N2O的排放，土壤pH值和N2O排放量呈顯著負(fù)相關(guān)。

4.3.3氮和碳底物的可用性

有效態(tài)氮尤其是硝態(tài)氮，是反硝化過程進(jìn)行的基本底物。CASE等[100]研究表明，生物炭的施用降施用低了沙壤土中N2O的排放量，其主要原因是固氮量(NH4+、NO3-等)的增加而不是土壤pH值的升高。SONG等[77]也報道了相似的研究結(jié)果，施用生物炭降低了土壤反硝化速率，減少了N2O的排放，且N2O的排放與土壤含水量無顯著相關(guān)性，與土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、可溶性有機(jī)氮含量呈顯著正相關(guān)。生物炭的吸附作用可增強(qiáng)土壤固氮作用，降低反硝化作用底物的可利用性，從而抑制反硝化作用的進(jìn)行。CHEN等[86]研究也表明，碳和氮的可利用性對土壤反硝化過程具有重要作用。反硝化是一個電子消耗和異養(yǎng)過程，土壤有機(jī)物為硝態(tài)氮的還原提供電子，為反硝化菌的生長和活性提供有機(jī)底物。生物炭施用后，土壤DOC含量和電導(dǎo)率等顯著提高，可為微生物提供足夠的有機(jī)碳源和營養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)反硝化菌的活性[61]。

5 展望

施用生物炭對改善土壤氮循環(huán)具有重要作用。生物炭的添加有利于土壤pH值的升高，較適用于酸性土壤pH值的調(diào)節(jié)。同時，生物炭通常具有較高的比表面積和孔隙度，使其能有效地吸附和保留養(yǎng)分、水分等，為微生物的生長提供較好的環(huán)境條件，有利于提高土壤微生物活性。大量研究結(jié)果表明，施用生物炭有利于改善土壤理化性質(zhì)，增強(qiáng)固氮菌、硝化菌和反硝化菌的活性，提高nifH、amoA、nirK、nirS、nosZ等基因的豐度，這對促進(jìn)土壤固氮、氮礦化、減緩NH3和N2O排放發(fā)揮了重要作用。近10 a來，有關(guān)生物炭對土壤氮循環(huán)的作用過程及機(jī)理研究取得了較大進(jìn)展，尤其在闡明微生物功能基因的影響機(jī)理方面有所突破，但在許多領(lǐng)域仍有待進(jìn)一步研究。

(1)由于生物炭在土壤中的存在時間長，因此它對土壤氮循環(huán)的作用過程是一個長期過程。目前許多研究的試驗(yàn)周期較短，且大多為盆栽試驗(yàn)，與田間原位試驗(yàn)的土壤環(huán)境存在較大差異，可能造成對生物炭影響土壤氮循環(huán)的評估出現(xiàn)偏差。因此，應(yīng)開展長期的定位監(jiān)測和研究，以準(zhǔn)確評估施用生物炭對土壤氮循環(huán)的長期作用過程。

(2)目前，施用生物炭對氮循環(huán)功能微生物的影響研究較為有限，且多數(shù)研究關(guān)注施用生物炭對微生物群落豐度的影響，缺乏其對微生物群落組成、活性和關(guān)鍵種的影響等方面的研究。未來應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)研究，以綜合分析功能微生物對施用生物炭的響應(yīng)。

(3)目前，雖然有關(guān)生物炭影響氮循環(huán)功能基因的機(jī)理研究已取得一定進(jìn)展，但有關(guān)不同基因?qū)ν寥赖h(huán)主要生態(tài)過程的貢獻(xiàn)大小還存在不確定性，如AOA和AOB對硝化作用的貢獻(xiàn)，nirK、nirS、nosZ等基因?qū)Ψ聪趸饔玫呢暙I(xiàn)，都有待深入研究。采用穩(wěn)定同位素技術(shù)等手段可以更為精確地識別生物炭施用對土壤氮循環(huán)功能微生物變化的作用，有待未來開展進(jìn)一步研究。