高嶺土對煤生物產(chǎn)氣的影響及微生物群落響應(yīng)

何 環(huán)，黃新穎，黃再興，張 倩，陳子豪，趙 晗，任恒星，黃冠華

(1.中國礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，煤炭加工與清潔利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116；2.煤與煤層氣共采國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉城 048000)

煤層氣是成煤物質(zhì)在煤化作用過程中生成且儲集于煤層中的一種非常規(guī)天然氣[1]，根據(jù)成因可以分為熱成因氣和生物成因氣，其中，生物成因氣具有分布廣、埋藏淺和開發(fā)成本低的特點(diǎn)，利用微生物增產(chǎn)煤層氣是當(dāng)前煤層氣開發(fā)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

煤生物產(chǎn)氣過程受到多種因素的影響，國內(nèi)外研究人員希望通過優(yōu)化產(chǎn)氣條件來提高甲烷生成效率[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種因素對煤生物產(chǎn)甲烷有很大影響。其中，包括物理因素如溫度[3]、pH 值[4-5]，化學(xué)因素如氧化還原電位[6]、外加碳源種類[7]、煤化程度[8]等，以及生物因素如外源菌群[9]、微生物預(yù)處理[10]等。煤是一種由無機(jī)礦物和有機(jī)質(zhì)構(gòu)成的復(fù)雜化合物，因此，其賦存的無機(jī)礦物對生物產(chǎn)氣過程也會存在一定影響。鄧寅生等[11]研究表明煤矸石的添加有利于義馬長焰煤生物甲烷的產(chǎn)生；邵培等[12]證明煤中灰分對生氣速率有影響，其中，黃鐵礦和黏土礦物可以提高生物活性，加快生氣速率。

高嶺土是自然界中一種分布較常見的黏土礦物，在煤中分布也較多。已有研究表明，水相體系中固液界面上的離子、有機(jī)物和微生物與高嶺土的相互作用控制著環(huán)境中許多重要的地球化學(xué)過程[13]。高嶺土的存在會對微生物的分布、活性、多樣性、基因表達(dá)與電子傳遞等產(chǎn)生影響。D.A.Ams 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，高嶺土可以作為Pseudomonas mendocina的營養(yǎng)來源，該細(xì)菌所分泌的嗜鐵素與高嶺土中的鐵結(jié)合，加快礦物中鐵元素的溶出速率，為菌株代謝提供生長因子。目前，研究人員大多支持礦物提高微生物活性是基于礦物的表面活性，但也有一些研究者認(rèn)為礦物可以改變微生物的代謝方式來提高微生物活性[15]。J.Cuadros等[16]報(bào)道高嶺土可以促進(jìn)Escherichia coli的生長，主要原因在于高嶺石降低了大腸桿菌對葡萄糖的降解速率，并將菌株降解乙酸所釋放的部分能量用于細(xì)胞分裂。在貧瘠營養(yǎng)或者不利環(huán)境條件(如重金屬、加熱、紫外線等)下，礦物可保護(hù)微生物，維持微生物活性。最新研究結(jié)果顯示，當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞附著在高嶺土表面時，細(xì)菌的氧化還原代謝得到促進(jìn)，可以對抗惡劣環(huán)境刺激[17]。也有研究指出，高嶺土與銀組成的復(fù)合物可以有效控制食品中病原微生物數(shù)量[18]。S.Hwang等[19]指出在添加高嶺土和蒙脫石的培養(yǎng)基中，細(xì)胞的存活率明顯提高，造成這種現(xiàn)象的原因是礦物改變了細(xì)菌生存與代謝方式。

由此可見，高嶺土?xí)ξ⑸锏纳L代謝活性產(chǎn)生影響，它也是煤中較為常見的無機(jī)礦物。但是，目前有關(guān)煤中高嶺土對生物產(chǎn)氣影響的研究報(bào)道較少。榆林是我國主要的煤產(chǎn)地之一，前期研究表明，該地區(qū)的煤具有較好的生物產(chǎn)氣潛力[20]。因此，筆者以該地區(qū)煤樣作為產(chǎn)氣底物，前期馴化的微生物作為產(chǎn)氣菌群，通過大浮沉方法得到低灰分煤，研究不同高嶺土添加量對模擬產(chǎn)氣過程中CH4產(chǎn)量、總揮發(fā)性脂肪酸(Volatile Fatty Acids,VFAs)、輔酶F420、煤中有機(jī)官能團(tuán)和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為闡明煤中無機(jī)礦物對生物產(chǎn)氣的影響機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 微生物、煤與高嶺土

實(shí)驗(yàn)中所用微生物為前期馴化保存的產(chǎn)甲烷混合菌群，該菌群對褐煤有較好的厭氧降解產(chǎn)氣效果。微生物培養(yǎng)所用的基本鹽培養(yǎng)基、微量元素和微生物群落結(jié)構(gòu)組成見參考文獻(xiàn)[21-22]。研究所用煤樣采自陜西榆林，為了盡量減少煤本身的礦物組分對產(chǎn)氣結(jié)果的干擾，依據(jù)GB/T 478-2008《煤炭浮沉試驗(yàn)方法》進(jìn)行大浮沉實(shí)驗(yàn)，將榆林煤處理為不同密度等級煤，然后選擇密度等級最低的煤(1.3～1.4 g/cm3，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.84%)，粉碎篩分至0.125 mm 以下作為生物模擬產(chǎn)氣底物，處理前后煤的工業(yè)分析結(jié)果見表 1。實(shí)驗(yàn)所用高嶺土樣品購自天津市福晨化學(xué)試劑廠(化學(xué)純)，粉碎篩分至0.125 mm 以下備用。

表1 原煤和低灰分煤樣工業(yè)分析測試結(jié)果Table 1 Proximate analysis of raw coal and low ash coal samples

1.2 生物模擬產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)

為探究高嶺土添加量對榆林煤生物模擬產(chǎn)氣的影響，根據(jù)原煤中元素含量和文獻(xiàn)[23]，按照高嶺土質(zhì)量占煤質(zhì)量的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)，共設(shè)置7 個添加量梯度：0(空白對照組)、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%，編號分別為G-1、G-2、G-3、G-4、G-5、G-6、G-7。每個梯度設(shè)置3 組平行樣，將高嶺土添加到250 mL 厭氧瓶中，每組加入200 mL 培養(yǎng)基，20 g 煤粉，滅菌后用無菌注射器接種20 mL 混合菌液，蓋好瓶塞，然后將其放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)50 d，培養(yǎng)過程中定期檢測瓶內(nèi)甲烷含量變化。

1.3 參數(shù)分析方法

1) CH4含量

從模擬產(chǎn)氣第15 天開始，每隔7 d 測量厭氧瓶頂部空間中氣體產(chǎn)量的動態(tài)變化，用進(jìn)樣針采氣前要將厭氧瓶充分搖勻。每次測完后用滅菌的無菌針頭插入?yún)捬跗坎⒖焖賹捬跗宽敳靠臻g中氣體放出。采用氣相色譜氣體中CH4含量，氣相色譜條件：美國 Angilent 7890 氣相色譜配Carbonplot 色譜柱(60 m×320 μm×1.5 μm)和TCD 檢測器，氣密針進(jìn)樣，進(jìn)樣量0.5 mL。色譜進(jìn)樣口溫度150 ℃，柱溫箱溫度30℃，檢測器溫度200℃。記錄CH4濃度，然后將其換算成物質(zhì)的量(mol)，計(jì)算方法如下：

式中：n為物質(zhì)的量；c為物質(zhì)的量濃度；V為氣體體積，ρ為物質(zhì)密度；w為物質(zhì)質(zhì)量濃度；M為溶質(zhì)的摩爾質(zhì)量。

累積甲烷含量為每個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)前甲烷產(chǎn)量之和。

2) VFAs 含量

VFAs 是厭氧消化過程的重要中間產(chǎn)物，通過檢測VFAs 含量可以了解煤的生物降解過程。產(chǎn)氣結(jié)束后，分別取各實(shí)驗(yàn)組和空白組的反應(yīng)液10 mL，10 000 r/min 離心5 min，保留上清液，按照每1.5 mL樣品加75 μL 的34% 磷酸的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行封存，處理完畢后，用0.22 μm 濾膜過濾，然后密封待測。采用氣相色譜(島津，GC-2014)對VFAs 進(jìn)行測定，色譜分析條件：Stabilwax-DA 30 m×0.53 mm×0.25 m 型毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID 檢測器，檢測器溫度為150℃。

3) 輔酶F420含量

輔酶F420是一種胞內(nèi)酶，測定時需要先破碎細(xì)胞，使得其中的酶釋放出來。本次采用ELISA 方法測定F420含量，其具體過程如下：用注射器從厭氧瓶中收集培養(yǎng)液2 mL 放入滅菌離心管中，3 000 r/min 離心20 min 后，用移液器取上清1.5 mL 轉(zhuǎn)到新的滅菌離心管，10 000 r/min 離心20 min 后棄掉上清液，用PBS(pH=7.2～7.4)重懸細(xì)胞，顯微計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度達(dá)到107個/mL左右，然后對樣品進(jìn)行反復(fù)凍融，破壞細(xì)胞使其釋放出胞內(nèi)成分。用BCA 蛋白法含量測試盒(ADS-W-DB005)測定樣品中總蛋白濃度，確保其在20～2 000 μg/mL 范圍內(nèi)。按照試劑盒的操作流程取10 μL 樣品加入酶標(biāo)板孔，用酶標(biāo)儀(芬蘭，Labsystems Multiskan MS)在450 nm 波長下測定吸光度(OD 值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中輔酶F420(CoF420)含量。

4) 煤的有機(jī)官能團(tuán)

產(chǎn)氣結(jié)束后，將反應(yīng)后的殘煤真空抽濾收集，冷凍干燥后將煤樣研磨至粒度小于0.074 mm，取少量樣品與KBr 按1∶120 加入用瑪瑙研缽研磨后壓片，用紅外光譜(FT-IR)儀(德國布魯克VERTEX 80 V)分析樣品中有機(jī)官能團(tuán)，測試掃描波段范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

5) 微生物群落結(jié)構(gòu)

將產(chǎn)氣結(jié)束后的培養(yǎng)液搖勻，取40 mL 混合液放入離心管中，在13 000 r/min 下離心20 min，棄去上清液，保留沉淀物質(zhì)1～3 g，將其密封放入-80℃下冷凍24 h，然后用干冰保存寄送到上海美吉生物Illumina高通量測試平臺進(jìn)行測序。

細(xì)菌多樣性測定引物序列：

338F：5'-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3'；806 R：5'-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3'。

古菌多樣性測定引物序列：

524F：5'-TGYCAGC-CGCCGCGGTAA-3' ；958R：5'-YCCGGCGTTG-AVTCCAATT-3'。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 CH4 產(chǎn)量

不同高嶺土添加量的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)CH4量和累積產(chǎn)甲烷量曲線如圖1 所示，從圖1a 中可以看出，7 個梯度實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)氣周期并不完全同步，但是整體CH4產(chǎn)量變化趨勢基本一致。總的來看，不同添加量的高嶺土可以分為2 組，0～1.0% 和2.0%～8.0%，在這2 個添加量區(qū)間內(nèi)，大部分添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組在產(chǎn)氣前期(第15-22 天)甲烷產(chǎn)量均高于對照組，其中0.5%和4.0%添加量在第22 天時達(dá)到最高后迅速下降，而添加量為6.0%和8.0%時甲烷產(chǎn)量在(第15-第29 天)仍逐漸上升，然后分別在第29 天和第36 天后下降。大部分添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組在第50 天產(chǎn)甲烷量均超過空白對照組，并且0～1.0% 添加量和2.0%～8.0% 添加量的累積產(chǎn)甲烷量均有先升后降的趨勢，其中添加8.0 %高嶺土在第50 天產(chǎn)氣量最高，每克煤達(dá)到87.65 μmol，較空白組高30.56%，說明添加適量的高嶺土在發(fā)酵后期能夠促進(jìn)煤的生物產(chǎn)氣。

圖1 甲烷產(chǎn)量變化趨勢Fig.1 Change trend of methane production

不同高嶺土添加量的實(shí)驗(yàn)組，累積甲烷產(chǎn)量由高至低的順序?yàn)?.5%、8.0%和4.0%(圖1b)，其中，添加0.5%高嶺土實(shí)驗(yàn)組的累積產(chǎn)甲烷量最高可達(dá)216 μmol/g 煤，較空白組提高55.4%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，煤的生物產(chǎn)氣量并非與高嶺土添加量成正比，而是在一定區(qū)間內(nèi)波動，這可能是因?yàn)槲⑸锏膮捬醍a(chǎn)氣是一個動態(tài)過程，而高嶺土對不同微生物的影響存在差異，這也會影響最終產(chǎn)氣量。但是，添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組其平均甲烷產(chǎn)量(159.2 μmol/g)高于對照組(139.0 μmol/g)，說明添加適量的高嶺土能夠促進(jìn)煤的生物產(chǎn)氣。

M.L.Ali 等[24]研究高嶺土添加量對牛糞發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響，發(fā)現(xiàn)添加的高嶺土質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時可以明顯促進(jìn)甲烷的生成，因?yàn)楦邘X土在厭氧消化過程中溶解釋放的微量元素有助于提高微生物的生長活性，提高微生物之間的協(xié)同作用，促進(jìn)CH4產(chǎn)生。不同高嶺土添加量對于產(chǎn)氣的影響不同，與微生物對于無機(jī)礦物的需求有關(guān)。從目前的結(jié)果來看，高嶺土的添加并不是越多越好，這可能與高嶺土對體系中不同微生物的影響存在差異，由于本次實(shí)驗(yàn)所用的混合菌中含有大量微生物，由于其產(chǎn)生甲烷的途徑并不單一，不同途徑中起作用的微生物不同，所以不同添加量的高嶺土?xí)斐杉淄榭偖a(chǎn)量的差異。

另外，高嶺土等黏土礦物具有較好的緩沖能力和吸附能力，可以調(diào)節(jié)體系的pH 值或者吸附溶液中微生物代謝產(chǎn)生的有毒代謝物，可以較好維持微生物活性，因此對生長代謝過程有促進(jìn)作用。Chen Hao等[25]研究認(rèn)為蒙脫石和高嶺石表面可以與細(xì)菌代謝過程中產(chǎn)生的氫離子進(jìn)行交換，此過程可以間接影響微生物的活性，礦物質(zhì)可以通過將微生物所處環(huán)境的pH 值保持在生長的最佳生理范圍內(nèi)，從而對附著在上面的細(xì)菌產(chǎn)生刺激作用。Wu Huayong 等[26]研究發(fā)現(xiàn)蒙脫石吸收了惡臭假單胞菌生長過程中產(chǎn)生的抑制劑，顯著提高其代謝活性。本次研究中高嶺土添加量對產(chǎn)甲烷量也有促進(jìn)作用，尤其是在發(fā)酵后期生成的酸對產(chǎn)甲烷菌存在抑制，而高嶺土的添加對體系具有緩沖作用，促進(jìn)甲烷生成，提高甲烷產(chǎn)量。

2.2 VFAs 質(zhì)量濃度

VFAs 主要指小分子酸類物質(zhì)，它是在有機(jī)質(zhì)降解過程中形成的主要中間代謝產(chǎn)物，通常情況下，VFAs 以乙酸、丙酸和丁酸為主，存在少量的戊酸和異戊酸等物質(zhì)[27]。VFAs 是影響厭氧產(chǎn)氣穩(wěn)定性的重要因素之一，通過測定產(chǎn)氣末端產(chǎn)物中VFAs 含量，可以判斷產(chǎn)氣原料水解后是否完全轉(zhuǎn)換為乙酸等供給產(chǎn)甲烷菌利用，以及體系是否發(fā)酵完全。一般，體系中的VFAs 濃度需要控制在某個范圍內(nèi)，當(dāng)VFAs 質(zhì)量濃度高于400 mg/L，厭氧發(fā)酵體系便會受到輕度抑制，當(dāng)VFAs 高于1 000 mg/L，厭氧發(fā)酵體系受到中度抑制[28]。

由圖2 可知，添加高嶺土的煤樣，其生物產(chǎn)氣體系中，VFAs 水平皆在10 mg/L 以下，對厭氧發(fā)酵體系均不產(chǎn)生抑制。這也說明在50 d 的發(fā)酵周期中，有機(jī)物的發(fā)酵都比較徹底，沒有過多的VFAs 殘留。隨著體系中高嶺土添加量的增加，丙酸濃度呈先增大后減小趨勢，而乙酸和VFAs 的變化也存在2 個變化區(qū)間，在0～1.0%和2.0%～8.0%添加量內(nèi)均呈現(xiàn)先減后增趨勢，在0.5%和4%時乙酸和VFAs 含量最低。這可能是由于較低量的高嶺土能夠吸附反應(yīng)體系中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)，從而減輕其對產(chǎn)氣功能菌群的毒害作用，促進(jìn)了酸的生成，而較高含量的高嶺土能夠作為酸堿緩沖劑，改善酸環(huán)境，抑制酸的產(chǎn)生。除了8.0%的實(shí)驗(yàn)組乙酸濃度高于對照組外，其余均比對照組低，說明高嶺土的添加提高了乙酸的利用率，高嶺土添加量增加到8.0%后，產(chǎn)氣結(jié)束時培養(yǎng)液中殘留的乙酸含量較高，這可能是由于產(chǎn)氣結(jié)束時培養(yǎng)瓶內(nèi)累積了大量甲烷，而甲烷會抑制產(chǎn)甲烷反應(yīng)過程，故而造成乙酸量累積。在高嶺土添加量為0.5%和4.0%時乙酸濃度均較小，這可能與2 組發(fā)酵液中產(chǎn)乙酸菌的豐度有關(guān)。

圖2 高嶺土添加量對VFAs 質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of kaolin addition on VFAs content

根據(jù)圖2 可知，高嶺土質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)酵液中VFAs 含量最高，說明煤被生物利用產(chǎn)甲烷的程度也最高，因此，推測此時最有利于煤被微生物降解。結(jié)合圖1a 結(jié)果來看，該添加量條件下第36 天之后，產(chǎn)甲烷含量快速上升，第50 天時與8.0%和0.5% 添加量下產(chǎn)甲烷接近。但是，其累積產(chǎn)甲烷量(圖1b)較低，可能原因有兩點(diǎn)：其一，本研究中僅分析了反應(yīng)50 d 體系中VFAs 的含量，而對整個動態(tài)過程并沒有進(jìn)行分析，所以僅能表明在該產(chǎn)氣周期內(nèi)，2.0%添加量中VFAs 量最高，但是VFAs 被其他微生物利用產(chǎn)氣存在一定滯后性；其二，生物產(chǎn)氣是微生物協(xié)同作用的過程，高嶺土對體系中的微生物存在不同程度的影響，在2.0%的添加量體系中產(chǎn)VFAs 的微生物可能較活躍。

2.3 輔酶F420 質(zhì)量濃度

輔酶F420是產(chǎn)甲烷菌特有的物質(zhì)，主要是作為低電位電子轉(zhuǎn)移載體，在甲烷形成過程中起著重要作用，輔酶F420含量作為評價(jià)厭氧消化器中產(chǎn)甲烷菌的活力指標(biāo)[29]。由圖3 可以看出，輔酶F420含量在添加不同高嶺土實(shí)驗(yàn)組之間波動不大，但整體均高于對照組，并且其波動也可分為0～1.0%與2.0%～8.0%2 個區(qū)間，在添加量區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)先增后減趨勢。結(jié)合VFAs 變化趨勢也可發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)420活性高時，體系中乙酸和VFAs 濃度較低，這說明高嶺土影響發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌的活性，體系中乙酸和VFAs 的消耗是產(chǎn)甲烷菌消耗所致。另外，高嶺土中含有的微量元素等物質(zhì)是產(chǎn)甲烷過程中各種反應(yīng)所需要酶的重要組成部分，能夠抑制同型產(chǎn)乙酸菌的活性，刺激產(chǎn)甲烷菌的生長，使產(chǎn)甲烷菌在混合菌體中有較高的競爭優(yōu)勢。在高嶺土添加量為4.0%時其輔酶F420活性最高，達(dá)到48.93 ng/L，較對照組提高15.43%，表明在2.0%～8.0%添加區(qū)間內(nèi)，4.0%為高嶺土的最適宜添加量。

圖3 輔酶F420 質(zhì)量濃度隨高嶺土添加量的變化Fig.3 Changes in the concentration of Coenzyme F420 with the content of added minerals

2.4 有機(jī)官能團(tuán)

煤的大分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，包括芳香族和脂肪族碳?xì)浠衔镆约暗⒘蚝脱醯碾s環(huán)化合物，煤結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性嚴(yán)重影響微生物的直接作用效率，影響生物煤層氣的產(chǎn)率[30]。研究表明，煤與甲烷的生物轉(zhuǎn)化在很大程度上依賴于煤中有機(jī)組分的生物有效性[31]。

本文利用紅外光譜(FT-IR)技術(shù)對煤及產(chǎn)氣后殘煤的官能團(tuán)進(jìn)行分析。圖4 中為3 種高嶺土添加量與原煤的FT-IR 譜圖對比。選取這幾種進(jìn)行測試是考慮到其之間梯度較大，理論上其變化會更明顯。整體而言，3 個添加量實(shí)驗(yàn)組之間，紅外光譜的出峰位置并沒有明顯區(qū)別，說明不同高嶺土添加量的產(chǎn)氣體系中，煤被微生物利用過程中官能團(tuán)的變化大體相同。對比原煤和產(chǎn)氣后殘煤的紅外吸收光譜，可以看出，實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氣后殘煤在波長3 420 cm-1處均未出峰，而在原煤的相同位置確有一寬峰。根據(jù)煤樣的紅外特征吸收峰[32]，3 420 cm-1附近對應(yīng)醇、酚-OH 及-NH-和-NH2的伸縮振動，說明產(chǎn)氣過程中煤相應(yīng)的官能團(tuán)被微生物利用。此外，G-4 的殘煤在1 900 cm-1處未出峰，而原煤和其他組在1 900 cm-1處均有峰，1 900 cm-1附近對應(yīng)C=O 伸縮振動，說明高嶺土添加量為2.0%時煤中C=O 更易被微生物利用。產(chǎn)氣前后代表礦物質(zhì)(如Si-O-Si、Si-O-Al 等)的吸收峰(1 014、1 018、1 041 cm-1)均未減少，說明產(chǎn)氣過程中礦物并未直接參與反應(yīng)過程。以上分析也表明，煤中的小分子結(jié)構(gòu)易于被產(chǎn)甲烷微生物利用，而大分子芳環(huán)則難以被降解。

圖4 不同高嶺土添加量樣品產(chǎn)氣后紅外光譜吸收峰對比Fig.4 Comparison of infrared spectrum absorption peaks between samples with different concentration of kaolin

2.5 微生物群落組成的變化

1)多樣性指數(shù)

產(chǎn)氣結(jié)束后，7 組樣品高通量測序結(jié)果共得到309 071條細(xì)菌和328 252 條古菌16S rRNA 基因序列。細(xì)菌和古菌的序列平均長度分別是416.87 bp 和429.75 bp。表2 列出了7 組樣品的Alpha 多樣性指數(shù)，從表中可以看出，對于添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組而言，前3 組(G-1、G-2和G-3) 的細(xì)菌豐度實(shí)際觀測值、Chao 指數(shù)和Ace指數(shù)均最高，說明前3 組產(chǎn)氣體系中細(xì)菌的豐度較高，由此可以看出當(dāng)培養(yǎng)基中不添加或者添加較少(0.5%，1.0%)的高嶺土?xí)r，產(chǎn)氣體系中細(xì)菌的種類較為豐富。G-3 的古菌豐度實(shí)際觀測值和Chao 指數(shù)均最高，表明產(chǎn)氣體系中古菌的種類最豐富。同時，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)說明G-4 細(xì)菌和G-3 古菌多樣性最高。此外，全部樣品的覆蓋度指數(shù)范圍在0.998 以上，表明各樣品中微生物序列均被測出，可以代表樣品中微生物的種群結(jié)構(gòu)。

表2 高嶺土實(shí)驗(yàn)組的Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of kaolin test group

根據(jù)測序結(jié)果顯示，細(xì)菌共有291 個OTU(Operational Taxonomic Unit)，可以分為18 個門、145 個屬。圖5 為空白組與添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌在門水平和屬水平的群落分布柱狀圖。

圖5 添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Bacteria community histogram of the kaolin test group

2) 細(xì)菌群落組成

由圖5a 可知，在門水平以Firmicutes(厚壁菌門)最為豐富(41.25%～56.94%)，其次分別是Desulfobacterota(脫硫菌門)(14.31%～27.22%)、Bacteroidota(擬桿菌門)(6.13%～16.66%)、Spirochaetota(螺旋菌門)(4.12%～9.99%)、Synergistota(3.99%～9.09%)、Campilobacterota(彎曲菌門)(1.33%～7.49%)、Caldisericota(0.34%～2.13%)等。從結(jié)果來看，高嶺土添加量在0～1.0%和2.0%～8.0%時，F(xiàn)irmicutes 的豐度先增后減，該菌門中微生物主要參與一些混合酸、醇和中性物質(zhì)的生成，可見高嶺土添加量為0.5% 和4.0% 時對提高煤中有機(jī)質(zhì)降解有促進(jìn)作用。Bacteroidota 是一類化能自養(yǎng)型微生物，它們能參與苯酚等有機(jī)物的降解產(chǎn)生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等過程[33]。

從圖5 可以看出，2.0%高嶺土添加量，第50 天時該菌門豐度最高，該結(jié)果與VFAs 的變化較為一致，可見該添加量體系對擬桿菌門的活性有促進(jìn)作用，使得VFAs 含量上升。Desulfobacterota 中大多為硫酸鹽還原菌，利用有機(jī)質(zhì)同時可將硫酸鹽還原為H2S[34]，大多數(shù)添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組中，該菌門豐度均高于對照組，說明高嶺土添加可以提高脫硫菌門豐度。

從屬水平來看(圖5b)，群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律并不明顯。由圖中可以發(fā)現(xiàn)，Paraclostridium(梭菌屬)是細(xì)菌中豐度最高的菌屬(13.69%～30.47%)，接下來豐度較高的菌屬依次為Desulforhabdus(桿狀脫硫菌屬)(4.90%～10.62%)、JGI-0000079-D21(3.99%～9.09%)、norank fSpirochaetaceae(未分類螺旋體屬)(3.96%～9.51%)、Clostridium sensu stricto13(狹義梭菌屬13)(5.38%～8.79%)、Geobacter(地桿菌屬)(2.62%～8.76%)、Proteiniphilum(嗜蛋白菌屬)(3.36%～11.28%)、Desulfovibrio(脫硫弧菌屬)(4.53%～6.72%)、Desulfitobacterium(脫硫桿菌屬)(0.24%～6.71%)、Desulfurella(硫還原菌屬)(1.34%～7.49%)等。Paraclostridium在一些淀粉、纖維質(zhì)、幾丁質(zhì)等的解聚、混合酸、醇和中性物質(zhì)的生成中起著重要作用[35]，添加少量高嶺土(0.5% 和1.0%) 可以提高該屬微生物豐度，結(jié)合VFAs 數(shù)據(jù)來看，它們之間沒有明顯的關(guān)聯(lián)，梭菌屬在該體系中參與生成的可能是其他有機(jī)化合物。Geobacter(地桿菌屬)是在厭氧環(huán)境中以膜結(jié)合蛋白和導(dǎo)電Ⅳ型菌毛來進(jìn)行直接胞外電子傳遞的代表性微生物[36]，從結(jié)果來看，添加高嶺土的實(shí)驗(yàn)組中該菌屬豐度大部分高于對照組，尤其是在1.0%和4.0%添加組中豐度最高。由于高嶺土本身不導(dǎo)電，所以推測其豐度變化與煤中少量的半導(dǎo)體礦物含量變化有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。Clostridium是厭氧芽孢桿菌屬，在惡劣環(huán)境下能產(chǎn)芽孢，代謝有機(jī)物產(chǎn)生小分子酸或醇等，屬于產(chǎn)酸菌[37]，該菌屬在所有添加高嶺土的實(shí)驗(yàn)組中豐度較為接近，說明這類細(xì)菌豐度受高嶺土影響不大。

整體上來看，盡管高嶺土添加對細(xì)菌種群豐度影響變化不明顯，但是某些門和屬的微生物在產(chǎn)氣第50天后其豐度發(fā)生了變化，并且不同種屬豐度變化呈現(xiàn)明顯差異性，這也進(jìn)一步證實(shí)了高嶺土對不同微生物的影響不同，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

3) 古菌群落組成

7 組樣品中測序得到的古菌共有117 個OTU，可以分為6 個門、19 個屬。圖6 為高嶺土實(shí)驗(yàn)組古菌在門水平和屬水平的群落分布?？梢钥闯?，在門水平(圖6a)，Euryarchaeota(廣古菌門)占比最大(57.89%～91.55%)，其次分別是Halobacterota(海拉古菌門)(3.29%～31.75%)、Thermoplasmatota(熱原體門)(3.36%～11.61%) 以及Crenarchaeota(泉古菌門)(0～1.65%)。整體上來看，其菌門豐度變化趨勢也可分為0～1.0%和2.0%～8.0%2 個區(qū)間，在2 個區(qū)間內(nèi)Euryarchaeota 呈先升后降趨勢，添加高嶺土量為0.5%和4.0%時Euryarchaeota 豐度最高，對應(yīng)的累積產(chǎn)甲烷量和F420含量也高于對照組，說明在這兩種添加量的體系中，細(xì)菌和古菌具有較好的協(xié)同性，能促進(jìn)甲烷生成。而Halobacterota 在高嶺土添加量為1.0%時豐度雖然最高，但該體系中甲烷產(chǎn)量和F420量在所有實(shí)驗(yàn)組中最低，可見該菌門在體系中貢獻(xiàn)不大。

圖6 添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組古菌的群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Archaeal community histogram of the kaolin test group at the phylum level and the genus level

從屬水平上(圖6b)，廣古菌門Methanosarcina(甲烷八疊球菌屬)數(shù)量占比最為豐富(56.46%～91.06%)，其余依次為廣古菌門Methanobacterium(甲烷桿菌屬)(3.29%～31.75%)、Methanomassiliicoccus(第七產(chǎn)甲烷古菌目)(3.33%～11.61%)、廣古菌門的Methanoregula(甲烷微菌屬)(0.19%～2.47%) 及Nitrosarchaeum(0～1.37%) 等。添加0～1.0%和2.0%～8.0%高嶺土實(shí)驗(yàn)組，古菌Euryarchaeota 和Methanosarcina豐度變化趨勢和F420含量變化一致，但和VFAs 變化趨勢正好相反，其中0.5%和4.0%添加量時的菌豐度和F420含量均為最高，而乙酸和VFAs 含量卻最低。從屬水平上來看，Methanobacterium變化趨勢與Methanosarcina正好相反，隨著高嶺土添加量的增加呈先降后升趨勢，其中0.5%和4.0%時其相對含量最低。Methanosarcina和Methanobacterium是較常見的產(chǎn)甲烷菌，其中Methanosarcina是混合營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，既可以利用氫氣產(chǎn)甲烷，也可以利用乙酸產(chǎn)甲烷，Methanobacterium為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，可利用H2/CO2產(chǎn)生甲烷。

有研究表明石灰石能夠顯著提高細(xì)菌數(shù)量，利于微生物的降解作用[38]，本實(shí)驗(yàn)的微生物多樣性結(jié)果也表明，添加適量高嶺土能提高細(xì)菌和古菌的豐度；從群落結(jié)構(gòu)上也可以發(fā)現(xiàn)，高嶺土的添加增加了對產(chǎn)甲烷起作用的微生物豐度。有理由推測是高嶺土對煤降解過程中微生物的活性和豐度產(chǎn)生促進(jìn)作用，由VFAs結(jié)果可以分析，高嶺土影響了產(chǎn)酸微生物的活性，從而影響甲烷的生成。結(jié)合乙酸、VFAs 和F420變化趨勢來看，兩者在消耗體系中酸與氫氣產(chǎn)甲烷時相互抑制。0.5%和4.0%添加量將有利于提高M(jìn)ethanosarcina活性，提升甲烷含量。

3 結(jié) 論

a.高嶺土添加量為0～8.0%體系可以明顯分為2個區(qū)間，在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加量(0～1.0%)和相對較高添加量(2.0%～8.0%) 區(qū)間內(nèi)，甲烷產(chǎn)量、累積甲烷量和F420均呈先增后減的變化趨勢；0.5%和4.0%添加量時相應(yīng)值均最高，而在添加量范圍內(nèi)，乙酸、VFAs 的變化趨勢正好相反，呈先減后增趨勢。高嶺土添加量較低時(0～1.0%)反應(yīng)第50 天后累積產(chǎn)甲烷量和F420最高分別達(dá)216 μmol/g 煤和48.93 ng/L，較空白組提高55.4%和15.43%。高嶺土添加有利于煤中醇和酚-OH，-NH-和-NH2被微生物利用，當(dāng)高嶺土添加量為2.0%時煤中C＝O 更易被微生物利用。

b.高嶺土添加對細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)影響不明顯，而對古菌影響呈現(xiàn)規(guī)律性變化。在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加量(0～1.0%) 和相對較高添加量(2.0%～8.0%) 區(qū)間內(nèi)Firmicutes、Euryarchaeota 和Methanosarcina和產(chǎn)甲烷量、F420變化趨勢一致，而Methanobacterium和乙酸和VFAs 變化一致。這說明Firmicutes 和Euryarchaeota 在體系中具有較好的協(xié)同性，能促進(jìn)甲烷生成，而Methanosarcina和Methanobacterium在產(chǎn)甲烷時存在相互抑制作用。

c.煤的生物產(chǎn)氣體系中微生物種類眾多，代謝過程復(fù)雜，高嶺土是煤中分布較多的代表性礦物，礦物的添加會影響生物產(chǎn)氣過程。由于本研究中沒有對整個產(chǎn)氣過程中相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控，且所用微生物為混合菌群，而高嶺土對不同微生物生長代謝的影響存在差異，所以目前的結(jié)果還難深入闡明其對不同微生物的具體影響機(jī)理。但本研究成果對后階段開展煤中無機(jī)礦物組分對生物產(chǎn)氣的影響提供了新的思路和參考依據(jù)。