SIRT1 基因多態(tài)性與BMI 及酒精性肝病相關(guān)性的研究

侯葉廷，牛海靜，安彩艷，史麗芳，格日勒，武艷芳

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）由于高發(fā)病率、高死亡率，成為全世界備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，我國(guó)ALD 的發(fā)生率逐年上升，嚴(yán)重危害人民健康。研究ALD 的發(fā)病機(jī)制，有利于ALD 的防治。飲酒量、飲酒頻率、飲酒種類等影響因素相同的條件下，不同個(gè)體對(duì)酒精性肝病的易感性不同，很大程度取決于遺傳易感性，因此，酒精性肝病基因多態(tài)性相關(guān)研究成為熱點(diǎn)。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）廣泛參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞壽命的多條信號(hào)通路以及糖、脂代謝、胰島素分泌等多條代謝通路的調(diào)控，具有調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡，保持機(jī)體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)功能。一些動(dòng)物研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：通過調(diào)節(jié)SIRT1 及SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路，顯著改善酒精性肝損傷的程度［1-5］。因此，通過調(diào)節(jié)、干預(yù)SIRT1 及SIRT1 相關(guān)代謝途徑可以緩解酒精性肝病的程度，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。本研究以酒精性脂肪肝病為研究對(duì)象，與非酒精性脂肪肝、飲酒對(duì)照組、健康對(duì)照組對(duì)照研究，研究SIRT1基因多態(tài)性與BMI 及酒精性肝病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 倫理聲明 本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵照赫爾辛基宣言［6］，所有受試者簽署知情同意書。

1.1.2 研究對(duì)象 研究對(duì)象分成四組：（1）酒精性脂肪肝組（AFLD，n=176），日飲酒量折合酒精量大于40 g，飲酒年限大于5 年，脂肪肝的超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)符合歐洲肝病學(xué)會(huì)［8］和美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)［9］；（2）非酒精性脂肪肝病組（NAFLD，n=117），無(wú)飲酒史，超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)符合歐洲肝病學(xué)會(huì)［8］和美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)［9］；（3）飲酒對(duì)照組（n=92），日飲酒量大于40 g，飲酒年限大于5 年，無(wú)脂肪肝的證據(jù)；（4）健康對(duì)照組（n=120），無(wú)飲酒史，無(wú)脂肪肝證據(jù)，相關(guān)化驗(yàn)檢查正常。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 本研究所有受試對(duì)象無(wú)肝細(xì)胞癌，有以下任何一項(xiàng)者，將從本研究中排除：（1）有乙肝表面抗原陽(yáng)性，丙肝抗體陽(yáng)性，艾滋病抗體陽(yáng)性；（2）糖尿病患者；（3）其它原因?qū)е碌母尾。ǜ味範(fàn)詈俗冃?，自身免疫性肝病，藥物誘發(fā)的肝病等）；（4）漢族以外的民族；（5）不愿意參與本研究的。

1.1.4 一般資料收集 符合入選標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象，詳細(xì)詢問病史，包括飲酒史、飲酒年限，既往病史等，收集性別、年齡、身高、體重，測(cè)定肝功能、血糖、血脂，填寫基礎(chǔ)數(shù)據(jù)表（表1）。

1.1.5 標(biāo)本采集 受試對(duì)象空腹一夜后，抽取2 mL 外周靜脈血，血液標(biāo)本EDTA 抗凝處理，3000 r/min 離心10 min，用DNA 工具包從外周血中提取全基因組，DNA 濃度檢測(cè)儀用于確定DNA 的純度，DNA 保存在-80 ℃冰 箱 中。 注：DNA 工 具 包（Takara Company，Japan）DNA concentration detector（NANODROP2000，Thermo）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因類型檢查 根據(jù)人類基因組計(jì)劃1000 提供的數(shù)據(jù)，用Haploview 軟件選擇四組SIRT1核苷酸片段，分別命名為：rs33957861、rs11599176、rs12413112、rs35689145?；蝾愋蜋z測(cè)應(yīng)用西格諾質(zhì)譜分析平臺(tái)（Sequenom，Son Diego，CA），PCR 引物用質(zhì)譜分析軟件3.1 設(shè)計(jì)，PCR 多通道反應(yīng)系統(tǒng)包括2 μL DNA樣本（2.5 ng/μL），水2.18 μL，反應(yīng)緩沖液0.5 μL ，MgCl2（25 mmol/L）0.5 μL，dNTP 混合物（10 mmol/L）0.1 μL，引物混合物（1 μmol/L）0.5 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：95 ℃15 min，然后95 ℃20 s，5 個(gè)循環(huán)；65 ℃30 s，72 ℃1 min，然后95 ℃20 s，5 個(gè)循環(huán)；58 ℃30 s，72 ℃1 min，以72 ℃30 min 結(jié)束。堿性磷酸酶活性和iPLEX 擴(kuò)增反應(yīng)過程依據(jù)廠家說(shuō)明書進(jìn)行。每次吸取15~25 μL 標(biāo)本置于光譜分析儀，利用西格諾質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，下一步用Mass Array Typer 3.4 軟件，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物確定基因類型。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用-X±S表示，方差分析統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)和率表示，χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，OR 值和95% 的可信區(qū)間分析采用非條件回歸分析，基因多態(tài)性、體重和疾病的關(guān)系用多元回歸分析，基因的單倍型用SHEsis 分析，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果分析

2.1 研究對(duì)象的一般臨床特征

如表1 顯示，各組間的年齡、性別、隨機(jī)血糖比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與健康和飲酒對(duì)照組相比，NAFLD 組的體重指數(shù)（BMI），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），堿性磷酸酶（ALP），膽固醇（Cholesterol），AFLD 組的BMI，ALT，AST，ALP，膽紅素（Bilirubin），Cholesterol 顯著升高（P<0.05）。而且，與健康對(duì)照組相比，酒精對(duì)照組的BMI 顯著增加（P<0.05）。另外，與NAFLD 組相比，AFLD 組，Cholesterol，ALT，AST 顯著升高（P<0.05）。兩組間，其它臨床指標(biāo)沒有明顯差異（P>0.05）。與其它三組比較，AFLD 組，膽紅素顯著升高（P<0.05）。

表1 研究對(duì)象的一般臨床指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of the general characteristics of the study subjects in different groups

2.2 SIRT1 基因四組核苷酸與酒精性脂肪肝發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

非條件回歸分析和FDR 矯正（表2）顯示，與健康對(duì)照組和飲酒對(duì)照組，攜帶rs33957861 C>T，rs11599176 A>G，rs12413112 A>G 的個(gè)體，AFLD 和NAFLD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯降低，而攜帶rs35689145的個(gè)體，AFLD 和NAFLD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上升（均為P<0.05）。另外，與CC 和AA 基因型比較，rs33957861 C>T 的CT+TT，rs11599176 A>G 的AG+GG，rs12413112 A>G 的AG+GG 降低AFLD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，然而，與CC 基因型比較，rs35689145 A>G 基因型AG+GG 明顯增加AFLD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在NAFLD和AFLD 及健康對(duì)照組、飲酒對(duì)照組四組中，四組核苷酸的基因頻率無(wú)明顯差異（均為P>0.05）。另外，如表3 所示，用在線的SHEsis 軟件行單倍體分析顯示單倍體AAAA，CAGA 和CGAA 能明顯降低酒精性脂肪肝的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；相反，CAAG 增加AFLD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（均為P<0.05）。

表2 SIRT1 基因四組核苷酸和NAFLD 及AFLD 的相關(guān)性Tab.2 Correlation analysis of four SNPs of within the SIRT1 gene and the risk of NAFLD and AFLD

表3 SIRT1 基因四組核苷酸單倍型與AFLD 的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of haplotype of four SNPs within the SIRT1 gene with AFLD

2.3 SIRT1 基因四組核苷酸和各組BMI 的關(guān)系

就NAFLD 和AFLD 組而言，與CT+TT 基因型比較，攜帶rs33957861 CC 基因型的個(gè)體BMI 較高（圖1）。另外，與AG+GG 基因型比較，rs11599176，rs12413112 的AA 基因型攜帶者BMI 較高。然而，與AG+GG 基因型比較，rs35689145 的AA 基因型有較低的BMI（均P<0.05）。在飲酒對(duì)照組，與rs33957861的CC 基因型，rs11599176 的AA 基因型比較，CT+TT 和AG+GG 基因型BMI 較低（均為P<0.05）。而且，在健康對(duì)照組，與rs11599176，rs12413112，rs35689145 的AG+GG 基因型比較，rs11599176，rs12413112的AA 基因型有更高的BMI，然而，攜帶rs35689145 AA 基因型的有較低的BMI（均為P<0.05）。而且，多重回歸分析顯示，rs33957861 C>T，rs11599176 A>G 和BMI 是AFLD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表4）。

圖1 SIRT1 基因四組核苷酸和各組BMI 的關(guān)系Fig.1 Association of four SNPs within the SIRT1 gene and BMI in subjects from different groups

表4 將健康對(duì)照組作為參照組進(jìn)行多元多級(jí)回歸分析Tab.4 Multivariate polychotomous logistic regression by taking healthy control as a referent group

3 討論

SIRT1 是介導(dǎo)多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要作用。人類SIRT1基因定位于染色體10q22.1，基因長(zhǎng)度為33 000 bp，編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為120 000，由1 500 個(gè)氨基酸殘基組成，包含9 個(gè)外顯子和8 個(gè)內(nèi)含子。本研究選擇的SIRT1基因的四組核苷酸rs33957861，rs11599176，rs12413112，rs35689145 均位于內(nèi)含子。

乙醇對(duì)多種調(diào)節(jié)因子的作用，全部或部分通過抑制中樞信號(hào)分子SIRT1 來(lái)介導(dǎo)的，SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路參與AFLD 的發(fā)生，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全明確，基因水平的研究可能揭示SIRT1 參與AFLD 的發(fā)病機(jī)制。既往研究顯示：SIRT1 激動(dòng)劑白蘆藜醇可明顯減輕脂質(zhì)相關(guān)代謝性肝損傷［10］，另一項(xiàng)研究［11］顯示：丹酚酸B 可明顯增加SIRT1 的表達(dá)，減少C 反應(yīng)蛋白（CRP）等相關(guān)炎癥介質(zhì)水平，減輕大鼠模型的酒精性肝損傷，最近的一項(xiàng)研究［12］發(fā)現(xiàn)：敲除小腸SIRT1 對(duì)乙醇誘導(dǎo)的小鼠炎癥和肝損傷具有保護(hù)作用，提示腸道SIRT1 缺乏對(duì)乙醇相關(guān)肝損傷的保護(hù)作用。肝臟的SIRT1 對(duì)于酒精性肝損害具有保護(hù)作用，而腸道SIRT1作用相反，提示SIRT1 的調(diào)節(jié)機(jī)制具有組織特異性，具體調(diào)節(jié)機(jī)制如何，下調(diào)或上調(diào)是如何實(shí)現(xiàn)的呢？本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因四組核苷酸與酒精性脂肪肝病的敏感性相關(guān)，不同個(gè)體對(duì)AFLD 的敏感性不同，可能與攜帶的核苷酸類型有關(guān)，SIRT1 對(duì)于酒精性肝損害的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，不是所有的SIRT1核苷酸對(duì)于酒精性肝損害具有保護(hù)作用，部分核苷酸會(huì)升高ALD 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，所以單純調(diào)高SIRT1 的水平，不一定會(huì)減輕酒精性肝損害，一些對(duì)于酒精性肝損傷具有保護(hù)作用的SIRT1 激動(dòng)劑，可能是激活了部分有益的核苷酸，抑制了有害的核苷酸，不同組織中的SIRT1 對(duì)于酒精性肝損害的作用不同，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，而且本研究?jī)H僅涉及內(nèi)含子的四條核苷酸，其它與AFLD 相關(guān)的核苷酸有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)及研究。

眾所周知，體重指數(shù)高的個(gè)體通常有過多的脂肪沉積，尤其在肝臟。除了提供能量供應(yīng)，肝臟中的脂肪酸合成中性脂肪，但過多的中性脂肪超過載脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，最終導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生［13-14］。最重要的是脂肪肝患者通常有明顯高的體重指數(shù)，但是，隨著體重指數(shù)的下降，肝臟的脂肪沉積下降，脂肪肝可以緩解，以上說(shuō)明：脂肪肝的發(fā)展隨著體重指數(shù)的增加而發(fā)展［15］。而且，以前的臨床研究證實(shí)了SIRT1基因多態(tài)性和體重指數(shù)的密切關(guān)系。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因（rs10509291 和rs10823116）中，820 例非糖尿病個(gè)體中，一般等位基因的變異與升高的體重指數(shù)（>23 kg/m2）相關(guān)［16］。另外，Zillikens 等［17］發(fā)現(xiàn)：在兩個(gè)獨(dú)立的群體中，SIRT1基因的rs7895833 和rs1467568 最小等位基因與較低的體重指數(shù)是相關(guān)的。意大利的一項(xiàng)研究［18］發(fā)現(xiàn)：對(duì)21 例神經(jīng)性厭食癥患者，26 例正常體重和75 例肥胖患者進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)厭食癥患者SIRT1 顯著高于正常體重和肥胖患者（分別為（3.27±2.98）、（2.27±1.13）和（1.36±1.31）ng/mL）。根據(jù)年齡和性別調(diào)整的每個(gè)預(yù)測(cè)變量的線性回歸模型表明，SIRT1 濃度與BMI 呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究顯示體重指數(shù)和SIRT1基因多態(tài)性在酒精性脂肪肝病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中扮演著重要的角色，這與以前大量的研究一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝病和酒精性脂肪肝病個(gè)體中，攜帶SIRT1基因rs33957861，rs11599176 ，rs12413112 突變基因型體重指數(shù)較低，然而，攜帶rs35689145 突變型者體重指數(shù)較高。通過logistic 回歸分析，rs33957861 C>T，rs11599176 A>G 和體重指數(shù)是酒精性脂肪肝的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與本研究相似，Clark 等［19］證實(shí)這四組核苷酸和體重指數(shù)有密切的聯(lián)系。一項(xiàng)來(lái)自日本的研究［20］發(fā)現(xiàn)，在無(wú)卡路里限制（CR）組中，具有rs1467568 G 等位基因的女性比沒有的BMI 更高（P＝0.02），此外，具有rs7895833 A或rs1467568 G 等位基因的婦女，與沒有這些等位基因的婦女，從20 歲開始體重增加更加明顯（rs7895833為P=0.03，rs1467568 為P=0.003）。因此認(rèn)為攜帶SIRT1基因的單核苷酸rs33957861，rs11599176 ，rs12413112 個(gè)體有較低的發(fā)生酒精性脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)，而攜帶rs35689145 個(gè)體有較高的發(fā)生AFLD 的風(fēng)險(xiǎn)。另外，在非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝個(gè)體間，不同組間沒有明顯的差異。本研究結(jié)果顯示，在非酒精性脂肪肝和酒精性脂肪肝個(gè)體中體重指數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SIRT1基因多態(tài)性可能通過體重指數(shù)誘發(fā)脂肪肝的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)具有單倍體AAAA，CAGA 和CGAA 的個(gè)體發(fā)生AFLD 的概率較低，然而，CAAG 發(fā)生AFLD 的風(fēng)險(xiǎn)較高，以上的研究進(jìn)一步揭示SIRT1基因多態(tài)性與患者對(duì)AFLD 的易感性密切相關(guān)。慢性大量酒精喂養(yǎng)的大鼠模型試驗(yàn)顯示：肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1基因的過度表達(dá)可能激活SIRT1 的活性，作為對(duì)過度酒精暴露的反應(yīng)，阻止脂肪的過度沉積［21］。而且，大量證據(jù)證明，SIRT1 處于抑制狀態(tài)下，過量的酒精暴露會(huì)導(dǎo)致酒精性脂肪肝的發(fā)生，肝內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子［22］，主要是通過破壞肝細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及協(xié)同調(diào)節(jié)的變化。

由本研究可知，四組核苷酸與酒精性脂肪肝的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和體重指數(shù)之間的關(guān)系是密切相關(guān)的。不同個(gè)體對(duì)AFLD 的敏感性不同，與攜帶的核苷酸不同可能有關(guān)。但這僅僅是內(nèi)含子的四條核苷酸，其它與AFLD 相關(guān)的核苷酸有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和研究。減肥和干擾核苷酸代謝有利于AFLD 的預(yù)防、治療。