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    酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖工藝優(yōu)化

    2022-06-29 12:28:20劉媛潔
    中國(guó)釀造 2022年6期
    關(guān)鍵詞:青錢柳孢菌枯草

    劉媛潔,張 良

    (1.江西醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校 臨床醫(yī)學(xué)院,江西 上饒 334099;2.江西省食品發(fā)酵研究所,江西 宜春 336023)

    青錢柳(Cyclocarya paliurus)又名搖錢樹,是中國(guó)特有、國(guó)家二級(jí)保護(hù)的珍惜樹種,廣泛分布于浙江、江西、湖北和湖南等地[1-2]。青錢柳葉中含有黃酮、多糖、三萜、有機(jī)酸類等多種天然功能性活性物質(zhì)[3-4],在降血糖、降血壓、降血脂、抗氧化等方面具有一定的功效[5-7]?;谇噱X柳葉的藥食兼用的價(jià)值,青錢柳葉茶已通過美國(guó)食品藥品管理局的認(rèn)證,青錢柳葉已列入中國(guó)新資源食品原料目錄[8-9]。青錢柳干燥葉片中多糖含量范圍為0.93%~5.36%[10-11],青錢柳多糖是青錢柳葉中主要的活性物質(zhì)之一,也是目前研究較多的青錢柳活性物質(zhì)[12-14]。謝建華等[15]利用熱水浸提法提取青錢柳多糖,其提取率為6.54%。李彥坡等[1]利用超聲波輔助微波提取法提取青錢柳多糖,提取率為10.02%。胡文兵等[16]利用超聲波輔助復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶)法提取青錢柳多糖,其提取率為7.18%。魯青等[17]采用微生物發(fā)酵法(黑曲霉(Aspergillus oryzae)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))同步提取青錢柳多糖,其提取率為7.57%,較優(yōu)化前增加50.50%。

    酶菌協(xié)同發(fā)酵是指原料經(jīng)酶解工藝后,再經(jīng)微生物菌種發(fā)酵的過程[18]。酶解是利用纖維素酶和半纖維素酶的高效專一性破壞分解植物細(xì)胞等組織結(jié)構(gòu),提高目標(biāo)天然活性物質(zhì)的溶出量[19],但不能解決青錢柳特有的苦澀味問題[17]。微生物發(fā)酵是通過菌種生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生各種酶系提高目標(biāo)天然活性物質(zhì)的溶出量[20],此外,益生菌等菌種發(fā)酵不僅會(huì)產(chǎn)生功能性代謝產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì),也可以去除青錢柳的苦澀味[21],但存在發(fā)酵酶系活力和酶量不足的問題。

    本研究以產(chǎn)自江西九江修水縣的青錢柳葉為原料,選用纖維素酶和半纖維素酶對(duì)青錢柳葉進(jìn)行酶解,以高產(chǎn)纖維素酶的粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為發(fā)酵菌種對(duì)其酶解液進(jìn)行發(fā)酵,以青錢柳多糖的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。以期獲得青錢柳多糖含量較高、適口性好的發(fā)酵型青錢柳飲品,為青錢柳葉的精深加工和高值化利用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 原料與菌株

    青錢柳葉:產(chǎn)自江西九江市修水縣;粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis):由江西省食品發(fā)酵研究所菌種保藏中心提供。

    1.1.2 試劑

    半纖維素酶(酶活100 000 U/g)、纖維素酶(酶活20 000 U/g):寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;硫酸、苯酚(均為分析純):天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基:默克化工技術(shù)(上海)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T6紫外可見分光光度計(jì):上海儀電分析儀器有限公司;HH-6恒溫水浴鍋:南通三思機(jī)電有限公司;FA1204電子天平:上海精科天美有限公司;YDJ-200B恒溫?fù)u床:英檢達(dá)儀器(重慶)有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 種子液的制備

    挑取4環(huán)斜面保藏的粗糙脈孢菌接種到裝液量為80 mL/250 mL的PDB培養(yǎng)基中,搖床(30 ℃,140 r/min)培養(yǎng)24 h,制備粗糙脈孢菌種子液;挑取4環(huán)斜面枯草芽孢桿菌接到裝液量為80 mL/250 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,搖床(35 ℃,140 r/min)培養(yǎng)18 h,得到枯草芽孢桿菌種子液。

    1.3.2 青錢柳多糖的制備

    取干燥粉碎后過20目篩的青錢柳葉,設(shè)置裝料量為6.0 g/250 mL,按照料液比6∶100(g∶mL),加入蒸餾水后搖勻。按照青錢柳葉細(xì)粉質(zhì)量的0.6%添加復(fù)合酶(纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比為1∶1),在55 ℃下恒溫水浴酶解3.0 h后,在100 ℃下滅酶活20 min。按照酶解液后原料總質(zhì)量的8%添加蔗糖,經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻,按照酶解液原料總質(zhì)量的4%接種混合菌(粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比為1∶1)種子液,置于恒溫?fù)u床(32℃,140 r/min)培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液在5 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min后,取上清液,檢測(cè)發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量。

    1.3.3 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

    按照1.3.2的工藝條件,固定單因素試驗(yàn)條件為:料液比6∶100(g∶mL)、復(fù)合酶(纖維素酶和半纖維素酶)質(zhì)量比1∶1、復(fù)合酶添加量0.6%、酶解時(shí)間3.0 h、蔗糖添加量8%、混合菌(粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌)質(zhì)量比1∶1、混合菌接種量4%、發(fā)酵時(shí)間48 h。

    以青錢柳多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別考察料液比(2∶100、4∶100、6∶100、8∶100、10∶100、12∶100(g∶mL))、纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、復(fù)合酶添加量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)、酶解時(shí)間(1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h)、蔗糖添加量(4%、6%、8%、10%、12%)、粗糙脈孢菌與枯草芽孢桿菌質(zhì)量比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、混合菌接種量(2%、3%、4%、5%、6%)和發(fā)酵時(shí)間(24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h)對(duì)青錢柳多糖含量的影響。

    1.3.4 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

    (1)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以青錢柳多糖含量為響應(yīng)值,選取8個(gè)影響因素料液比(X1)、復(fù)合酶添加量(X2)、纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比(X3)、酶解時(shí)間(X4)、蔗糖添加量(X5)、混合菌添加量(X6)、混合菌質(zhì)量比(X7)、發(fā)酵時(shí)間(X8),對(duì)8個(gè)因素的最優(yōu)發(fā)酵條件范圍分別取高、低兩個(gè)水平,運(yùn)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選對(duì)發(fā)酵液中青錢柳多糖含量影響顯著的因素。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

    表1 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbe

    (2)Box-Behnken試驗(yàn)

    根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果,以發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量(Y)為響應(yīng)值,選擇對(duì)結(jié)果顯著性影響的因素纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比(A)、蔗糖添加量(B)和混合菌添加量(C)為自變量,進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化,Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平見表2。

    表2 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbe

    1.3.5 青錢柳多糖含量的測(cè)定

    采用苯酚-硫酸法[22]測(cè)定多糖含量。

    1.3.6 數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 料液比對(duì)青錢柳多糖含量的影響

    料液比對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖1。由圖1可知,隨著料液比在2∶100~8∶100(g∶mL)范圍內(nèi)的逐漸增加,發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量呈增加的趨勢(shì);當(dāng)料液比為8∶100(g∶mL)時(shí),發(fā)酵液中青錢柳多糖含量達(dá)到最高值,為2.46 mg/mL;當(dāng)料液比為8∶100~12∶100(g∶mL)時(shí),青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是,料液比太小不利于青錢柳的充分發(fā)酵,而隨著料液比的增加,有利于多糖從組織細(xì)胞內(nèi)溶出到周圍溶液中,但過大的料液比也會(huì)造成有效成分損失,青錢柳葉干燥粉濃度相對(duì)降低進(jìn)而導(dǎo)致青錢柳多糖含量的減少[23]。因此,選擇最適的料液比為8∶100(g∶mL)。

    圖1 料液比對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

    2.1.2 復(fù)合酶添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響

    復(fù)合酶添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖2。由圖2可知,隨著復(fù)合酶添加量在0.2%~0.8%范圍內(nèi)的增加,發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢(shì);當(dāng)復(fù)合酶添加量為0.8%時(shí),發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量達(dá)最大值,為2.43 mg/mL;當(dāng)復(fù)合酶添加量>0.8%之后,青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是,復(fù)合酶添加量低時(shí)酶解不充分,青錢柳多糖和其他活性物質(zhì)等溶出較少,發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)元素不是發(fā)酵菌的最佳生長(zhǎng)條件,導(dǎo)致發(fā)酵液中青錢柳多糖含量較少;隨著復(fù)合酶添加量的增加,酶解效果較好,青錢柳多糖和其他活性物質(zhì)等溶出較高,但發(fā)酵菌生長(zhǎng)較快,多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗也較快,導(dǎo)致發(fā)酵液中青錢柳多糖含量緩慢下降[24]。因此,選擇最適復(fù)合酶(纖維素酶與半纖維素酶)添加量為0.8%。

    圖2 復(fù)合酶添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.2 Effect of compound enzyme addition on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

    2.1.3 復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響

    纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖3。由圖3可知,隨著復(fù)合酶(纖維素酶與半纖維素酶)質(zhì)量比在1∶3、1∶2、1∶1、2∶1的變化,發(fā)酵液中青錢柳多糖含量呈上升趨勢(shì);當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量比為2∶1時(shí),青錢柳多糖含量達(dá)最大值,為2.35 mg/mL;當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量比高于2∶1時(shí),青錢柳多糖含量略有下降。分析原因可能是隨著纖維素酶質(zhì)量占比的增加,酶解出的青錢柳多糖含量等營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)逐漸增加,發(fā)酵菌在較低的纖維素酶質(zhì)量占比時(shí),生長(zhǎng)較慢,水解出的青錢柳多糖較少,但纖維素酶質(zhì)量占比較高時(shí),發(fā)酵菌生長(zhǎng)較快,消耗青錢柳多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較快,青錢柳多糖含量略有降低[25]。因此,選擇最適纖維素酶與半纖維素酶質(zhì)量比為2∶1。

    圖3 纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.3 Effect of cellulase and hemi cellulase mass ratio on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

    2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響

    酶解時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖4。由圖4可知,隨著酶解時(shí)間在1.0~2.5 h范圍內(nèi)的增加,發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì);當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h時(shí),青錢柳多糖含量達(dá)最大值,為2.26 mg/mL。酶解時(shí)間>2.5 h之后,青錢柳多糖含量下降。其原因可能是,青錢柳多糖會(huì)受酶解作用的影響發(fā)生部分水解,導(dǎo)致青錢柳多糖含量降低[26]。因此,選擇最適酶解時(shí)間為2.5 h。

    圖4 酶解時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

    2.1.5 蔗糖添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響

    蔗糖添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖5。由圖5可知,隨著蔗糖添加量在4%~8%范圍內(nèi)的增加,發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量呈先增加的趨勢(shì);當(dāng)蔗糖添加量為8%時(shí),青錢柳多糖含量達(dá)最大值,為2.22 mg/mL;當(dāng)蔗糖添加量>8%之后,青錢柳多糖含量下降。分析原因可能是,作為培養(yǎng)基的蔗糖濃度過高,發(fā)酵菌種細(xì)胞的滲透壓過大,菌體生長(zhǎng)緩慢,導(dǎo)致青錢柳多糖含量降低[27]。因此,選擇最適的蔗糖添加量為8%。

    圖5 蔗糖添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.5 Effect of sucrose addition on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

    2.1.6 混合菌添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響

    混合菌添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖6。由圖6可知,隨著混合菌添加量在2%~4%范圍內(nèi)的增加,發(fā)酵液中青錢柳多糖含量增加;當(dāng)混合菌添加量為4%時(shí),青錢柳多糖含量達(dá)最大值,為2.22 mg/mL;當(dāng)混合菌添加量>4%之后,發(fā)酵液中青錢柳多糖含量下降。分析原因可能是,混合菌添加量過高,會(huì)使培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足發(fā)酵菌種的生長(zhǎng),同時(shí)消耗培養(yǎng)基中的多糖等活性物質(zhì)滿足菌種的生長(zhǎng),導(dǎo)致發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量降低[28]。因此,選擇最適的混合菌(粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌)添加量為4%。

    圖6 混合菌添加量對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.6 Effect of mixed microbes addition on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

    2.1.7 混合菌質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響

    混合菌質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖7。由圖7可知,隨混合菌(粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌)質(zhì)量比在1∶3、1∶2、1∶1、2∶1范圍內(nèi)的變化,發(fā)酵液中青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢(shì);當(dāng)混合菌質(zhì)量比為2∶1時(shí),發(fā)酵液中

    圖7 粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.7 Effect of Neurospora crassa and Bacillus subtilis mass ratio on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

    青錢柳多糖含量達(dá)到最高值(2.36 mg/mL);當(dāng)混合菌質(zhì)量比>2∶1時(shí),發(fā)酵液中青錢柳多糖含量下降。究其原因可能是,粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)過程中,會(huì)分泌大量有利于粗纖維和木質(zhì)素降解的纖維素酶系和其他水解酶,有利于細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)中多糖的釋放到發(fā)酵液中[29]。混合菌質(zhì)量比的不同,菌種自身生長(zhǎng)和代謝所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不一樣,菌種間相互生長(zhǎng)和代謝的制約程度不一樣[30]。因此,選擇最適的混合菌(粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌)質(zhì)量比為2∶1。

    2.1.8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響

    發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響見圖8。由圖8可知,隨著發(fā)酵時(shí)間在24~60 h范圍內(nèi)的延長(zhǎng),青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢(shì);當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí),青錢柳多糖含量達(dá)最大值,為2.56 mg/mL;發(fā)酵時(shí)間>60 h后,發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是,發(fā)酵菌種進(jìn)入生長(zhǎng)的衰老期,分泌的酶量不再增加,同時(shí)發(fā)酵菌產(chǎn)生了能降解青錢柳多糖的酶,使青錢柳多糖含量逐漸減低[31]。因此,選擇最適的發(fā)酵時(shí)間為60 h。

    圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)青錢柳多糖含量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

    2.2 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    (1)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

    在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以青錢柳多糖含量(Y)為響應(yīng)值,選取8個(gè)因素料液比(X1)、復(fù)合酶添加量(X2)、纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比(X3)、酶解時(shí)間(X4)、蔗糖添加量(X5)、混合菌添加量(X6)、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比(X7)、發(fā)酵時(shí)間(X8),按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),在不同發(fā)酵條件下進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果見表3,運(yùn)用Design-Expert 8.0.6對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,結(jié)果見表4。

    表3 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of Plackett-Burman tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbes

    由表4可知,模型的P值為0.015 1,表示該模型顯著(P<0.05);模型的決定系數(shù)R2=0.982 2,調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.934 7,說明存在93.47%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型解釋。從各因素的P值可以看出,纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比(X3)對(duì)發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響極顯著(P<0.01),蔗糖添加量(X5)和混合菌添加量(X6)對(duì)發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響顯著(P<0.05)。因此,選擇纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比、蔗糖添加量和混合菌添加量3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

    表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman tests results

    (2)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

    在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定不顯著影響因素分別為料液比8∶100(g∶mL)、復(fù)合酶添加量0.8%、酶解時(shí)間2.5 h、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比2∶1、發(fā)酵時(shí)間60 h。以青錢柳多糖含量(Y)為響應(yīng)值,以纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比(A)、蔗糖添加量(B)和混合菌添加量(C)3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5,方差分析結(jié)果見表6。

    表5 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken tests for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbes

    表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

    運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,經(jīng)多元回歸擬合,得到模型的二次多項(xiàng)式方程為:

    由表6可知,該模型P<0.000 1,表明建立的模型極顯著(P<0.01);失擬項(xiàng)P值=0.401 2,不顯著(P>0.05),表明建立的模型擬合度較好[32];模型的決定系數(shù)R2為0.988 1,調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.972 9,表明97.29%的響應(yīng)值變化能由該模型進(jìn)行解釋,實(shí)際試驗(yàn)與模型建立的方程擬合度較好,能用于分析和預(yù)測(cè)發(fā)酵液中青錢柳多糖的工藝優(yōu)化。由P值可知,一次項(xiàng)A、C,交互項(xiàng)AB、BC,二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響極顯著(P<0.01),其他因素均不顯著(P>0.05)。模型的F值越大對(duì)青錢柳多糖含量的影響越大[33]。由F值可知,各因素對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵青錢柳多糖含量的影響程度為:C(混合菌添加量)>A(纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比)>B(蔗糖添加量)。

    各因素交互作用對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖影響的響應(yīng)面及等高線見圖9。

    圖9 各因素間交互作用對(duì)酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the contents of polysaccharide from Cyclocarya paliurus

    自變量因素對(duì)響應(yīng)值的影響與響應(yīng)面坡度陡峭程度呈正相關(guān)[34];等高線呈橢圓形的程度與兩個(gè)自變量交互作用的程度呈正相關(guān)[35]。由圖9可知,AB和BC的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響較大,隨著各因素?cái)?shù)值的增大,青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì),響應(yīng)面呈凸型陡峭曲面,對(duì)應(yīng)的等高線呈橢圓形,表明AB和BC的交互作用顯著(P<0.05),青錢柳多糖含量存在極大值;而AC有交互作用,但不顯著(P>0.05),這與方差分析結(jié)果一致。

    2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

    根據(jù)模型的回歸方程分析,獲得最佳的酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖工藝條件為:纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比1.8∶1.0、蔗糖添加量8.33%、混合菌添加量4.91%。在此最佳條件下,青錢柳多糖含量理論值可達(dá)3.35 mg/mL??紤]具體試驗(yàn)的可操作性,修正最佳工藝條件為:復(fù)合酶添加量0.8%、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.0%。在此優(yōu)化條件下,青錢柳多糖含量的實(shí)際值為3.34 mg/mL,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.30%,說明該模型準(zhǔn)確度良好。

    3 結(jié)論

    以發(fā)酵液中青錢柳多糖含量為響應(yīng)值,采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)青錢柳多糖的工藝條件。最終確定最佳工藝條件為:料液比8∶100(mg∶mL)、復(fù)合酶添加量0.8%、纖維素酶和半纖維素酶質(zhì)量比1.8∶1.0、酶解時(shí)間2.5 h、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.0%、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質(zhì)量比2∶1、發(fā)酵時(shí)間60 h。在此優(yōu)化條件下,發(fā)酵液中青錢柳多糖含量為3.34 mg/L。該方法結(jié)合了酶解法和微生物發(fā)酵法,酶菌協(xié)同發(fā)酵克服了單一酶解時(shí)青錢柳有苦澀味問題和單一微生物發(fā)酵酶系不足等問題,顯著提高了青錢柳多糖的含量,可為青錢柳精深加工提供物質(zhì)基礎(chǔ),為青錢柳的高效利用開創(chuàng)了新的途徑,對(duì)制備適口性強(qiáng)和高含量青錢柳多糖的產(chǎn)品有一定的產(chǎn)業(yè)化意義。

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