光周期對赤點石斑魚血管囊TSHβ和TSHR基因表達的影響

徐文剛,劉立明,王九龍,張建柏,真鍋颯一郎,唐永政

(1.煙臺大學海洋學院,山東 煙臺 264005;2.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院,山東 煙臺 264003;3.長崎大學環(huán)中國東海環(huán)境資源研究所,日本 長崎 851-2213)

赤點石斑魚(Epinephelusakaara)隸屬于輻鰭魚綱(Actinopterygii)、鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Percoidei)、鮨科(Serranidae)、石斑魚屬(Epinephelus),廣泛分布于我國東海、南海以及日本和韓國等[1]。國內(nèi)有關其研究主要集中在生長、發(fā)育、成熟、產(chǎn)卵和孵化[2-4]等。自然環(huán)境下,赤點石斑魚需要4～6年性腺才能發(fā)育成熟[5],采用人工調(diào)控水溫和光照時間有利于促進其提前成熟和產(chǎn)卵,縮短養(yǎng)殖周期,減少越冬消耗,降低養(yǎng)殖成本[6-7]。

調(diào)控魚類性腺發(fā)育的內(nèi)分泌系統(tǒng)依賴于光刺激,因此光周期成為影響魚類性腺發(fā)育重要的環(huán)境因子[8]。在鳥類和哺乳類中已有光周期和性成熟的相關研究報道,其大致傳遞途徑為腦內(nèi)的光接受部位感受到光刺激后誘導腺垂體合成促甲狀腺激素(TSH),TSH包含一個β亞基單元和一個糖蛋白α亞基單元。TSHβ與甲狀腺合成的促甲狀腺激素受體(TSHR)相結合,誘導下丘腦合成Ⅱ型脫碘酶(DIO2)。DIO2能使下丘腦中非活性型TSHβ中的T4脫去1個碘,使其轉變?yōu)榫哂谢钚缘娜饧谞钕偎?T3)。T3作用于下丘腦合成的促性腺激素釋放激素(GnRH)的神經(jīng)末端[9]。一般情況下,哺乳類和鳥類下丘腦中的GnRH神經(jīng)末端被神經(jīng)干細胞包裹而抑制了GnRH的合成和釋放,但T3能夠作用于神經(jīng)干細胞,改變其結構并向毛細血管釋放GnRH而調(diào)節(jié)其性成熟[9]。由于魚類腦部沒有腦垂體隆起結構,所以有關光刺激和性成熟的研究報道較少。

目前,以魚類視網(wǎng)膜和松果體作為已知光感應器官的報道較多[10]。在短光照繁殖的魚類如香魚(Plecoglossusaltivelis)中,摘除光接收部位如眼球和松果體后,其性成熟受到抑制[11]。虹鱒(Oncorhynchusmasou)無論是否摘除松果體,在明暗條件下都不會喪失攝食行動[12],表明在魚類中可能存在除松果體和視網(wǎng)膜以外的光接受器官。在大麻哈魚(Oncorhynchusmasou)中,血管囊可能具有代替腦垂體隆起葉的功能[13]。血管囊是魚類[14-15]或甲殼類[16]特有的器官,位于魚類腦垂體后方,表面被王冠細胞所覆蓋。魚類血管囊對季節(jié)變化較為敏感,是一種季節(jié)傳感器[17]。目前僅在斜帶石斑魚(E.coioides)中發(fā)現(xiàn)有關TSHβ基因克隆和表達的研究報道[18]。因此,本實驗以赤點石斑魚為對象,考察光周期對其TSHβ和TSHR基因表達的影響,以期為石斑魚的資源保護提供更多的信息和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及設計

以在日本山口縣水產(chǎn)研究所購買的赤點石斑魚為實驗對象,將其運輸至長崎大學環(huán)中國東海環(huán)境資源研究所。2018年11月20日,挑選外形規(guī)格一致的魚,全長25.14±0.57 cm(total length,TL),體重160.89±9.57 g(body weight,BW),將其飼養(yǎng)在2個容積為500 L的水槽中,共計60尾,每個水槽放置30尾。水槽為開放式流水養(yǎng)殖,水溫17.1～18.8 ℃,鹽度29～31,pH 7.6～8.1,溶解氧5 mg/L以上,保持24 h增氧。實驗時間為11月30日至12月21日。2個水槽分別設為對照組和處理組,對照組為自然光照條件下飼養(yǎng),光周期為10L∶14D(Light∶Dark);處理組以日光燈作為光源,放置在試驗池上方大約2 m處,每平方米放置2根日光燈管,并在四周用黑布遮擋以避免外界干擾,利用開、關燈控制光照時間,光周期為14L∶10D。實驗期間每天早晚各投食一次,所用飼料為Ohitome EP2(日清丸紅飼料,日本)。實驗期間無個體死亡。

1.2 方法

采樣時間為11月30日、12月7日、12月14日和12月21日(每周各一次),對照組和處理組每次各6尾。采樣時,用2-苯氧乙醇將魚麻醉后,打開頭蓋骨,取下血管囊,將其保存在200 μL RNAlater試劑(Ambion Inc., Invitrogen Life Technologies, Japan)中4 ℃低溫保存,一周后廢棄RNAlater,轉移至-80 ℃冰箱中長期保存用于PCR實驗。實驗結束后,再隨機取下5尾魚的全腦組織并將其立即置于波恩試劑中固定24 h后于70%的乙醇中保存,用于血管囊結構組織學分析。

1.2.1 血管囊的組織學觀察 組織學步驟參照本實驗室已發(fā)表論文[19-22]的方法,對石斑魚全腦進行常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和連續(xù)切片,厚度為5 μm。采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,中性樹膠封片,Olympus FX380型光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 總RNA的提取與反轉錄反應 取凍存的赤點石斑魚血管囊組織,參照TRIzol試劑盒(Life Technologies Corp.,USA)中的說明書進行總RNA的提取,經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳檢測RNA完整度,用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific Inc., USA)檢測RNA濃度。根據(jù)Transcriptor first strand cDNA synthesis(Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany)說明書操作,取500 ng總RNA為反轉錄模板合成第一鏈cDNA,用于PCR的擴增。

1.2.3 PCR擴增和TSHβ和TSHR基因的測序 由合成的cDNA對TSHβ和TSHR基因進行擴增。首先設計簡并引物,引物參考基因庫中已知同源物種的序列進行設計。TSHβ參照歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)(GenBank accession No. KJ095101)、金頭鯛(Sparusaurata)(GenBank accession No. KM014688)、紅擬石首魚(Sciaenopsocellatus)(GenBank accession No. GU144513)、尖吻鱸(Latescalcarifer)(GenBank accession No. XM-018661848)、深裂眶鋸雀鯛(Stegastespartitus)(GenBank accession No. XM-008280178)。TSHR參照歐洲鱸魚(GenBank accession No. ABD39706)、大黃魚(Larimichthyscrocea)(GenBank accession No. XP-010755243)、高體鰤(Serioladumerili)(GenBank accession No. XP-022620292)、尖吻鱸(Latescalcarifer)(GenBank accession No. XP-018550226)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(GenBank accession No. XP-005449610)。使用Primer3Plus軟件設計簡并引物,由Fasmac公司(Kanagawa,Japan)合成,引物序列如表1所示。

表1 PCR擴增反應中的引物序列

使用EmeraldAmp?PCR Master Mix試劑盒(Takana bio株式會社,日本)對目的區(qū)域片段進行擴增,步驟如下:將-80 ℃下保存的cDNA樣品在冰上解凍,之后在PCR管中加入EmeraldAmp PCR Master Mix(2×Premix)5 μL、UltraPureTMDistilled Water 3.6 μL、cDNA 1 μL、Forward primer(10 pmol/μL)0.2 μL、Reverse primer(10 pmol/μL)0.2 μL,混合均勻。隨后在PCR熱循環(huán)儀(Applied Biosystems Thermal Cycler)進行擴增反應,條件如下:95 ℃預變性5 min;98 ℃ 10 s、后56 ℃ 30 s、最后 72 ℃ 1 min,共30個循環(huán);95 ℃ 5 s,65 ℃ 1 min熔解;最后50 ℃冷卻30 s。反應結束后,取出PCR管,收集PCR產(chǎn)物并在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測,隨后切割符合大小的條帶,利用天根DNA膠回收試劑盒回收目的片段?；厥蘸蟮钠闻cTOPO載體過夜連接,轉化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中。之后將其涂板過夜培養(yǎng)后,挑選陽性單菌落于含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)液體培養(yǎng)基中在37 ℃條件下震蕩培養(yǎng)一晚,進行菌液PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗證后送Fasmac公司測序。利用NCBI ORF finder在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測赤點石斑魚TSHβ和TSHR基因的開放閱讀框。使用NCBI Protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對赤點石斑魚TSHβ和TSHR堿基和所編碼的氨基酸序列與其他魚種的相似性進行比較分析。

1.2.4TSHβ和TSHR基因表達量的檢測TSHβ和TSHR基因表達量的測定方法參照本實驗室已發(fā)表論文[20-22]:根據(jù)已獲得的TSHβ和TSHR堿基序列,用Primer3Plus軟件設計,由Fasmac公司(Kanagawa,Japan)合成,引物序列如表2所示。TSHβ和TSHR基因測定參照FastStart Essential DNA Green Master(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)試劑盒上的說明書操作,PCR反應體系:cDNA模板1 μL,5 μL Green Master(2×concentrate),上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL,2 μL滅菌超純水,總計10 μL混合物。在 Light Cycler?480(Roche Diagnostics, Switzerland)進行PCR反應,條件如下:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,45個循環(huán);95 ℃ 5 s,65 ℃ 1 min熔解;最后50 ℃冷卻30 s。PCR反應后獲得熔解曲線,檢測數(shù)據(jù)用絕對定量法進行統(tǒng)計分析。

表2 實時熒光定量PCR反應中的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 赤點石斑魚血管囊的組織學觀察

赤點石斑魚血管囊位于腦垂體后側的延髓附近,呈一團紅色狀(圖1(a))。組織學結果表明其位于腦垂體后方的間腦下部(圖1(b)),在血管囊內(nèi)部觀察到了冠狀細胞(圖1(c)、(d))。

圖1 赤點石斑魚血管囊解剖結構及組織切片

2.2 TSHβ和TSHR基因的克隆和序列分析

運用PCR技術成功克隆出TSHβ和TSHR部分堿基序列,其堿基序列和所編碼的氨基酸序列見圖2。TSHβ包括270個堿基，對應89個氨基酸殘基;TSHR包括380個堿基，對應126個氨基酸殘基。如表3所示,赤點石斑魚TSHβ堿基序列與歐洲鱸魚、金頭鯛、紅擬石首魚、尖吻鱸和深裂眶鋸雀鯛相比,相似性分別為94%、91%、91%、90%和89%。TSHβ所編碼的氨基酸序列與歐洲鱸魚、金頭鯛、紅擬石首魚、尖吻鱸和深裂眶鋸雀鯛相比,相似性分別為97%、92%、92%、92%和90%。赤點石斑魚TSHR堿基序列與歐洲鱸魚、大黃魚、高體鰤、尖吻鱸和尼羅羅非魚相比,相似性分別為91%、90%、90%、89%和85%。TSHR所編碼的氨基酸序列與歐洲鱸魚、大黃魚、高體鰤、尖吻鱸和尼羅羅非魚相比,相似性分別為89%、91%、91%、87%和83%。

圖2 TSHβ和TSHR部分堿基序列和所編碼的氨基酸序列

表3 赤點石斑魚TSHβ和TSHR堿基序列及其所編碼的氨基酸序列的相似性

2.3 赤點石斑魚TSHβ和TSHR基因表達量變化

如圖3所示,對照組中TSHβ和TSHR基因表達量在各時間段的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);但處理組中TSHβ和TSHR基因表達量在12月7日均顯著高于其他時間段(P<0.05),也顯著高于對照組12月7日的表達量(P<0.05)。

不同小寫字母表示處理組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),相同小寫字母或無字母表示對照組間或處理組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),*表示對照組與處理組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

3.1 赤點石斑魚血管囊結構的組織學觀察

本研究通過對赤點石斑魚血管囊結構進行組織學觀察,觀察到了冠狀細胞。研究表明,冠狀細胞具有多種功能,包括光感受和神經(jīng)內(nèi)分泌輸出,比如在虹鱒等硬骨魚血管囊冠狀細胞中,不僅檢測到TSHβ和DIO2等物質的存在,還檢測到其他光感受因子如SWS1(short wavelength-sensitive 1)和OPN4(opsin 4)蛋白因子的存在[23]。赤點石斑魚血管囊中的冠狀細胞可能也具有光信息接收和感應的功能。已有研究表明,血管囊可能具有分泌蛋白質的機能[14-16];血管囊冠狀細胞和周圍的毛細血管上附著有不同直徑的神經(jīng)纖維,這些神經(jīng)纖維連接著血管囊與第三腦室,表明血管囊冠狀細胞分泌的蛋白因子可能從毛細血管通過神經(jīng)纖維傳遞到第三腦室[24]。由本研究結果推測赤點石斑魚血管囊可能也有分泌光感應蛋白因子的機能,但蛋白因子的種類和角色有待進一步研究。

3.2 赤點石斑魚TSHβ和TSHR堿基序列

本研究運用PCR技術,克隆到赤點石斑魚TSHβ和TSHR基因的部分堿基，其堿基序列分別為270 bp和380 bp,與鱸形目其他魚種進行比較分析,赤點石斑魚堿基序列全長范圍大約為850～3000 bp。已有研究表明,斜帶石斑魚TSHβ堿基序列全長為913 bp[18]。本實驗中克隆的序列大概是全長的1/3到1/8。本實驗克隆的TSHβ和TSHR所編碼的氨基酸序列分別為89和126個氨基酸殘基。鱸形目其他魚種的TSHβ和TSHR所編碼的氨基酸序列全長大約為150和780個殘基。因此,從所編碼的氨基酸序列長度來看，本實驗克隆的TSHβ和TSHR分別約為全長的60%和15%。與鱸形目其他魚種相比,赤點石斑魚TSHβ相似性為89%～94%,TSHR為85%～91%。綜上所述,本研究中克隆的赤點石斑魚TSHβ和TSHR堿基序列能用于后續(xù)基因表達量的測定。

3.3 光周期對赤點石斑魚TSHβ和TSHR基因表達的影響

本實驗中赤點石斑魚在光周期(14L∶10D)條件下飼養(yǎng)一周后,處理組魚血管囊中TSHβ和TSHR基因表達量均顯著增加,且顯著高于對照組,表明光周期可能影響赤點石斑魚TSHβ和TSHR基因的表達。已有研究表明,大西洋鮭(Atlanticsalmon)暴露在長光照條件下10 d后腦垂體中TSHβ基因表達量增加5倍且能夠維持至少20 d;但血管囊中的TSHβ基因表達量保持低值并不受到光周期的影響[25]。在黑線倉鼠(Cricetulusbarabensis)中對TSHβ和TSHR光周期表達模式的研究發(fā)現(xiàn),雄性個體垂體和睪丸中兩基因在長光照的相對表達量都顯著高于短光照的表達量;雌性個體垂體和卵巢中TSHβ在中光照條件下表達量最高[26]。本研究結果表明,光周期(14L∶10D)條件可能刺激赤點石斑魚血管囊中的冠狀細胞,導致TSHβ和TSHR基因表達量的增加。

4 結 論

(1)在赤點石斑魚血管囊內(nèi)部觀察到了冠狀細胞。(2)赤點石斑魚TSHβ和TSHR堿基序列與鱸形目其他魚種相比具有高度相似性,分別為89%～94%和85%～91%。(3)光周期(14L∶10D)條件可能影響赤點石斑魚血管囊中TSHβ和TSHR基因的表達。