EDN1和CFH的基因多態(tài)性與2型糖尿病增生性視網(wǎng)膜病變的相關性

蔣冬冬，靳荷,，鄭柳，楊彬彬，丁芝祥

(1.桂林醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，廣西 桂林 541000；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科，廣西 桂林 541000)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者致盲的主要原因之一[1]，也是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥[2]。糖尿病病程的延長、血糖控制不良、高血壓、高血脂、腎功能不全等被認為是與DR相關的重要危險因素[3-5]，但是Sobrin等[6]的臨床研究發(fā)現(xiàn)：一些患者雖然血糖控制不佳或病程較長，最終卻沒有發(fā)展為DR；一些患者即使血糖控制相對較好，也會很快發(fā)展為嚴重的DR，嚴重影響視功能。這些患者之間存在著個體化差異，提示遺傳因素可能在DR的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，因此了解DR的基因遺傳特性將有助于對DR患者的早期診斷和疾病管理。本研究以廣西漢族2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)人群為研究對象，通過競爭性等位基因特異性聚合酶鏈反應(kompetitive allele specific polymerase chain reaction，KASP)基因分型檢測技術進行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型，檢測并分析T2DM患者rs5370、rs800292這2個SNPs位點的基因多態(tài)性，旨在探討其與DR的相關性，為DR的臨床預防及個性化治療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

納入2019年1月至2020年9月至桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科、內分泌科就診的T2DM患者為研究對象?；颊呔诠鹆轴t(yī)學院附屬醫(yī)院眼科接受了詳細的眼科檢查(最佳矯正視力、眼內壓、裂隙燈和散瞳眼底檢查等)。結合眼底照相、眼底血管造影和眼底光學相干斷層掃描的結果并參照《眼科學八年制》第3版中[7]的DR國際分型標準分為無糖尿病性視網(wǎng)膜病變(non-diabetic retinopathy，NDR)組與增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)組(如果雙眼的病變程度不一致，按照病變程度嚴重的一眼進行診斷、分級)。出現(xiàn)新生血管生成、玻璃體積血、視網(wǎng)膜前出血任一改變的患者為PDR組，沒有發(fā)生DR的患者為NDR組。納入標準：1)符合《中國2型糖尿病防治指南(2017版)》[8]診斷標準；2)均為漢族人，并且在桂林居住10年以上，彼此間無血緣關系。排除標準：1)排除1型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊類型糖尿??；2)排除嚴重糖尿病腎病、高度近視、單純高血壓、腫瘤等其他原因導致的眼底病變患者；3)排除患有冠狀動脈疾病，周圍血管疾病，任何血栓形成史，急性感染等的患者。最終納入386例NDR患者和314例PDR患者。本研究經桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(GLMU1A2019120)，并遵守《赫爾辛基宣言》的宗旨?；颊呔栽竻⑴c本研究，并已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床資料的收集

收集年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、收縮壓、舒張壓、高血壓史、胰島素治療史及糖尿病病史等基本信息，及糖化血紅蛋白(hemoglobin A1C，HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)等實驗室檢查的臨床資料。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測

將所有患者的全血標本收集在EDTA管中，于-20 ℃下保存。使用TIANamp基因組DNA試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]從全血中提取基因組DNA。基于KASP檢測技術對SNP位點篩選分析進行基因分型。將來自PDR或NDR患者的等量基因組DNA(0.8 μL/人)與KASP Master Mix和KASP assay mix混合，然后通過PCR擴增含有SNP的DNA片段。PCR程序如下：1)在94 ℃下預變性，時間為15 min；2)在94 ℃下變性，時間為20 s，在65 ℃下退火(每循環(huán)降低0.8 ℃)，時間為1 min，以上步驟進行10個循環(huán)；3)最后在57 ℃下延伸，時間為1 min，進行27個循環(huán)。使用Primer Premier 5.0設計用于KASP SNP分析的引物(表1)，并使用IntelliQube軟件(英國LGC Genomics)分析等位基因頻率。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。采用Hardy-Weinberg平衡定律進行檢驗rs5370、rs800292位點的基因型分布是否具有群體代表性。計量資料以均數(shù)±標準差()表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以頻率(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。在采用logistic回歸分析rs5370、rs800292與T2DM患者視網(wǎng)膜病變的關系時，對具有統(tǒng)計學意義的變量進行校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料比較

NDR組和PDR組的年齡為(58.50±11.44)歲、(58.95±10.16)歲，女性比例分別為44.04%、44.59%，差異均無統(tǒng)計學意義(P年齡=0.699，P女性=0.826)。糖尿病病程、BMI、HbA1c、TC、HDL-C、LDL-C的組間差異也均無統(tǒng)計學意義。收縮壓、使用胰島素治療以及GFR的分析結果顯示兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P收縮壓=0.025，P胰島素=0.001，PGFR=0.013；表2)。

表2 一般臨床資料比較Table 2 Comparison of general clinical data

2.2 rs5370、rs800292基因位點的分型結果

分型檢測結果顯示：rs5370位點存在TT、GT和GG三種基因型，NDR組其頻率分別為8.47%、40.74%和50.79%，PDR組其頻率分別為13.50%、42.00%和44.50%；rs800292位點存在AA、GA和GG三種基因型，NDR組其頻率分別為11.23%、51.87%和36.9%，PDR組其頻率分別為16.77%、46.45%和36.78%(圖1)。

圖1 KASP基因分型圖Figure 1 KASP genotyping map

2.3 Hardy-Weinberg檢驗

經Hardy-Weinberg檢驗，rs5370、rs800292位點基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(rs5370：PNDR=0.994，PPDR=0.454；rs800292：PNDR=0.097，PPDR=0.869)，因此，2個位點選擇的樣本均具有群體代表性(表3)。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢驗Table 3 Hardy-Weinberg balance test

2.4 NDR組與PDR組rs5370、rs800292兩個基因位點的基因型分布頻率的比較

在內皮素-1(endothelin 1，EDN1)基因的rs5370位點上，兩組間TT基因型與GG+GT基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.032)。在補體因子H(complement factor H，CFH)基因的rs800292位點上，兩組間AA基因型與GA+GG基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036，表4)，其余基因型組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表4 NDR組和PNR組的2個SNP位點的基因型頻率分布比較分析Table 4 Comparative analysis of genotypic frequency distributions at two SNP loci in the NDR group and the PNR group

2.5 Logistic回歸分析rs5073、rs800292與T2DM患者視網(wǎng)膜病變的關系

以是否發(fā)生PDR作為因變量，以rs5370位點基因型為自變量，進行l(wèi)ogistic回歸分析。根據(jù)AIC標準決定最優(yōu)的遺傳模型[9]，發(fā)現(xiàn)在沒有做任何修正時，在隱性模型下攜帶EDN1基因rs5370位點的TT基因型T2DM患者比GG或GT基因型患者患PDR的風險高2.973倍(OR=2.973，95%CI：1.446～6.112，P=0.003)；在隱性模型下，攜帶CFH基因rs800292位點的AA基因型T2DM患者比攜帶GG或GA基因型患者患PDR的風險高1.949倍(OR=1.949，95%CI：1.042～3.647，P=0.037)。在校正了收縮壓、GFR以及是否使用胰島素等混雜因素后，在隱性模型下，攜帶EDN1基因rs5370位點的TT基因型T2DM患者比攜帶GG或GT基因型患者患PDR的風險高2.718倍(OR=2.718，95%CI：1.254～5.894，P=0.011)；在隱性模型下，攜帶CFH基因rs800292位點的AA基因型T2DM患者比攜帶GG或GA基因型患者患PDR的風險高2.058倍(OR=2.058，95%CI：1.019～4.158，P=0.044；表5)。

表5 Logistic回歸分析 rs5370、rs800292與T2DM患者增生性視網(wǎng)膜病變的關系Table 5 Logistic regression analysis of rs5370,rs800292 and retinopathy proliferative in patients with type 2 diabetes mellitus

3 討論

單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms，SNPs)是脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)序列，通常在不同的群體中這些DNA序列的變化對基因的表達影響也有所不同[10]。如果這些DNA序列的改變發(fā)生在假定的調節(jié)區(qū)，那么它們可能會影響基因的表達[10]。Liu等[11]及Graham等[12]利用全基因組關聯(lián)研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)檢測技術，在不同的種族中檢測與DR相關的新基因位點，發(fā)現(xiàn)了許多與DR易感性相關的SNPs位點。但目前還沒有關于這些位點在中國廣西漢族人群中的作用的系統(tǒng)性研究，因此本研究首次集中探討了EDN1基因的rs5370位點以及CFH基因的rs800292位點在中國廣西壯族自治區(qū)漢族T2DM人群中的多態(tài)性及其對PDR遺傳易感性的影響。

T2DM是由于內源性胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗導致的疾病。Jingi等[13]研究發(fā)現(xiàn)：長期使用胰島素控制血糖會增加DR發(fā)生的風險，與本研究結果一致。血糖控制不穩(wěn)定是糖尿病患者發(fā)生DR的高危因素，胰島素可以幫助患者控制血糖的穩(wěn)定，然而眾多研究證明使用胰島素治療可能會增加并發(fā)DR的風險[13-14]。這種矛盾的聯(lián)系背后的機制還不是很清楚。這可能與胰島素在降糖的同時會降低脂蛋白酯酶活性，使其失去對血管的保護作用有關，同時，胰島素還會聯(lián)合生長激素增加血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，進一步刺激眼底新生血管的生成[13]。但是在本研究中，我們認為患者使用胰島素治療存在主觀因素的影響，使用胰島素治療可能并不是發(fā)生PDR的危險因素。因為本研究中PDR組納入的是發(fā)生最嚴重DR的患者，大部分患者因血糖控制不佳，已經在內分泌醫(yī)生的指導下使用了胰島素控制血糖。因此，胰島素與DR之間的矛盾關系及其誘導機制仍需要更多臨床數(shù)據(jù)分析，以及對胰島素的詳細使用時間、種類等進行進一步研究。

英國糖尿病專家共識[15]指出糖尿病患者合并高血壓時會增加并發(fā)DR的風險，使用血管緊張素轉換酶抑制劑等控制血壓的藥物治療可顯著降低發(fā)生并發(fā)癥的風險，這與本研究結果一致。推測原因可能為高血糖損害了視網(wǎng)膜微血管的壓力自動調節(jié)機制，使血管內皮細胞更易受到高血壓的損傷。收縮壓升高造成血管內皮細胞的持續(xù)性損傷，血小板附著性增加，最后導致視網(wǎng)膜血管無灌流，組織缺氧誘導新生血管生成[16]。因此推測收縮升高可能與T2DM患者發(fā)生PDR相關。

腎小球與視網(wǎng)膜血管具有相似的生理結構，發(fā)生病變時均屬于糖尿病的微血管病變[17]。T2DM患者的機體持續(xù)處于高血糖環(huán)境下時，體內血漿滲透壓升高對腎小管造成損傷，引起GFR降低。陶俊等[18]的臨床研究表明T2DM患者GFR的降低與DR的發(fā)生相關，與本研究結果一致。

HbA1c可能和糖尿病糖代謝異常存在關聯(lián)[19]。當HbA1c水平升高時，會使紅細胞加速聚集，容易在毛細血管形成血栓，且紅細胞對氧的親和力也會增加，氧解離減少，引起組織缺氧，刺激血管生成因子的產生[20]。Shurter等[21]研究發(fā)現(xiàn)：當T2DM患者的血糖水平控制不佳時，HbA1c水平會明顯升高。但本研究發(fā)現(xiàn)HbA1c在NDR和PDR組之間差異無統(tǒng)計學意義。這可能與本研究未能檢測影響HbA1c水平穩(wěn)定性的混雜因素有關，例如飲食、熬夜和其他生活方式因素等。其次，此次納入研究的大多數(shù)PDR患者均已經使用了胰島素治療，血糖控制較穩(wěn)定，因此兩組間HbA1c無明顯統(tǒng)計學差異。

EDN1基因的rs5370位點所在區(qū)域是第5外顯子的第61個核苷酸[22]。Dubovyk等[23]也認為EDN1的基因多態(tài)性與動脈硬化等心血管相關疾病密切相關。PDR在病理生理學上屬于新生血管型疾病，因此其發(fā)生發(fā)展必然與新生血管的調控失常存在必然聯(lián)系[24]。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型比攜帶GG或GT基因型發(fā)生PDR風險增加2.718倍。因此，TT基因型可能增加了T2DM患者PDR易感性，可能是PDR的易感基因型。由此推測rs5370區(qū)域在第1次酶切的過程中被剪切，該位點發(fā)生G等位基因到T等位基因的突變，通過改變前EDN1的氨基酸序列以及干擾酶切的過程來影響成熟EDN1的形成，進而影響血管內皮生長因子VEGF基因的表達，誘導新生血管形成，最終導致T2DM患者進展為DR。因此，T2DM患者EDN1基因rs5370位點的多態(tài)性與視網(wǎng)膜的新生血管形成相關。這一研究結果與Li等[25]在中國安徽省人群中的研究結果一致。rs5370位點可能是中國廣西壯族自治區(qū)漢族T2DM患者進展為PDR的重要遺傳標記。

補體系統(tǒng)是先天免疫的關鍵組成部分，參與調節(jié)各種免疫和炎癥反應[26-27]。在生理條件下，絕大多數(shù)補體成分以無活性酶前體形式存在，在不同激活物作用下發(fā)生一系列級聯(lián)酶促反應被激活，表現(xiàn)出多種生物學活性[26]。T2DM患者的機體長期處于一個高血糖環(huán)境下，早期的副炎癥和持續(xù)的高血糖環(huán)境可以誘導補體系統(tǒng)的激活[28]。Tang等[29]的研究也表明DR是與炎癥相關的視網(wǎng)膜疾病。因此，CFH基因rs800292位點的多態(tài)性可能對補體系統(tǒng)的激活存在影響。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶AA基因型比攜帶GG或GA基因型發(fā)生PDR風險增加2.058倍。因此，AA基因型可能增加了T2DM患者PDR易感性，可能是PDR的易感基因型。由此推測T2DM患者的PDR易感性可能與rs800292位點G等位基因到A等位基因的突變有關，與此位點的氨基酸由纈氨酸變成異亮氨酸有關。氨基酸的變化會影響C3b結合能力的結構變化，并降低補體替代途徑的激活，隨后導致補體系統(tǒng)過度激活，進而誘發(fā)炎癥性疾病的發(fā)生[26]。這一研究結果提示rs800292位點可能為中國廣西壯族自治區(qū)漢族T2DM患者進展為PDR的另一重要遺傳標記。Wang等[30]的研究結果與本研究結果相反。這可能與樣本大小、生存環(huán)境因素不同以及研究對象的納入標準、排除標準、分組方法等不同有關。后續(xù)仍需更大樣本的研究來對結果進一步驗證。

本研究也存在一些局限性。首先，病例納入的只是廣西地區(qū)的漢族人群，因此得出的結論可能不適用于全國的總體人群。在未來的研究中還需要對不同地區(qū)、不同種族的人群進行更大規(guī)模的隊列研究。其次，由于NDR存在多個病情分級，需要更大的樣本數(shù)量，我們將在進一步研究中進行統(tǒng)計分析。最后，本研究為PDR的發(fā)生提供了提示性證據(jù)，為表明該基因對PDR的發(fā)病是否起到實際性的作用，在接下來的研究中我們將對該基因的相關表達、血清學檢測以及相關通路的機制繼續(xù)深入研究。

綜上所述，臨床指標中收縮壓升高、GFR降低與T2DM患者發(fā)生PDR相關。EDN1基因rs5370位點以及CFH基因rs800292位點的多態(tài)性與中國廣西壯族自治區(qū)漢族T2DM人群發(fā)生PDR的風險顯著相關，這些位點的基因多態(tài)性可能參與了PDR的發(fā)病機制，可能是T2DM人群發(fā)生PDR的易感基因位點。我們后續(xù)仍會收集更大的樣本量、進行更深入的研究對數(shù)據(jù)予以進一步的證實。

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