絲氨酸/精氨酸蛋白激酶1在放射性肺纖維化中的作用及其機(jī)制研究

張旭濤，張遷，2，王瀚，王斌，2，劉峰舟，2，吳侃，阮柏，張敏，王小成，2

放射性肺纖維化（radiation-induced pulmonary fibrosis，RIPF）是臨床上胸部腫瘤放療后常見的一種嚴(yán)重并發(fā)癥［1］，其特點(diǎn)是肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞持續(xù)活化，過度分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），對肺組織造成不可逆破壞及導(dǎo)致肺功能惡化，最終導(dǎo)致患者呼吸衰竭甚至死亡［2］。研究表明，在RIPF發(fā)生過程中巨噬細(xì)胞發(fā)揮了重要作用，在放射性肺損傷前期即放射性肺炎階段巨噬細(xì)胞以M1型極化為主，而在放射性肺損傷后期即RIPF階段巨噬細(xì)胞以M2型極化為主［3］。M2型巨噬細(xì)胞可分泌轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β），從而刺激成纖維細(xì)胞活化，這是誘發(fā)RIPF的關(guān)鍵因素［4］。本課題組前期構(gòu)建了一種新型抗纖維化多肽Ac-SDDKDP，發(fā)現(xiàn)其能夠通過抑制絲氨酸/精氨酸蛋白激酶1（serine/arginine rich protein specific kinase 1，SRPK1）磷酸化來發(fā)揮抗肝纖維化、特發(fā)性肺纖維化的作用［5］，但SRPK1與組織纖維化之間的關(guān)系尚不明確，SRPK1在RIPF中的作用亦不清楚。因此，本研究以SRPK1為突破口，重點(diǎn)研究SRPK1在RIPF中的作用及其機(jī)制，以期為RIPF的防治提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時間 本實(shí)驗(yàn)時間為2021年3月至2022年2月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 2月齡C57BL/6J雌性小鼠30只，平均體質(zhì)量（20.2±8.1）g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。所有小鼠飼養(yǎng)在空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，且符合空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件，環(huán)境溫度保持26 ℃，濕度為50%，噪聲控制在60 dB以下，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)間的光照強(qiáng)度控制在15～20 LX，明暗交替為12 h/12 h。本研究通過空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料 水合氯醛、4%多聚甲醛購自西安科昊生物工程有限責(zé)任公司，SRPIN340購自上海陶素生物科技有限公司，蘇木素染色液、伊紅染色液、ELISA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，Masson試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，羥脯氨酸試劑盒、CD45、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、SRPK1、α平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）購自英國Abcam公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及干預(yù)方法 將30只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和干預(yù)組，各10只。對照組小鼠不進(jìn)行干預(yù)；模型組和干預(yù)組小鼠均構(gòu)建RIPF模型，具體方法為：采用水合氯醛麻醉小鼠，采用鉛板遮擋小鼠頭部和腹部，僅保留胸部位置，進(jìn)行X射線輻照，照射總劑量為17.5 Gy，劑量率為1.9 Gy/min［6］。建模成功后干預(yù)組小鼠腹腔注射SRPK1抑制劑——SRPIN340，800 μg·kg-1·次-1，3次/周；模型組小鼠給予相同劑量的PBS；兩組均干預(yù)16周，其中模型組小鼠死亡5只，干預(yù)組死亡3只。干預(yù)結(jié)束后，處死各組小鼠并收集其全肺組織及肺泡灌洗液。

1.4.2 HE染色觀察小鼠肺組織結(jié)構(gòu) 取各組小鼠全肺組織，PBS沖洗后采用4%多聚甲醛固定24 h，EDTA脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，并將包埋標(biāo)本切成4 μm的薄片，依次進(jìn)行石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封固操作，采用顯微鏡隨機(jī)選取10個不重疊的視野，放大20倍，觀察肺組織結(jié)構(gòu)。

1.4.3 Masson染色觀察小鼠肺組織ECM沉積情況 取各組小鼠肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，隨后進(jìn)行脫蠟處理；切片依次用蒸餾水和去離子水進(jìn)行沖洗，按照試劑盒說明書進(jìn)行Masson染色：切片常規(guī)脫蠟、至水，核染液染色1 min，沖洗液沖洗30 s；質(zhì)染液染色10 s，沖洗液沖洗30 s；分化液分色8 min；棄去分色液后直接用復(fù)染液染色3 min，采用100%乙醇溶液洗凈浮色，二甲苯透明，中性樹膠封固；采用顯微鏡隨機(jī)選取10個不重疊的視野，放大20倍，觀察肺組織藍(lán)色染色區(qū)域情況即ECM沉積情況。

1.4.4 羥脯氨酸試劑盒檢測小鼠肺組織羥脯氨酸水平稱取各組小鼠肺組織100 mg，置于安瓿瓶，加入2.5 ml純水和2.5 ml濃鹽酸封瓶，置于105 ℃烘箱中水解18 h，采用濾紙過濾獲得肺組織水解液。取10 μl肺組織水解液，加入10 μl內(nèi)標(biāo)溶液（10 mg/L），用72%乙腈水溶液定容至10 ml；取稀釋液1 ml，15 000×g離心10 min，取上清液，采用羥脯氨酸試劑盒檢測羥脯氨酸水平。

1.4.5 ELISA檢測小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平 取各組小鼠肺泡灌洗液，用包被緩沖液稀釋抗原至最適宜濃度（15 μg/ml），在微反應(yīng)板每個凹孔中分別滴加0.3 ml溶液；在每個凹孔中加入用含有0.05%吐溫的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0.2 ml，于37 ℃下作用1.5 h；在每個凹孔中加入稀釋緩沖液稀釋的酶結(jié)合物0.2 ml，于37 ℃下作用1.5 h；在每個凹孔中加入底物溶液0.2 ml，室溫作用30 min；在每個凹孔中加入2 mol/L的H2SO4或2 mol/L的枸櫞酸0.05 ml。用酶標(biāo)比色計測定450 nm處的OD值，即IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平。

1.4.6 免疫熒光法檢測小鼠肺組織CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù) 取各組小鼠肺組織，吸去組織液，用PBS洗2次；加入4%多聚甲醛，固定15 min；用PBS洗3次，5 min/次；加入0.3% TritonX-100破膜15 min；用PBS洗3次，5 min/次；加入5% BSA封閉液室溫封閉30 min；用PBS洗3次，5 min/次；按1∶400的比例用PBS稀釋CD45抗體，于4 ℃孵育過夜；用PBS洗3次，5 min/次；按1∶150的比例用PBS稀釋FITC標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；用PBS洗3次，5 min/次；加入DAPI孵育5 min，進(jìn)行細(xì)胞核染色；用PBS洗3次，5 min/次。用共聚焦顯微鏡拍攝圖像，采用Image J軟件分析CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù)。

1.4.7 免疫組化法檢測小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達(dá)水平 取各組小鼠肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，依次進(jìn)行脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗、加二抗、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封固及顯微鏡鏡檢拍照等操作，采用Image J軟件計算累積光密度，即Arg-1、SRPK1、α-SMA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織結(jié)構(gòu) HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡結(jié)構(gòu)清晰可見；模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的損傷和結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁增厚扭曲，可見大量病灶形成；干預(yù)組小鼠肺組織出現(xiàn)輕微損傷，肺組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，肺泡壁增厚現(xiàn)象減少，見圖1。

圖1 HE染色觀察各組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)（×20）Figure 1 The lung tissue structure of mice in each group observed by HE staining

2.2 肺組織ECM沉積情況 Masson染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肺組織僅見少量ECM沉積；模型組小鼠肺組織中出現(xiàn)大量ECM沉積；與模型組相比，干預(yù)組小鼠肺組織ECM沉積明顯減少，見圖2。

圖2 Masson染色觀察各組小鼠肺組織ECM沉積情況（×20）Figure 2 Deposition of ECM in lung tissue of mice in each group observed by Masson staining

2.3 肺組織羥脯氨酸水平 對照組、模型組、干預(yù)組小鼠肺組織羥脯氨酸水平分別為（512.7±165.2）、（1 765.4±432.1）、（987.0±231.6）μg/mg。三組小鼠肺組織羥脯氨酸水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.920，P＜0.001）；模型組、干預(yù)組小鼠肺組織羥脯氨酸水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為8.696、3.292，P值分別為＜0.001、0.004）；干預(yù)組小鼠肺組織羥脯氨酸水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.403，P＜0.001）。

2.4 肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平 三組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平比較（±s，pg/ml）Table 1 Comparison of the levels of IL-6，IL-8，IL-13 and TGF-β1 in the bronchoalveolar lavage fluid of mice in the three groups

表1 三組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13、TGF-β1水平比較（±s，pg/ml）Table 1 Comparison of the levels of IL-6，IL-8，IL-13 and TGF-β1 in the bronchoalveolar lavage fluid of mice in the three groups

注：TGF-β=轉(zhuǎn)化生長因子β；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) IL-6 IL-8 IL-13 TGF-β1對照組 10 32.4±7.7 73.6±10.0 37.0±7.5 298.0±102.4模型組 5 123.6±9.0a209.8±11.3a164.6±9.1a2 756.2±327.7a干預(yù)組 7 65.5±9.5ab107.9±16.4ab74.0±8.0ab1 543.0±167.6ab F值 189.758 199.892 427.165 288.245 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 肺組織CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù) 對照組、模型組、干預(yù)組小鼠肺組織CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù)分別為（5.84±0.12）、（27.54±7.96）、（13.96±2.64）個/mm3。三組小鼠肺組織CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=50.601，P＜0.001）；模型組、干預(yù)組小鼠肺組織CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為10.048、3.760，P值分別為＜0.001、0.001）；干預(yù)組小鼠肺組織CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.288，P＜0.001），見圖3。

圖3 免疫熒光法檢測各組小鼠肺組織CD45+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)（免疫熒光染色，×20）Figure 3 The number of CD45+ T lymphocytes in lung tissue of mice in each group detected by immunofluorescence

2.6 肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達(dá)水平 三組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1表達(dá)水平高于對照組、低于模型組，α-SMA表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of the expression levels of Arg-1，SRPK1 and α-SMA in the lung tissue of mice in the three groups

表2 三組小鼠肺組織Arg-1、SRPK1、α-SMA表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of the expression levels of Arg-1，SRPK1 and α-SMA in the lung tissue of mice in the three groups

注：Arg-1=精氨酸酶1，SRPK1=絲氨酸/精氨酸蛋白激酶1，α-SMA=α平滑肌肌動蛋白；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) Arg-1 SRPK1 α-SMA對照組 10 6.3±1.9 5.6±0.4 8.3±2.6模型組 5 28.9±8.5a 38.9±3.6a 31.0±14.9a干預(yù)組 7 19.1±6.4ab 12.7±8.6ab 17.4±8.8b F值 30.445 72.629 11.617 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.001

3 討論

RIPF是一種腫瘤放療嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者常危及患者生命，是造成患者預(yù)后差甚至發(fā)生非原發(fā)病死亡的主要原因之一［7］。腫瘤患者放療時輻射可誘發(fā)肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞持續(xù)活化并過度分泌膠原等ECM，造成肺組織發(fā)生不可逆損傷，甚至導(dǎo)致患者死亡。目前RIPF發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚，且沒有明確的治療靶點(diǎn)和臨床治療藥物，因此闡明RIPF的具體發(fā)生機(jī)制，對RIPF的防治具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Ac-SDDKDP能夠通過抑制SRPK1磷酸化來發(fā)揮抗肝纖維化作用［5］，但SRPK1與組織纖維化之間的關(guān)系尚不明確，SRPK1在RIPF中的作用亦不清楚。本研究旨在分析SRPK1在RIPF中的作用及其機(jī)制。

本研究HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的損傷和結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁增厚扭曲，可見大量病灶形成；干預(yù)組小鼠肺組織出現(xiàn)輕微損傷，肺組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，肺泡壁增厚現(xiàn)象減少。Masson染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中出現(xiàn)大量ECM沉積；與模型組相比，干預(yù)組小鼠肺組織ECM沉積明顯減少。提示抑制SRPK1表達(dá)可以減輕RIPF模型小鼠肺組織損傷和纖維化程度。本研究結(jié)果還顯示，模型組、干預(yù)組小鼠肺組織羥脯氨酸水平高于對照組，干預(yù)組小鼠肺組織羥脯氨酸水平低于模型組，提示抑制SRPK1表達(dá)可有效抑制羥脯氨酸表達(dá)，進(jìn)而抑制膠原的過度分泌。纖維化的發(fā)生伴隨著慢性炎癥的長期刺激，IL-6、IL-8、IL-13是主要的引起纖維化的炎性因子［8］，而CD45是炎性細(xì)胞白細(xì)胞的表面標(biāo)志物，且CD45+T淋巴細(xì)胞越多說明炎癥程度越嚴(yán)重［9］。本研究結(jié)果顯示，模型組、干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13水平高于對照組，干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、IL-13水平低于模型組；模型組、干預(yù)組小鼠肺組織CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù)高于對照組，干預(yù)組小鼠肺組織CD45+T淋巴細(xì)胞計數(shù)低于模型組，提示抑制SRPK1表達(dá)可以減輕RIPF模型小鼠的炎性反應(yīng)。上述結(jié)果均提示SRPK1與RIPF的發(fā)生密切相關(guān)，但其相關(guān)調(diào)控機(jī)制并不明確。

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，與RIPF的形成密切相關(guān)［10］。巨噬細(xì)胞經(jīng)不同刺激可分別向M1型和M2型極化［11］，二者在機(jī)體中發(fā)揮不同作用。在內(nèi)毒素刺激下巨噬細(xì)胞可向M1型極化，釋放大量促炎因子而發(fā)揮促炎作用［12］。在IL-6、IL-13等作用下巨噬細(xì)胞可向M2型極化［13］，M2型巨噬細(xì)胞是RIPF發(fā)生過程中重要的效應(yīng)細(xì)胞［14］，其可分泌大量Arg-1、TGF-β1等細(xì)胞因子，其中Arg-1是M2型巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志物，TGF-β1是成纖維細(xì)胞活化的關(guān)鍵因子，是肺纖維化形成的關(guān)鍵因素［15］。因此，抑制肺組織內(nèi)巨噬細(xì)胞向M2型極化，能夠減少Arg-1、TGF-β1的持續(xù)分泌，抑制成纖維細(xì)胞的活化，減少肺組織內(nèi)ECM的沉積。成纖維細(xì)胞激活是造成肺組織纖維化的終端因素，而α-SMA是成纖維細(xì)胞激活的標(biāo)志［10］。本研究結(jié)果顯示，模型組、干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1水平高于對照組，干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中TGF-β1水平低于模型組；模型組小鼠肺組織Arg-1、α-SMA表達(dá)水平高于對照組；干預(yù)組小鼠肺組織Arg-1表達(dá)水平高于對照組、低于模型組，α-SMA表達(dá)水平低于模型組；提示抑制SRPK1表達(dá)可以抑制巨噬細(xì)胞向M2型極化，進(jìn)而緩解RIPF的進(jìn)展。以上研究結(jié)果提示SRPK1通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化激活成纖維細(xì)胞，從而發(fā)揮促纖維化作用，但SRPK1是如何促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化的尚不清楚，這將是下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，SRPK1可促進(jìn)RIPF的發(fā)生發(fā)展，其可能機(jī)制為SRPK1促進(jìn)肺組織內(nèi)巨噬細(xì)胞向M2型極化，激活成纖維細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)肺纖維化。但本研究僅揭示了SRPK1與M2型巨噬細(xì)胞的關(guān)系及其在RIPF中發(fā)揮的作用，并未深入研究SRPK1調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2型極化的具體機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：張旭濤、王小成進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；張旭濤進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，撰寫論文；張遷進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；王瀚進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；王斌進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理；劉峰舟進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；張旭濤、吳侃、阮柏進(jìn)行論文的修訂；張敏、王小成負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；王小成對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。