寒區(qū)菌糠堆肥過程中微生物多樣性與演替規(guī)律

趙鐸，霍朝晨，徐智永，張方政，鞏光祿，歐陽曉倫，劉嘉樂，郭鵬博，王偉東

（1.黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室/黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心；3.山東省濰坊市諸城市枳溝鎮(zhèn)財政社保服務(wù)中心）

20 世紀(jì)以來，中國的食用菌產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大，據(jù)統(tǒng)計我國2018 年食用菌年產(chǎn)量超過4 000 萬t，廢棄菌糠的年產(chǎn)生量超過1 億t[1-2]。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)村社會事業(yè)發(fā)展中心數(shù)據(jù)顯示，食用菌栽培業(yè)已成為農(nóng)民增收和脫貧致富的重要途徑。菌糠是食用菌栽培過程中產(chǎn)生的廢棄栽培基質(zhì)，主要由鋸木屑、秸稈、玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄物組成[3]，在自然環(huán)境中的降解往往需要多種微生物共同作用。食用菌栽培后的菌糠中存在大量糖類、維生素、微量元素及其它次生代謝產(chǎn)物等[4]，因而具有循環(huán)利用價值。有研究報道，施用菌糠生產(chǎn)的肥料能夠大幅度提高土壤理化參數(shù)、微生物豐度、土壤養(yǎng)分和酶活，進(jìn)而增加農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量[5-7]。因此，實現(xiàn)廢棄菌糠資源化再利用對農(nóng)業(yè)廢棄物消納、發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)、循環(huán)農(nóng)業(yè)等具有重要意義。

目前，好氧堆肥能利用微生物的代謝作用將廢棄菌糠轉(zhuǎn)化為肥料，既能創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益，又符合廢棄物綜合治理原則，是實現(xiàn)廢棄菌糠循環(huán)利用的有效方式[8-9]。王秀紅等[10]研究表明，堆肥各時期優(yōu)勢微生物菌群多樣性差異顯著。蔡涵冰等[11]發(fā)現(xiàn)，在堆肥升溫期，芽孢桿菌屬、梭菌屬、假單胞菌屬、曲霉屬等參與纖維素降解和抑制植物病原菌生長密切相關(guān)的菌群占據(jù)優(yōu)勢[12-15]。Nakasaki 等[16]發(fā)現(xiàn)，隨著堆肥過程進(jìn)行，芽孢桿菌屬、熱子囊菌屬等嗜熱微生物在堆肥高溫期豐度較高，堆肥微生物菌群的多樣性顯著提升。因此，探究堆肥過程中微生物多樣性及其演替規(guī)律對于加速堆肥進(jìn)程、提升堆肥品質(zhì)具有重要意義。以往對于堆肥環(huán)境中微生物多樣性研究多集中在農(nóng)業(yè)廢棄物、餐廚垃圾、養(yǎng)殖業(yè)糞便堆肥等方面[17-18]，而對寒區(qū)環(huán)境下菌糠堆肥環(huán)境中微生物多樣性及演替規(guī)律研究較少。為了探究寒區(qū)菌糠堆肥過程中微生物多樣性變化及其演替規(guī)律，研究采用高通量測序技術(shù)，檢測、并分析菌糠堆肥過程中微生物多樣性變化，為寒區(qū)廢棄菌糠堆肥的規(guī)?；瘧?yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐，為實現(xiàn)寒區(qū)廢棄菌糠的無害化和資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取黑木耳菌糠作為堆肥試驗材料，黑木耳菌糠取自黑龍江省伊春市新青區(qū)食用菌栽培基地。

1.2 試驗方法

廢棄菌糠經(jīng)脫袋、打碎、翻拌，調(diào)節(jié)含水率至60%。將菌糠堆砌成長1.9 m、下底寬1.5 m、上底寬1.2 m，高1.5 m 的長方體，體積為3.84 m3，菌糠堆肥試驗共持續(xù)49 d。在試驗當(dāng)天、2、7～49 d（每7 d 一次）取樣，取樣前進(jìn)行翻堆，充分混合物料。翻堆后采集堆肥樣品約300 g（上中下三層取樣，每層前后左右中五點），混合均勻后用于理化數(shù)據(jù)測定。根據(jù)堆體溫度變化情況，分別于0 d（試驗當(dāng)天）、7、35、49 d取樣，命名為S0、S7、S35、S49，用于菌糠堆肥微生物多樣性分析。

1.3 樣品指標(biāo)及測定方法

堆肥過程中，每天8：30～9：00、13：30～14：00 測量堆體溫度。稱取風(fēng)干樣約5.0 g，按10∶1 水樣比加入蒸餾水，震蕩15 min，靜置30 min，用pH 檢測計（日本Horiba 公司）測定pH[19]。有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀含量采用國標(biāo)法測定[19]。堆肥樣品與去離子水1∶10混勻，180 r·min-1振蕩浸提2.0 h，然后8 000 r·min-1離心20 min，浸提液用于種子發(fā)芽指數(shù)的測定[20]。

1.4 樣品DNA 的提取與測序

樣品DNA 提取采用氯苯法[21]，濃度和質(zhì)量采用超微量分光光度計（Thermo Nanodrop 2000c，America）測定。改良后的細(xì)菌和古菌16S rRNA gene 引物為515F Modified（5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′），806R Modified （5′ -GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）。真菌ITS1 區(qū)測序采用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。細(xì)菌和古菌擴(kuò)增反應(yīng)體系為（20 μL）：PCR supermix 10 μL，正向引物（10 μM）1 μL，反向引物（10 μM）1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL。細(xì)菌和古菌PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃最終延伸5 min，28 個循環(huán)；真菌擴(kuò)增反應(yīng)體系為（20 μL）：PCR supermix 10 μL，正向引物（10 μM）1 μL，反向引物（10 μM）1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 7 μL。真菌PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性60 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃最終延伸10 min，35 個循環(huán)。微生物多樣性測序和分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以上所有試驗均重復(fù)三次。數(shù)據(jù)處理與繪圖采用OriginPro 2017C（SR2 b9.4.2.380），方差分析采用SPSS 17.0（2008-8-23）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌糠堆肥過程中理化性質(zhì)變化

菌糠堆肥過程的溫度變化如圖1 所示，在堆肥升溫階段，微生物利用木耳菌糠中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝活動，堆體內(nèi)的有機物快速分解產(chǎn)生能量，短時間能量的堆積導(dǎo)致堆體溫度快速升高，在菌糠堆肥第7 d 時，堆體溫度68.3 ℃，為菌糠堆肥過程中堆體溫度的峰值，高溫期共持續(xù)27 d（大于50 ℃）。

圖1 菌糠堆肥過程中溫度的變化Fig.1 Changes of temperature during mushroom bran composting

如圖2 所示，堆肥過程中，pH 的變化趨勢為先降低，后升高最后趨于穩(wěn)定，在堆肥中后期變化幅度較小。在堆肥過程中，物料初始pH 為8.49，在堆肥前7 d 快速下降，最低值為8.29。隨著堆肥的進(jìn)行，pH穩(wěn)步上升，在堆肥末期pH 為8.49。

在試驗中，有機質(zhì)含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，在整個堆肥過程中，有機質(zhì)降解率為16.6%。如圖3 所示，堆肥原料的有機質(zhì)含量為81.9%，堆肥49 d 后下降至65.3%，其中在堆肥前7 d，有機質(zhì)降解率為9.8%。而在堆肥末期，有機質(zhì)降解速率較低，幾乎不再分解。

圖3 菌糠堆肥過程中有機質(zhì)含量的變化Fig.3 Changes of organic matter content during mushroom bran composting

菌糠堆肥過程中，全氮含量隨著堆肥試驗的進(jìn)行持續(xù)提高，與全磷、全鉀相比，出現(xiàn)明顯上升。但總體上看，其絕對含量仍然較低。全磷、全鉀和全氮由堆肥初始物料中的0.54%、0.3%和1.07%，分別上升至0.65%、0.34%和1.37%。經(jīng)過49 d 的好氧堆肥后，養(yǎng)分含量整體上有所提升。

種子發(fā)芽指數(shù)（GI）可以用來評價堆肥物料的腐熟程度，用物料對植物種子發(fā)芽情況的影響來表達(dá)物料的毒性作用[22]。當(dāng)GI＞50%，物料已經(jīng)基本腐熟，堆肥樣品對植物的毒性作用較低。當(dāng)GI＞80%，即可認(rèn)為物料完全腐熟，此時堆肥樣品對植物的毒性幾乎為零[23]。如圖5 所示，GI 在降溫期之前增長較快，在堆肥末期，GI 為85.5%。

圖5 菌糠堆肥過程中種子發(fā)芽指數(shù)的變化Fig.5 Changes of germination index during mushroom bran composting

圖4 菌糠堆肥過程中不同時期全磷、全鉀和全氮含量的變化Fig.4 Changes of total nitrogen，total phosphorus，total potassium content during mushroom bran composting

2.2 堆體微生物群落α 多樣性分析

表1 是菌糠堆肥過程不同時期的Alpha 指數(shù)，在整個堆肥過程中，Chao1 和ACE 指數(shù)整體上呈逐漸降低的趨勢，Chao1 指數(shù)從1 832.66 下降至1 697.00，ACE 從1 832.66 下降至1 697.60。Simpson 和Shannon 指數(shù)整體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在S0 樣品中各指數(shù)值均顯著高于其他時期（P<0.05）。表2 是菌糠堆肥過程中真菌的Alpha 多樣性指數(shù)，Chao1 和ACE 指數(shù)的趨勢為先下降后升高。Simpson 指數(shù)由0.82 上升至0.89，Shannon 指數(shù)由3.69 升高至4.42。其中，S0 樣品中的Chao1 和ACE 指數(shù)最高，S49 樣品的Simpson 和Shannon 指數(shù)最高。

表1 菌糠堆肥過程中細(xì)菌的Alpha 多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of bacteria in mushroom bran composting

表2 菌糠堆肥過程不同時期的真菌Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of fungi in different periods of mushroom bran composting

2.3 堆體微生物群落組成及差異分析

如圖7、8，表3、4 所示，是基于16S rRNA 基因高通量測序結(jié)果分析得出的門、屬水平上微生物的相對豐度變化。

變形菌門在S0 和S7 樣品中相對豐度較高，在S35 樣品中顯著下降至40.89%（P<0.05）。在菌糠堆肥過程中，擬桿菌門全程未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。放線菌門在S0 樣品中的相對豐度為4.84%，在S7 樣品中顯著提高，為26.98%（P<0.05）。在S7 樣品中，疣微菌門的相對豐度由S0 樣品中的的2.41%顯著下降至0.14%（P<0.05），隨后其相對豐度顯著提升（P<0.05），最終保持在2%左右。厚壁菌門的相對豐度沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。

圖6 菌糠堆肥過程中細(xì)菌群落門水平相對豐度Fig.6 The relative abundance of bacteria community at phylum level during mushroom bran composting

如表3，優(yōu)勢細(xì)菌屬的組成和相對豐度在不同堆肥時期顯著差異（P<0.05）。在S0 樣品中主要的優(yōu)勢微生物為鞘脂桿菌屬（11.22%）、黃桿菌屬（6.37%）等8 個菌屬。在S7 樣品中，鞘脂桿菌屬的相對豐度顯著提升至21.57%（P<0.05），Buttiauxella 顯著提升至5.81%（P<0.05）。但S7 樣品中菌屬相對豐度之和顯著高于S0 樣品（P<0.05），假黃單胞菌屬（14.59%）、不動桿菌屬（5.14%）的相對豐度顯著提升。在S35 樣品中，除Parapedobacter 和噬熱多孢菌屬的相對豐度顯著提升至13.46%和10.64%外（P<0.05），S7 樣品中其他優(yōu)勢菌屬的相對豐度均有所下降。S49 樣品的群落結(jié)構(gòu)與S35 的相似，僅鞘脂桿菌屬的相對豐度提升了5.3%。

表3 菌糠堆肥過程中細(xì)菌群落屬水平相對豐度Table 3 The relative abundance of bacteria community at genus level during mushroom bran composting

如圖7，在真菌門水平上，子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門是主要的優(yōu)勢微生物類群，堆肥各時期中無顯著變化。如表4，木耳屬、鬼傘屬、木霉屬等12 個真菌屬為優(yōu)勢菌屬，堆肥不同時期的樣品在菌屬組成和相對豐度生均有顯著差異（P＜0.05）。在S0 樣品中，相對豐度較高的菌屬分別為木霉屬（30.04%）、木耳屬（25.39%）。在S7 樣品中，木霉屬、木耳屬、Coniochaeta 和粘束孢屬的相對豐度顯著降低至13.97%、20.75%、0.71%和4.59%（P＜0.05）。S7 樣品中Thermomyces、Mycothermus 分 別 提 高 了10.01% 、8.72%（P ＜0.05）。在S35 樣 品 中，鬼 傘 屬、Pseu dallescheria 的相對豐度分別提升了21.57%、14.23%（P＜0.05）。在S49 樣品中，主要優(yōu)勢微生物的總相對豐 度 顯 著 下 降（P ＜0.05），與S7 樣 品 相 比，Ther momyces 和Peziza 的相對豐度顯著提升（P＜0.05）。

圖7 菌糠堆肥過程中真菌群落門水平相對豐度Fig.7 The relative abundance of fungus community at phylum level during mushroom bran composting

表4 菌糠堆肥過程中真菌群落屬水平相對豐度Table 4 The relative abundance of fungus community at genus level during mushroom bran composting

3 討論

堆體溫度是堆肥各時期微生物活性的宏觀指標(biāo)[24]，受原料組成、有機質(zhì)含量、pH 等理化參數(shù)的影響較大[25]。在菌糠堆肥過程中，堆體最高溫度達(dá)到68.3 ℃，高溫期持續(xù)21 d，可能是菌糠質(zhì)地疏松保水性好，并且富含蛋白質(zhì)、維生素等多種養(yǎng)分，堆肥過程中微生物的代謝活動增強，釋放大量的能量導(dǎo)致堆體溫度快速升高。在堆肥初期，物料中木質(zhì)纖維素類物質(zhì)被木質(zhì)纖維素降解菌分解利用，產(chǎn)生大量的小分子酸，使堆肥體系的pH 不斷降低，隨著堆肥物料的發(fā)酵，小分子酸被微生物利用，堆肥體系的pH上升。李章海等人研究發(fā)現(xiàn)pH 在7.5～8.5 時可以加快腐熟速率[26]，與研究中菌糠堆肥的pH 變化趨勢類似。堆肥初期微生物代謝旺盛且活性較高，有機物被快速轉(zhuǎn)化，因此，在試驗中，有機質(zhì)分解率在堆肥升溫期快速上升。

試驗在S0 樣品中檢測到木霉屬和木耳屬的相對豐度較高，研究表明二者在木耳栽培過程中發(fā)揮重要作用[27-28]，在堆肥過程中接種木霉可以有效延長牛糞堆肥的高溫期并且減少氮素?fù)p失[29-30]，這可能是試驗堆肥物料中總氮含量升高的原因。與S0 相比，S7 樣品中菌群豐富度和多樣性均下降，可能是因為在升溫階段物料中的易降解有機物被消，并且耗隨著物料的發(fā)酵，堆體溫度快速上升，抑制了部分嗜溫微生物的生長。鞘脂桿菌屬能降解多環(huán)芳香烴類物質(zhì)，可降解肥料中有機物，從而減少污染物危害，促進(jìn)植物的生長[31-32]，這可能是其在S35 樣品中顯著提高的原因。與S7 樣品相比，S35 樣品中微生物的相對豐度均有所下降，可能是因為易利用有機物在高溫期被大量消耗，降溫期的易降解有機物含量較低，微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，導(dǎo)致微生物的代謝活動減弱。假黃單胞菌屬已被證明與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)[33]，在試驗中假黃單胞菌屬的相對豐度顯著提升。不動桿菌屬、噬熱多孢菌屬在試驗S7 樣品比S0樣品顯著提高（P＜0.05），有研究表明不動桿菌屬能夠高效降解木質(zhì)素[34-35]，賈洋洋等[36]發(fā)現(xiàn)噬熱多孢菌屬在好氧堆肥降解木質(zhì)纖維素的過程中發(fā)揮重要作用，說明堆肥發(fā)酵對菌糠中的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)具有較好的降解效果。與S7 樣品相比，在S35 樣品中木質(zhì)纖維素降解菌群的代謝活性增強，可能是S35樣品中菌群多樣性提高的原因。在菌糠堆肥發(fā)酵過程中，真菌分泌胞外酶，加快難降解有機物的分解效率[37-38]，對菌糠堆肥具有促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

（1）在低溫環(huán)境下，菌糠堆肥不同時期的細(xì)菌多樣性差異顯著，真菌在高溫期和腐熟期的多樣性差異顯著，古菌多樣性極低。

（2）菌糠堆肥物料可以完全腐熟，總養(yǎng)分含量相對較低。