miRNA-652在血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及可能機(jī)制

譚娟娟，姚慶蘋(píng)，黨琳，嚴(yán)志強(qiáng)

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁中膜的主要細(xì)胞成分，在維持血管結(jié)構(gòu)、血壓平穩(wěn)及調(diào)節(jié)血管張力等方面起重要作用，其收縮、舒張、增殖、遷移及鈣化等改變與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。因此，抑制VSMCs異常增殖可望成為治療心血管疾病的有效途徑。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在VSMCs的表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移及凋亡等方面起重要作用［3］，其是一類小片段的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，由21～25個(gè)核苷酸組成，成熟miRNA可與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，并通過(guò)與靶基因信使RNA 3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'UTR）完全或部分堿基互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后抑制［4］。近年隨著臨床對(duì)miRNA功能的深入研究，其在心血管疾病生理和病理方面的研究日益受到重視［5］。早期研究發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征患者血漿miRNA-652表達(dá)升高［6］。HUANG等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，miRNA-652通過(guò)靶向cyclinD2而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈硬化斑塊形成。然而，miRNA-652對(duì)VSMCs的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要探討了miRNA-652在VSMCs增殖中的作用及可能機(jī)制，以期為miRNA-652防治血管重構(gòu)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，11965084），胎牛血清（Gibco公司，GB-0500A），胰蛋白酶消化液（北京索萊寶科技有限公司，T1300），青/鏈霉素（Gibco公司，15070063），miRNA-652 agomir/antagomir（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，定制），agomir/antagomir NC（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，定制），siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，11058021），Trizol試劑（Invitrogen），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Takara，R500A），All-in-OneTMmiRNA first-strand cDNA synthesis kit（Clontech公司，638315），CCK8細(xì)胞增殖試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，AR1165），熒光顯微鏡（Leica，BX-61），7500型快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystem公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年1月至2020年7月。

1.2.2 VSMCs培養(yǎng)及計(jì)數(shù)方法 大鼠VSMCs的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［8］。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%～95%匯合度時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，用37 ℃水浴溫?zé)岬腜BS洗2～3遍，加入0.125%胰酶消化液，室溫消化1～2 min；在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙開(kāi)始變大、細(xì)胞形態(tài)變圓時(shí)，迅速棄去消化液，加入新鮮培養(yǎng)液并用移液器輕輕吹散細(xì)胞。待細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以1∶3或1∶4比例稀釋傳代。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：取10 μl細(xì)胞液，滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片之間的邊緣處，依靠二者之間的虹吸作用將細(xì)胞懸液吸附到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上；計(jì)數(shù)低倍鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)板上4個(gè)象限中的細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞密度，細(xì)胞密度（個(gè)/ml）=（4個(gè)象限中的細(xì)胞總數(shù)/4）×104。

1.2.3 確定血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）最佳刺激濃度、時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)采用Ang Ⅱ刺激VSMCs以建立體外VSMCs增殖模型。首先，采用不同濃度（0、1、10、100 nmol/L）的Ang Ⅱ刺激VSMCs 24 h后，采用qRT-PCR檢測(cè)miRNA-652表達(dá)情況。確定10 nmol/L AngⅡ?yàn)樽罴汛碳舛?，然后采?0 nmol/L Ang Ⅱ分別刺激VSMCs 0、6、12、24 h，采用qRT-PCR檢測(cè)miRNA-652表達(dá)情況，確定AngⅡ最佳刺激時(shí)間為24 h。

1.2.4 分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞隨機(jī)分為miRNA-652模擬物組、模擬物對(duì)照組、miRNA-652抑制劑組、抑制劑對(duì)照組。按照siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，具體步驟如下：（1）準(zhǔn)備預(yù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞：在轉(zhuǎn)染前24 h，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的VSMCs以每孔2×104個(gè)均勻接種在24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當(dāng)天，待細(xì)胞匯合度達(dá)到30%～50%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染。（2）準(zhǔn)備miRNA oligo轉(zhuǎn)染復(fù)合物：①miRNA-652模擬物組、模擬物對(duì)照組分別在100 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中加入3 μl 20 μmol/L miRNA-652 agomir、3 μl 20 μmol/L agomir NC（終濃度為100 nmol/L），輕微混勻后，室溫孵育5 min；然后取2 μl siRNA-Mate加入到miRNA oligo轉(zhuǎn)染復(fù)合物混合液中，立即用加樣器吹吸10次以上，使其混合均勻，室溫孵育10 min，便于miRNA oligo轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成；②miRNA-652抑制劑組、抑制劑對(duì)照組分別在100 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中加入 6 μl 20 μmol/L miRNA-652 antagomir、6 μl 20 μmol/L antagomir NC（終濃度為200 nmol/L），輕微混勻后，室溫孵育5 min；然后取4 μl siRNA-Mate加入到Opti-MEM轉(zhuǎn)染復(fù)合物混合液中，立即用加樣器吹吸10次以上，使其混合均勻，室溫孵育10 min，便于siRNA-Mate轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成。（3）細(xì)胞換液：在miRNA oligo/siRNA-Mate轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育期間，去除細(xì)胞培養(yǎng)板中原有培養(yǎng)基，然后每孔加入500 μl新鮮的完全培養(yǎng)基。（4）轉(zhuǎn)染細(xì)胞：將上一步孵育好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴添加到對(duì)應(yīng)的分組細(xì)胞中。輕輕地左右晃動(dòng)培養(yǎng)板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物在培養(yǎng)液中混合均勻。轉(zhuǎn)染6 h后改換完全培養(yǎng)基。（5）將轉(zhuǎn)染細(xì)胞放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育24 h/48 h后收集細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，檢測(cè)miRNA-652/NPTN mRNA表達(dá)情況。

1.2.5 采用qRT-PCR檢測(cè)VSMCs中NPTN mRNA相對(duì)表達(dá)量 使用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染后的RNA樣品，按照All-in-OneTMmiRNA first-strand cDNA synthesis kit說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用無(wú)核酸酶水稀釋10倍備用。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：2×SYBR qPCR mix 10 μl，10 μmol/L上游引物0.4 μl，10 μmol/L下游引物 0.4 μl，cDNA 1 μl，雙蒸水20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。qRT-PCR在7500型快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，檢測(cè)各模板Ct值，所有樣品重復(fù)3次，以未加cDNA作為陰性對(duì)照。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 采用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 按照CCK8試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：將細(xì)胞按2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μl，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)將僅加培養(yǎng)基的孔設(shè)置為空白對(duì)照，次日轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入10 μl CCK8，混勻后（避免產(chǎn)生氣泡），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度，以相對(duì)吸光度表示細(xì)胞增殖能力，每組取4孔并計(jì)算其平均值。

1.2.7 生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)miRDB（http：//mirdb.org/）、TargetScan（http：//www.targetscan.org/）、miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）在線進(jìn)行生物信息學(xué)分析。為了驗(yàn)證NPTN是miRNA-652的靶基因，將含有miRNA-652結(jié)合位點(diǎn)的NPTN 3'UTR克隆到報(bào)告基因載體pmirGLO中，構(gòu)建野生型pmirGLO-NPTN 3'UTR-WT和突變型pmirGLO-NPTN 3'UTR-MUT，并分別與寡核苷酸miRNA-652 agomir、miRNA-652 antagomir、agomir NC及antagomir NC共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，采用發(fā)光檢測(cè)儀GloMaxTM 96 Microplate Luminometer測(cè)定熒光素酶活性。按照Promega公司Dual-Luciferase? Reporter Assay System說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并計(jì)算熒光素酶相對(duì)活性，熒光素酶相對(duì)活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.8 采用qRT-PCR檢測(cè)VSMCs中NPTN mRNA相對(duì)表達(dá)量 方法同1.2.5。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確定Ang Ⅱ最佳刺激濃度、時(shí)間 分別采用0、1、10、100 nmol/L Ang Ⅱ刺激VSMCs 24 h后，miRNA-652相對(duì)表達(dá)量分別為（1.009±0.115）、（0.722±0.189）、（0.439±0.060）、（0.456±0.111）。不同濃度Ang Ⅱ刺激VSMCs 24 h后miRNA-652相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.290，P=0.001）。與采用0 nmol/L Ang Ⅱ刺激VSMCs 24 h后相比，采用10、100 nmol/L Ang Ⅱ刺激VSMCs 24 h后miRNA-652相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

采用10 nmol/L Ang Ⅱ分別刺激VSMCs 0、6、12、24h后，miRNA-652相對(duì)表達(dá)量分別為（1.005±0.098）、（0.855±0.023）、（0.640±0.036）、（0.463±0.101）。采用10 nmol/L Ang Ⅱ刺激VSMCs不同時(shí)間后miRNA-652相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.720，P＜0.001）。與刺激0 h相比，刺激6、12、24 h后miRNA-652相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與刺激6 h相比，刺激12、24 h后miRNA-652相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與刺激12 h相比，刺激24 h后miRNA-652相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上，本實(shí)驗(yàn)確定Ang Ⅱ最佳刺激濃度為10 nmol/L，最佳刺激時(shí)間為24 h。

2.2 miRNA-652相對(duì)表達(dá)量和相對(duì)吸光度 轉(zhuǎn)染24 h后，miRNA-652模擬物組miRNA-652相對(duì)表達(dá)量高于模擬物對(duì)照組，相對(duì)吸光度低于模擬物對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)染24 h后，miRNA-652抑制劑組miRNA-652相對(duì)表達(dá)量低于抑制劑對(duì)照組，相對(duì)吸光度高于抑制劑對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 miRNA-652模擬物組和模擬物對(duì)照組VSMCs中miRNA-652相對(duì)表達(dá)量、相對(duì)吸光度比較（±s，n=4）Table 1 Comparison of relative expression of miRNA-652 and relative absorbance in VSMCs between miRNA-652 agomir group and agomir NC group

表1 miRNA-652模擬物組和模擬物對(duì)照組VSMCs中miRNA-652相對(duì)表達(dá)量、相對(duì)吸光度比較（±s，n=4）Table 1 Comparison of relative expression of miRNA-652 and relative absorbance in VSMCs between miRNA-652 agomir group and agomir NC group

組別 miRNA-652相對(duì)表達(dá)量 相對(duì)吸光度模擬物對(duì)照組 1.010±0.161 1.005±0.041 miRNA-652模擬物組 13.678±1.346 0.760±0.111 t值 18.210 3.597 P值 0.003 0.022

表2 miRNA-652抑制劑組和抑制劑對(duì)照組VSMCs中miRNA-652相對(duì)表達(dá)量及相對(duì)吸光度比較（±s，n=4）Table 2 Comparison of relative expression of miRNA-652 and relative absorbance in VSMCs between miRNA-652 antagomir group and antagomir NC group

表2 miRNA-652抑制劑組和抑制劑對(duì)照組VSMCs中miRNA-652相對(duì)表達(dá)量及相對(duì)吸光度比較（±s，n=4）Table 2 Comparison of relative expression of miRNA-652 and relative absorbance in VSMCs between miRNA-652 antagomir group and antagomir NC group

組別 miRNA-652相對(duì)表達(dá)量 相對(duì)吸光度抑制劑對(duì)照組 1.001±0.078 1.000±0.044 miRNA-652抑制劑組 0.623±0.022 1.279±0.097 t值 7.165 4.523 P值 0.018 0.010

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果及熒光素酶相對(duì)活性 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均檢測(cè)到NPTN是miRNA-652的靶基因，見(jiàn)圖1。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，miRNA-652模擬物組pmirGLO-NPTN 3'UTR-WT熒光素酶相對(duì)活性低于模擬物對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.413，P=0.012）。miRNA-652模擬物組和模擬物對(duì)照組pmirGLO-NPTN 3'UTR-MUT熒光素酶相對(duì)活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.041，P=0.969）。miRNA-652抑制物組和抑制物對(duì)照組pmirGLO-NPTN 3'UTR-WT、pmirGLONPTN 3'UTR-MUT熒光素酶相對(duì)活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為0.251、1.259，P值分別為0.814、0.277），見(jiàn)圖2。

圖1 生物信息學(xué)分析結(jié)果Figure 1 Bioinformatics analysis results

圖2 各組NPTN 3'UTR重組質(zhì)粒相對(duì)熒光素酶活性比較的條形圖Figure 2 Bar chart of comparison of relative luciferase activity among NPTN 3'UTR recombinant plasmids in each group

2.4 miRNA-652調(diào)控NPTN mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，miRNA-652模擬物組NPTN mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.551±0.071），低于模擬物對(duì)照組的（1.002±0.067），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.686，P=0.030）；轉(zhuǎn)染48 h后，miRNA-652抑制劑組NPTN mRNA相對(duì)表達(dá)量為（3.339±0.304），高于抑制劑對(duì)照組的（1.000±0.073），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.420，P=0.004）。

3 討論

VSMCs是一種高度特化的細(xì)胞類型，其存在于血管的內(nèi)膜。與其他終末分化的細(xì)胞不同，VSMCs在整個(gè)成年時(shí)期均保持著較高的可塑性。正常生理狀態(tài)下，VSMCs保持沉默，以收縮型為主，增殖、遷移發(fā)生率較低，可表達(dá)收縮表型分子如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重鏈（smooth muscle myosin heavy chain，SM-MHC）、calponin及sm22-α等；在血管受到損傷等病理狀態(tài)下，VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，其增殖、遷移能力增強(qiáng)，可大量合成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），減少收縮蛋白表達(dá)，這種表型的改變會(huì)導(dǎo)致內(nèi)膜增厚和血管硬化，進(jìn)而引發(fā)多種血管疾病的發(fā)生和發(fā)展［1］。miRNAs是一類非常保守的單鏈小RNA分子，其表達(dá)具有明顯的組織和細(xì)胞特異性，在不同疾病階段及組織中表達(dá)水平不同，且可通過(guò)多種靶基因發(fā)揮不同的調(diào)控作用［9］。近年研究揭示，miRNAs在動(dòng)脈粥樣硬化、新生內(nèi)膜增生的VSMCs表型轉(zhuǎn)換、增殖、遷移及凋亡等方面具有重要作用［10-11］。研究表明，miRNA-21在大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜中表達(dá)上調(diào)，其通過(guò)PTEN、PDCD4等靶基因調(diào)節(jié)VSMCs增殖和凋亡［12］。LIU等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-221/222可通過(guò)調(diào)控p27（kip1）和p57（kip2）而影響VSMCs的增殖和遷移。miRNA-143/145在動(dòng)脈壁的VSMCs中選擇性表達(dá)，在正常血管壁中呈高表達(dá)，其對(duì)VSMCs的增殖具有抑制作用［14］。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-26a在血小板源性生長(zhǎng)因子-BB（platelet derivedgrowth factor-BB，PDGF-BB）刺激的VSMCs中表達(dá)明顯下調(diào)，其通過(guò)靶基因MAPK6而調(diào)控VSMCs增殖和遷移，進(jìn)而參與自體靜脈移植術(shù)后新生內(nèi)膜的增生［8］。本研究結(jié)果表明，miRNA-652在AngⅡ刺激的VSMCs中表達(dá)下調(diào)，且呈現(xiàn)一定程度的濃度和時(shí)間依賴性。

人類基因miRNA-652位于X染色體上，在基因TMEM164的一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，可編碼跨膜蛋白164［15］，可參與心血管疾病（包括動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死）的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-652表達(dá)下調(diào)與動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生率增加相關(guān)［16］。近期研究表明，miRNA-652可作為心力衰竭患者發(fā)生急性腎損傷的生物標(biāo)志物，患者血清和尿液中miRNA-652表達(dá)上調(diào)及中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)鈣蛋白增加可預(yù)測(cè)急性腎損傷的發(fā)生［17］。HUANG等［7］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-652可通過(guò)靶向Cyclin D2而抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)斑塊形成。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，miRNA-652模擬物組miRNA-652相對(duì)表達(dá)量高于模擬物對(duì)照組，相對(duì)吸光度低于模擬物對(duì)照組；miRNA-652抑制劑組miRNA-652相對(duì)表達(dá)量低于抑制劑對(duì)照組，相對(duì)吸光度高于抑制劑對(duì)照組。提示過(guò)表達(dá)miRNA-652可抑制VSMCs增殖，而干擾miRNA-652可促進(jìn)VSMCs增殖。

miRNA以完全互補(bǔ)配對(duì)和不完全互補(bǔ)配對(duì)兩種方式與靶基因mRNA結(jié)合，降解靶基因或抑制其翻譯，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。既往研究證實(shí)，miRNA-652的靶基因包括小鼠基因ISL1、KLF9、ZEB1、JAG1及人類基因LLGL1、ENPP1等［18］。本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均檢測(cè)到NPTN是miRNA-652的靶基因，豐富了miRNA-652的靶基因范疇。NPTN屬于細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白超家族成員，由同一基因經(jīng)不同剪切方式形成兩種相對(duì)分子質(zhì)量（65、55 kD），分別被命名為neuroplastin-65（np65）和neuroplastin-55（np55）［19］。本研究主要檢測(cè)了NPTN mRNA在VSMCs中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，miRNA-652模擬物組NPTN mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模擬物對(duì)照組，miRNA-652抑制劑組NPTN mRNA相對(duì)表達(dá)量高于抑制劑對(duì)照組，提示miRNA-652對(duì)NPTN具有負(fù)調(diào)控作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miRNA-652可以抑制VSMCs增殖，而抑制miRNA-652可以促進(jìn)VSMCs增殖；miRNA-652對(duì)NPTN具有負(fù)調(diào)控作用，其可能通過(guò)調(diào)控靶基因NPTN而影響VSMCs增殖。提示miRNA-652可作為抑制VSMCs增殖的潛在靶點(diǎn)，這為防治由VSMCs增殖引起的血管重構(gòu)提供了新的理論依據(jù)。但本研究未進(jìn)一步研究miRNA-652通過(guò)調(diào)控NPTN而影響VSMCs增殖的具體過(guò)程，且未進(jìn)一步確認(rèn)NPTN是np55還是np65，這些均有待進(jìn)一步研究探討。

作者貢獻(xiàn)：譚娟娟、嚴(yán)志強(qiáng)進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；譚娟娟進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，撰寫(xiě)、修訂論文；姚慶蘋(píng)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；姚慶蘋(píng)、黨琳進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；嚴(yán)志強(qiáng)負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

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