載P/Ag微結(jié)構(gòu)Ti表面的生物學(xué)性能和抗菌性能

賈術(shù)峰，郝建華，李寶娥，王東輝，李海鵬，梁春永，王洪水

（河北工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300401）

0 引言

鈦（Ti）因其優(yōu)良的強(qiáng)度/重量比、耐蝕性和生物相容性成為醫(yī)用臨床上廣泛使用的硬組織修復(fù)和替換材料，成功用作人工關(guān)節(jié)和牙科種植體等。但由于其不具有生物活性，植入肌體后不能與組織形成骨性結(jié)合，容易被纖維組織包裹，延長(zhǎng)愈合時(shí)間，長(zhǎng)期服役還可能出現(xiàn)植入物松動(dòng)、脫落的現(xiàn)象。此外，鈦不具有抗菌性，植入肌體后引發(fā)術(shù)后感染的幾率為1%～4%，術(shù)后感染不僅嚴(yán)重影響植入物在體內(nèi)的服役效果，而且加重患者的痛苦、提高了治療成本。因此，對(duì)鈦表面進(jìn)行改性，賦予其良好的生物活性和抗菌性，對(duì)提高其綜合性能、改善臨床使用效果，具有重要意義。

成分和表面結(jié)構(gòu)是決定材料表面性能的兩個(gè)重要因素。在過(guò)去的幾年中，研究者們采用各種物理和化學(xué)方法（如噴砂和酸蝕[1]、微弧氧化[2]、等離子噴涂[3]、陽(yáng)極氧化[4]等）處理Ti表面以引入不同的微結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分，來(lái)提高其生物學(xué)性能和抗菌性。大量研究已表明，在Ti表面引入一定的微結(jié)構(gòu)或者生物活性成分可有效改善其生物學(xué)性能，而各種有機(jī)、無(wú)機(jī)抗菌劑也常被引入到Ti表面以制備抗菌植入體。研究證實(shí)，P 可顯著提高植入材料的生物學(xué)性能，載P 植入體材料相比未載P 材料，其與骨組織的接觸增加率高達(dá)232%[5]。另外，銀是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的無(wú)機(jī)抗菌劑，已被安全應(yīng)用于創(chuàng)傷外科手術(shù)中，可殺死多種細(xì)菌而不引起耐藥性[1]。因此，在具有微結(jié)構(gòu)的Ti表面引入P和Ag有望提高其生物活性和抗菌性能，獲得良好的綜合性能。但如何將微結(jié)構(gòu)與活性成分、抗菌成分同時(shí)引入到鈦表面，使其兼具良好的生物學(xué)性能和抗菌性能，是近幾年的研究熱點(diǎn)。

陽(yáng)極氧化是在金屬表面制備可控微結(jié)構(gòu)的常用方法，成本低、操作方便，并且由于陽(yáng)極氧化層是由體材部分轉(zhuǎn)化而成，與致密體相之間沒(méi)有截然的分界面，可以具有高的結(jié)合強(qiáng)度和穩(wěn)定性[6]。此外，在陽(yáng)極氧化過(guò)程中，電解液中的生物活性成分也可通過(guò)反應(yīng)過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)梯度力引入到材料表面，進(jìn)而改善材料的生物學(xué)性能[7]。因此，本研究首先利用陽(yáng)極氧化技術(shù)將元素P和一種新型微結(jié)構(gòu)引入到Ti表面，然后通過(guò)離心和紫外輻照的方法將Ag摻雜到該表面。本研究采用模擬體液（SBF）浸泡試驗(yàn)考察材料的生物活性，MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究其生物相容性，并采用細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

采用TA1純鈦?zhàn)鳛榛w材料，線切割為10 mm×10 mm×1 mm的鈦片，然后用不同等級(jí)的SiC砂紙對(duì)其進(jìn)行打磨，至表面光亮、無(wú)明顯劃痕后，再將鈦片依次放入丙酮、乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗。隨后，將該鈦片置于含有1 mol/L NaF的42%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）磷酸電解液中進(jìn)行陽(yáng)極氧化處理。該陽(yáng)極氧化處理采用可程控直流電源（WYK-1206，揚(yáng)州），板狀高純石墨為陰極，鈦片為陽(yáng)極，兩電極平行放置，間距為4 cm。其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：氧化電壓50 V，氧化時(shí)間1 h，反應(yīng)溫度為室溫。反應(yīng)結(jié)束后，鈦表面獲得載P的微結(jié)構(gòu)陽(yáng)極氧化層（命名為P-Ti）。然后將該樣品置于1 mol/L 的AgNO3溶液中進(jìn)行離心處理，離心過(guò)程中轉(zhuǎn)速設(shè)置為8 000 r/min，離心時(shí)間為30 min，隨后再通過(guò)高壓汞燈進(jìn)行紫外光照射30 min，以在Ti表面引入抗菌劑Ag，最終得到的樣品命名為Ag-P-Ti。

1.2 材料表征

分別采用掃描電鏡（SEM，HITACHI S-4800）和電子能譜儀（EDS）考察樣品的表面形貌和元素組成。采用X射線衍射儀（XRD，Rigaku D/max2500）測(cè)量樣品的物相組成，具體參數(shù)為Cu-Kα輻射、40 kV、40 mA，掃描角度為2θ=20°～80°，步長(zhǎng)為0.02°。材料的表面粗糙度由原子力顯微鏡（AFM，Agilent 5500）進(jìn)行測(cè)定，親水性通過(guò)用接觸角儀（KRUSS DAS30）在室溫下測(cè)量去離子水和樣品表面的接觸角來(lái)評(píng)估。

1.3 Ag 緩釋實(shí)驗(yàn)

Ag的緩釋曲線測(cè)定方法如下：將載Ag樣品置于10 mL去離子水中，在37 ℃避光、靜置保存。在預(yù)定時(shí)間，取出樣品置于新的10 mL去離子水中，再次避光靜置保存。重復(fù)這一過(guò)程直至得到不同時(shí)間點(diǎn)的銀緩釋溶液。然后采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES，PerkinElmer Optima 8300）測(cè)定溶液中Ag的含量，從而得到載Ag樣品在不同時(shí)間的Ag釋放量。

1.4 SBF 浸泡實(shí)驗(yàn)

樣品的生物活性通過(guò)SBF浸泡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。SBF溶液與人體血漿的離子濃度非常接近，研究中通常以材料能否在SBF中誘導(dǎo)類骨磷灰石在其表面生成作為其是否具有生物活性的判據(jù)[8]。本研究中所用SBF為1.5SBF鹽溶液（離子濃度是SBF的1.5倍，并且保持了各離子之間的相對(duì)比例），以加速類骨磷灰石的形成過(guò)程，縮短實(shí)驗(yàn)周期。將樣品浸泡于30 mL 的1.5 SBF中，在37 ℃下培養(yǎng)2周，然后，將樣品從溶液中取出，用去離子水輕輕沖洗，空氣中自然干燥后，通過(guò)掃描電鏡觀察樣品表面類骨磷灰石的形成情況。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

樣品置于高壓滅菌器中，在121 ℃下滅菌30 min，然后放入到24孔培養(yǎng)板中。將MC3T3-E1細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供）以1×104cells/cm2的密度接種在樣品表面，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，待細(xì)胞充分黏附后，加入1 mL/孔的DMEM 培養(yǎng)液（Gibco），該培養(yǎng)液中含10%胎牛血清和3%青霉素鏈霉素，然后再置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 d、3 d、5 d。用細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)盒（CCK-8，Dojindo，Kumamoto，Japan）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。并將培養(yǎng)5 d的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）沖洗后浸泡在2.5%戊二醛中固定過(guò)夜，隨后放置在不同等級(jí)的梯度乙醇中逐級(jí)脫水[9]，通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)

通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品對(duì)大腸桿菌的抑制效果。將20 μL濃度為1×105cfu/mL的大腸桿菌溶液滴于樣品表面，37 ℃孵育24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用生理鹽水超聲清洗分離樣品表面的細(xì)菌。將鹽溶液中的細(xì)菌重新培養(yǎng)于瓊脂平板上24 h，觀察存活菌落數(shù)[10]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)偏差都用誤差棒表示。采用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)性進(jìn)行分析，當(dāng)p＜0.05時(shí)可認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

圖1為T(mén)i處理前后的表面形貌圖?？梢钥闯?，作為對(duì)照樣品的拋光Ti，表面相當(dāng)光滑（圖1a）），經(jīng)陽(yáng)極氧化處理后，Ti表面形成了分布均勻、直徑為（120±30）nm的微孔層（圖1b）），EDS能譜證實(shí)該陽(yáng)極氧化層上存在一定的P元素。進(jìn)一步載Ag后，表面形貌沒(méi)有明顯變化，但在Ti表面可見(jiàn)一些細(xì)小的白色顆粒（圖1c））。在較高的放大倍數(shù)下，通過(guò)背散射掃描電鏡觀察（圖1c）右上），發(fā)現(xiàn)該白色顆粒均勻地分布于微孔中，表明抗菌劑Ag 被成功引入到P-Ti 表面的微結(jié)構(gòu)中。EDS 能譜也測(cè)得P 和Ag 元素的存在（圖1d）），進(jìn)一步證實(shí)樣品Ag-P-Ti的成功制得。

圖1 Ti 處理前后的表面形貌圖Fig.1 Surface morphology of the different Ti samples

然而，通過(guò)分析樣品的XRD譜圖，圖2所示，只檢測(cè)到了Ti的特征峰，這是由基體材料產(chǎn)生的。X射線衍射圖中P 和Ag 的缺失，表明它們的含量可能太少，無(wú)法檢測(cè)到。但是通過(guò)圖1 中EDS 分析結(jié)果及背散射圖片，可以證實(shí)一定量的P 和Ag 均已成功負(fù)載到鈦表面微納結(jié)構(gòu)上。

圖2 Ag-P-Ti 樣品的表面XRD 圖譜Fig.2 XRD pattern of Ag-P-Ti samples

由于表面粗糙度和親水性是影響材料生物學(xué)性能的關(guān)鍵因素。本研究考察了不同樣品的表面粗糙度和親水性，如圖3所示。拋光Ti表面的粗糙度(Ra)約為（40±5）nm，陽(yáng)極氧化后，表面粗糙度增加至（67±7）nm，進(jìn)一步的Ag 加載過(guò)程對(duì)表面粗糙度沒(méi)有明顯影響。相應(yīng)樣品的表面水接觸角分別為89°±2°、57°±5°和64°±3°。改性后的Ti表面比拋光Ti 表面具有更高的表面粗糙度和親水性，其原因是Ti 表面存在親水性的P 元素和多孔結(jié)構(gòu)。與陽(yáng)極氧化鈦表面（P-Ti）相比，Ag 加載的過(guò)程并沒(méi)有明顯改變表面粗糙度，這可能是由于負(fù)載的Ag顆粒尺寸細(xì)小且數(shù)量較低所致，然而，在Ag的加載過(guò)程中，表面張力和一些P會(huì)被部分釋放，從而導(dǎo)致表面自由能降低，親水性下降[1]。大量文獻(xiàn)證實(shí)，一定的粗糙度和良好的親水性有利于提高材料的生物活性和生物相容性[11]，因此，我們預(yù)計(jì)本研究中所制得的載P 和Ag 的多孔Ti 表面具有良好的生物學(xué)性能，能夠在SBF 中誘導(dǎo)類骨磷灰石形成，并加速細(xì)胞在該表面的黏附和增殖。

圖3 不同樣品的表面粗糙度和水接觸角Fig.3 Surface roughness and water contact angles of the different samples

將上述不同樣品在SBF中浸泡2周后，表面形貌如圖4所示。可以觀察到，拋光Ti表面浸泡前后沒(méi)有明顯的變化（圖4a）），而對(duì)于陽(yáng)極氧化鈦表面（P-Ti）和載銀鈦表面（Ag-P-Ti），浸泡2周后均被一層類骨磷灰石均勻覆蓋，二者的表面形態(tài)沒(méi)有明顯的差異（圖4b）），證實(shí)Ti表面經(jīng)改性處理后均具有良好的生物活性，加載Ag 不會(huì)破壞陽(yáng)極氧化后Ti 表面的生物活性。基于文獻(xiàn)，改性Ti 表面的良好生物活性可歸因?yàn)?，?yáng)極氧化在Ti表面引入了親水性較好的P和微結(jié)構(gòu)，良好的親水表面含有豐富的Ti-OH，使表面電荷為負(fù)，有利于鈣、磷離子的先后沉積，最終使得磷灰石在Ti表面成核和生成。SBF浸泡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)和我們之前的工作結(jié)論[11]相一致。

圖4 拋光Ti 樣品和Ag 負(fù)載Ti（Ag-P-Ti）樣品在SBF 中浸泡2 周后的表面形貌Fig.4 Surface morphologies of the polished Ti and Ag-P-Ti after immersion in SBF for 2 weeks

圖5a）顯示了細(xì)胞在不同樣品表面的黏附和增殖情況。與MC3T3-E1細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)所有樣品均能促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而，多孔鈦表面上的細(xì)胞增殖速度明顯高于拋光鈦表面（p＜0.05），且陽(yáng)極氧化Ti表面的細(xì)胞數(shù)量略高于Ag負(fù)載Ti表面的細(xì)胞數(shù)量（盡管統(tǒng)計(jì)差異不顯著）。不同樣品表面上細(xì)胞黏附和增殖的差異與圖3所示的樣品表面親水性很好地吻合，再次證實(shí)親水性的改善有利于細(xì)胞的黏附和增殖。觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，所有樣品表面均有利于細(xì)胞的黏附和鋪展，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異。細(xì)胞呈典型的多角形狀，從細(xì)胞體中可見(jiàn)大量的指狀突起和絲狀偽足（圖5b）～d）），證實(shí)樣品表面均體現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性?？咕鷦〢g的加載未對(duì)細(xì)胞的黏附、鋪展和生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響。據(jù)報(bào)道，過(guò)量的銀會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)功能，引起細(xì)胞毒性，如何在植入材料表面控制適當(dāng)?shù)你y含量一直是研究的難題。在本研究中，加載的Ag顆粒沒(méi)有產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，這可能是由于材料表面的Ag含量和/或Ag的釋放速率較低所致。

圖5 MTT 法表征MC3T3-E1 細(xì)胞在不同Ti 表面的增殖情況及拋光Ti、P-Ti 和Ag-P-Ti 表面上的細(xì)胞形態(tài)Fig.5 MTT assay representing the MC3T3-E1 cell proliferation on different Ti samples,and cell morphologies on the polished Ti,P-Ti and Ag-P-Ti surfaces

圖6 顯示了Ag 的釋放量與浸泡時(shí)間的關(guān)系?？梢?jiàn)第1 天樣品表面釋放的Ag 含量較高，隨時(shí)間延長(zhǎng)，釋放量逐漸降低，到第3天時(shí)，銀的釋放量小于第1 天釋放量的一半。之后隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，Ag 的釋放量減少更多，但2 周后仍能檢測(cè)到Ag 的釋放。有研究者指出，術(shù)后2周是植入物相關(guān)感染的高發(fā)期，因此，本研究中Ag 的釋放周期對(duì)于預(yù)防術(shù)后感染是適合的。此外，在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，Ag 的總釋放量為10-6水平，證實(shí)了Ag 的含量和釋放率較低，不至于產(chǎn)生毒副作用，這也是載Ag 試樣具有良好生物活性（圖4）和細(xì)胞相容性（圖5）的原因。

圖6 Ag 的釋放量隨浸泡時(shí)間的變化（Ag-P-Ti）Fig.6 Ag release rate as a function of immersion time from Ag loaded Ti（Ag-P-Ti）

采用細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)考察不同樣品的抗菌效果，菌落數(shù)圖片如圖7所示?？梢钥闯觯dAg樣品上生長(zhǎng)的菌落數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于拋光Ti表面。而陽(yáng)極氧化Ti表面和拋光Ti表面的菌落數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)24 h培養(yǎng)后，載Ag鈦表面對(duì)大腸桿菌的抑菌率高達(dá)99%以上，表明其具有良好的抗菌性。

圖7 拋光鈦和載Ag 鈦（Ag-P-Ti）表面的菌落數(shù)圖片F(xiàn)ig.7 The number of bacterial colonies grown on polished Ti and Ag loaded Ti（Ag-P-Ti）

對(duì)于Ag 納米顆粒的抗菌機(jī)制已有很多研究，通常認(rèn)為它是通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞直接接觸，釋放Ag 離子，從而破壞細(xì)菌細(xì)胞膜、內(nèi)部蛋白質(zhì)和酶，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。Ag納米顆粒可以固定在細(xì)菌的細(xì)胞壁上，通過(guò)損傷細(xì)胞膜，使得細(xì)菌死亡。銀納米顆粒也可以穿透微生物細(xì)胞內(nèi)部，與蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)菌死亡。Ag納米顆粒和Ag離子均能產(chǎn)生高水平活性氧（ROS），從而抑制細(xì)菌細(xì)胞的呼吸和生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

1）成功在Ti表面制備了載有P和Ag的多孔微結(jié)構(gòu)，Ag顆粒均勻分布在直徑120±30 nm的微孔中。

2）該載P和Ag的多孔微結(jié)構(gòu)具有良好的生物活性和細(xì)胞相容性，其良好的生物學(xué)性能是由于引入的磷和多孔微結(jié)構(gòu)改善了表面親水性。

3）該載P和Ag的多孔微結(jié)構(gòu)中，Ag顆粒含量和釋放率都很低，沒(méi)有檢測(cè)到明顯的細(xì)胞毒性，但對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出良好的抗菌性能，且抗菌性能持續(xù)2周以上。